Saéc Kyù Lôùp Moûng

(Thin Layer Chromatography)

PGS.TS. Nguyeãn Ñöùc Tuaán

Boä moân Hoùa Phaân Tích – Kieåm Nghieäm
Khoa Döôïc – Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Saéc Kyù Lôùp Moûng (SKLM)

Muïc tieâu: Trình baøy ñöôïc

 Cô cheá chính trong SKLM
 Pha tónh vaø pha ñoäng trong SKLM
 Trang thieát bò duøng trong SKLM
 Caùc böôùc tieán haønh trong SKLM
 ÖÙng duïng cuûa SKLM trong ngaønh Döôïc

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Saéc Kyù Lôùp Moûng (SKLM)

Daøn baøi
 Giôùi thieäu - Ñònh nghóa
 Caùc cô cheá taùch trong SKLM
 Pha tónh
 Pha ñoäng
 Trang thieát bò
 Caùc böôùc tieán haønh khi thöïc hieän SKLM
 Phaùt hieän caùc veát treân baûn moûng
 Vaøi thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM
 ÖÙng duïng cuûa SKLM
 Ñaùnh giaù SKLM

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Giôùi thieäu – Ñònh nghóa
 1938: Izmailov & Schraiber duøng boät oxyd nhoâm ñeå phaân
tích dòch chieát alcaloid thöïc vaät
 Cô cheá: haáp phuï chieám phaàn lôùn
 Pha tónh: tröông nôû theo caû chieàu doïc vaø chieàu ngang
 Ñònh nghóa: SKLM laø moät phöông phaùp saéc kyù duøng chaát
haáp phuï laøm pha tónh traûi thaønh lôùp moûng treân taám kính, nhöïa
hay kim loaïi. Quaù trình taùch caùc hôïp chaát xaûy ra khi cho pha
ñoäng laø dung moâi di chuyeån qua pha tónh. Do ñoù SKLM
thuoäc saéc kyù loûng - raén.
 SKLM coù theå duøng ñeå tìm caùc ñieàu kieän toái öu cho söï taùch
baèng saéc kyù loûng treân coät.

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha tónh
 Silicagel (Kieselgel – gel cuûa acid silicic)
 Söû duïng roäng raûi nhaát
 Kích thöôùc haït 10 ‟ 60 m, dieän tích beà maët 200 ‟ 400 m2/g
 Hoaït tính haáp phuï do ‟OH treân beà maët quyeát ñònh
 Haøm aåm taêng seõ laøm giaûm hoaït ñoä
 Hoaït hoùa 120oC/1 giôø tröôùc khi söû duïng

HO OH HO OH HO OH
Si Si Si

O O

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha tónh

 Nhoâm oxyd
 Oxyd nhoâm trung tính, acid, base
 Hoaït tính tuøy thuoäc löôïng nöôùc
 Hoaït hoùa 120oC/1 giôø tröôùc khi söû duïng
 Theo Brockman: 5 baäc oxyd nhoâm

Baäc hoaït tính I II III IV V

% nöôùc 0 3 6 10 15

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha tónh

 Xaùc ñònh baäc hoaït tính cuûa nhoâm oxyd: döïa vaøo Rf cuûa maøu chuaån

„Baäc hoaït tính cuûa oxyd nhoâm theo Brockman

„Chaát maøu „II „III „IV „V
„Giaù trò Rf
„Aminoazobenzen „0,59 „0,74 „0,85 „0,95
„Sudan ñoû „0,00 „0,10 „0,33 „0,56
„Sudan vaøng „0,01 „0,25 „0,57 „0,78

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha tónh
 Kieselguhr
 Boät nheï, vaøng xaùm chöùa 70 ‟ 95% SiO2
 Chaát haáp phuï yeáu
 Taùch caùc chaát phaân cöïc: cetoacid, lacton,…
 Chaát mang pha tónh trong saéc kyù phaân boá
 Kieselguhr ‟ silicagel hay kieselguhr ‟ thaïch cao (1:1)
 Thaïch cao
 Cellulose: khoâng caàn chaát keát dính, taùch caùc chaát thaân nöôùc
 Polyamid: taùch caùc phenol
 Nhöïa trao ñoåi ion: silicagel sulfon hoùa

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha tónh
 Chaát haáp phuï ñaõ ñöôïc tieâu chuaån hoùa
 Chaát haáp phuï coù chaát keát dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr
G, oxyd nhoâm G troän saún 5% thaïch cao
 Chaát haáp phuï khoâng keát dính: silicagel H, oxyd nhoâm H
 Chaát haáp phuï coù theâm chaát chæ thò huyønh quang: silicagel GF254,
silicagel HF254,…
 Baûn saéc kyù traùng saún vôùi giaù ñôû: thuûy tinh, giaáy nhoâm, polymer
 Öu ñieåm baûn moûng traùng saún
 Ñoä oån ñònh cô hoïc cao, thao taùc ñôn giaûn vaø deã daøng hôn
 Tính ñoàng nhaát cao: thích hôïp ñeå baùn ñònh löôïng, ñònh löôïng
 Hieäu löïc taùch cao hôn baûn moûng traùng thuû coâng

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Trang thieát bò – Pha tónh
Tính chaát Caùc chaát ñöôïc
Pha tónh Ñoä acid Hoaït tính Taùc duïng duøng ñeå phaân taùch
phaân chia
Silicagel Acid Coù hoaït tính Haáp phuï Haàu heát taát caû
Daãn chaát siloxan Phaân boá Caùc chaát ít phaân cöïc
Oxyd nhoâm Base Coù hoaït tính Haáp phuï Hydrocarbon, alcaloid, chaát maøu thöïc
phaåm, lipid
Caùt bieån Phaân boá Ñöôøng, acid beùo
Kieselguhr Trung tính Khoâng coù hoaït tính Phaân boá Ñöôøng, caùc triglycerid, caùc acid beùo
baäc cao
Magie diphosphat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol
Magie trisilicat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol
Calci hydroxid Base Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol
Calci phosphat Base yeáu Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol
Calci sulfat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol, caùc acid beùo
glycerid kî nöôùc
Silicagel + oxyd nhoâm (1:1) Acid + base Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát maøu, caùc acid barbituric
Saét hydroxid Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát phaân cöïc
Than Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát khoâng phaân cöïc
Cellulose Thöïc teá Khoâng coù hoaït tính Phaân boá Acid amin, carbohydrat, nucleotid
trung tính
Polyamid Trung tính Khoâng coù hoaït tính (Trao ñoåi ?) Caùc flavon
Polyacrylonitril Trung tính Khoâng coù hoaït tính (Trao ñoåi, phaân boá ?) Caùc antoxyan
Nhöïa trao ñoåi ion Acid + base Khoâng coù hoaït tính Trao ñoåi Acid nucleic, nucleotid, ion kim loaïi,
halogenic
Gel sephadex Raây phaân töû Polymer, protein, phöùc kim loaïi

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha ñoäng
 Thay ñoåi tuøy theo cô cheá taùch
 Taêng cöôøng söùc röûa giaûi: thöôøng keát hôïp 2 dung moâi
 Khoâng coù qui taéc cuï theå ñeå löïa choïn dung moâi
 Saéc kyù sô boä ñeå thaêm doø heä dung moâi
 Neân choïn heä dung moâi ñôn giaûn vaø duøng loaïi tinh khieát
 Höôùng daãn löïa choïn pha tónh vaø pha ñoäng:
 Tính chaát cuûa maãu phaân tích: ñoä hoøa tan, ñoä phaân cöïc, soá löôïng vaø ñaëc tính
caùc nhoùm chöùc
 Cô cheá saéc kyù cuûa pha tónh
 Dung moâi: ñoä bay hôi, ñoä nhôùt, ñoä tinh khieát, söï phaân lôùp
 Chaát phaân tích ion hay phaân cöïc: dung moâi phaân cöïc nhö butanol ‟ nöôùc,
theâm acid acetic hoaëc amoniac
 Pha tónh silicagel hoaëc caùc chaát haáp phuï phaân cöïc khaùc: ñoä phaân cöïc pha
ñoäng quyeát ñònh toác ñoä di chuyeån vaø Rf
 Ñieàu chænh söùc röûa giaûi cuûa pha ñoäng ñeå Rf: 0,2 ‟ 0,8 ñaït ñoä phaân giaûi cöïc trò

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Pha ñoäng

 Moät soá nhoùm chöùc coù khaû naêng haáp phuï taêng daàn:

CH=CH < OCH3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH2 < OH < COOH
 Dung moâi vôùi söùc röûa giaûi (söùc dung moâi) taêng daàn:

Dung moâi 0 Dung moâi 0 Dung moâi 0

Ether daàu hoûa 0,01 Ether etylic 0,38 Acetonitril 0,65
Hexan 0,01 Cloroform 0,40 Pyridin 0,71
Heptan 0,01 Methylen clorid 0,42 Dimethyl sulfoxid 0,76
Cyclohexan 0,04 Dicloroetan 0,49 Isopropanol 0,82
Carbon tetraclorid 0,18 Aceton 0,56 Ethanol 0,88
Ether isopropylic 0,28 Dioxan 0,56 Methanol 0,95
Toluen 0,29 Butanol 0,56 Nöôùc 1,00
Benzen 0,32 Ethyl acetat 0,58

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Trang thieát bò – Baûn moûng

 Baûn moûng dính chaéc: chaát haáp phuï ñöôïc troän

theâm 5 ‟ 15% chaát keát dính (thaïch cao, tinh boät,
dextrin)
 Baûn moûng khoâng dính chaéc

5 x 20 10 x 20 20 x 20 (cm)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Trang thieát bò – Bình saéc kyù
 Bình ñaùy troøn, vuoâng hoaëc chöõ nhaät

Caùc loaïi bình saéc kyù

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Caùc böôùc tieán haønh khi thöïc hieän SKLMù
 Chuaån bò baûn moûng, bình saéc kyù thích hôïp, pha ñoäng
F
 Chaám dung dòch leân baûn moûng: 1-10g
X
 Khai trieån saéc kyù
A
 Phaùt hieän caùc veát treân baûn moûng
 Maøu saéc töï nhieân cuûa veát
 Phun thuoác thöû hieän maøu O x x x

 Soi döôùi ñeøn UV 254 hoaëc 365 nm: theâm chaát

phaùt huyønh quang khoâng tan vaøo pha tónh
 Duøng maùy ño maät ñoä quang (densitometer): ño Maãu

cöôøng ñoä tia phaûn xaï töø beà maët baûn moûng khi soi
döôùi ñeøn UV. Chaát phaân tích haáp thuï böùc xaï ñöôïc
ghi laïi thaønh pic saéc kyù Trieån khai saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Thuoác thöû hieän maøu
Thuoác thöû Maøu cuûa veát ÖÙng duïng phaân tích
Thuoác thöû chung
Acid phosphomolypdic Xanh toái Nhieàu chaát höõu cô
Acid sulfuric ñaëc Naâu ‟ ñen Taát caû caùc chaát höõu cô
Hôi iod Naâu Nhieàu chaát höõu cô
Thuoác thöû choïn loïc
Ninhydrin Hoàng ‟ tím Acid amin, caùc nhoùm chöùc amin
2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, ñoû Caùc hôïp chaát carbonyl
Xanh hoaëc luïc Vaøng Caùc acid höõu cô
bromocresol
2,7 fluorescein Vaøng ‟ luïc Nhieàu chaát höõu cô
Vanilin/acid sulfuric Xanh ‟ luïc ‟ hoàng Alcol, ceton
Rhodamin B Huyønh quang ñoû Caùc chaát lipid
Anisaldehyd/SbCl3 Nhieàu maøu Caùc chaát steroid
Diphenylamin/Zn2+ Nhieàu maøu Caùc chaát baûo veä thöïc vaät

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ Rf (Retardation factor)

dR V Ñöôøng
Rf   ===> 0  Rf  1
d M V0 dung
moâi
- Rf = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån,
naèm taïi ñieåm xuaát phaùt
- Rf = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dM
dung moâi
- dR: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch
dR
- dM: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi
- v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch
x x
- V0: vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi 1 2

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ Rf (Retardation factor)

- Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán Rf

 Chaát löôïng vaø hoaït tính cuûa chaát haáp phuï
 Chieàu daøy cuûa lôùp moûng, quaûng ñöôøng saéc kyù,
löôïng chaát chaám
 Vò trí vaø soá löôïng chaát caàn taùch treân baûn moûng
 Thaønh phaàn vaø ñoä tinh khieát cuûa pha ñoäng
 Phöông phaùp khai trieån saéc kyù
 Ñoä baõo hoøa cuûa dung moâi trong bình saéc kyù
(hieän töôïng “bôø”)
 Aûnh höôûng cuûa caùc caáu töû khaùc coù trong thaønh Hieän töôïng “bôø”
phaàn hoãn hôïp caàn taùch
 Ñoä aåm, nhieät ñoä vaø pH...

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ Rf (Retardation factor)

- Söû duïng chaát ñoái chieáu

OX F
R f ( X ) OF OX
Rs ( X )    X
R f ( A) OA OA
A
OF
* Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù Rf vaø
Rs baèng nhau. O x x x

* Hai chaát phaûi coù cuøng löôïng chaám nhö nhau

Saéc kyù ñoà saéc
vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù
kyù ñoái chöùng

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

 Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM

dM  dR 1 R f
Hệ số dung lượng k'  Ñöôøng
dR Rf
dung
2 moâi
 dR 
Số đĩa lý thuyết biểu kiến N  16 
W  WB
dB
dM
2[d B  d A ] dA
Độ phân giải Rs 
WA  WB dR W
WA

x x
1 2

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM
 Saéc kyù moät chieàu
 Saéc kyù hai chieàu
 Maãu phaân tích nhieàu chaát
 Saéc kyù moät chieàu khoâng ñuû ñoä tin caäy

Kyõ thuaät saéc kyù hai chieàu

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM
Dung moâi B
Dung moâi A
Saéc kyù ñoà SKLM hai chieàu cuûa moät vaøi acid amin.
Dung moâi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine.
Dung moâi B: Chloroform/benzyl alcohol/acid
acetic.
1. acid aspartic, 2. acid glutamic, 3. serine, 4. -
alanine, 5. glycine, 6. alanine, 7. methionine, 8.
valine, 9. isoleucine, 10. cysteine.
Nguyeãn Ñöùc Tuaán
Ñöôøng dung moâi Ñöôøng chaám maãu
Saéc kyù ñoà caùc daãn chaát xanthin treân baûn
moûng pha ñaõo C-18.
Pha ñoäng: metanol/K2HPO4 0,1 M (55:45
tt/tt). Phaùt hieän: hôi iod. Thôøi gian khai
trieån: 1 giôø. Caùc giaù trò Rf: theobromin 0,68;
theophylin 0,56; cafein: 0,44; 3-isobutyl-
metyl xanthin 0,21.
Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM
Saéc kyù cheá hoùa
 Taùch caùc chaát vôùi löôïng nhoû trong tröôøng hôïp khoâng theå taùch baèng caùc
phöông phaùp khaùc

Dung moâi Dung moâi

Kyõ thuaät saéc
kyù cheá hoùa CHP CHP
(ñaùnh daáu vaø chöùa A chöùa B
caïo rieâng töøng
vuøng)

phaûn haáp phuï

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa SKLM
 Ñònh tính vaø thöû tinh khieát
 Döïa vaøo Rf
 Saéc kyù so saùnh chaát thöû X vôùi chaát ñoái chieáu A treân cuøng moät saéc ñoà
 Ñieàu kieän X laø A: Rf(X) = Rf(A) vôùi caùc heä dung moâi khaùc nhau
 Chaát thöû ñöôïc coi laø tinh khieát khi treân saéc kyù ñoà khoâng coù veát laï
 Baùn ñònh löôïng – ñònh löôïng
 Taùch chieát chaát phaân tích trong veát saéc kyù baèng dung moâi thích hôïp, laøm saïch
dòch chieát, ñònh löôïng baèng kyõ thuaät thích hôïp: ít duøng, toán thôøi gian
 Ñònh löôïng tröïc tieáp treân baûn moûng: ño dieän tích hay cöôøng ñoä maøu veát saéc
kyù
 Duøng maùy ño maät ñoä quang (Densitometer): chieáu chuøm tia vaøo veát saéc
kyù vaø ño cöôøng ñoä haáp thuï hoaëc huyønh quang
 Xöû lyù aûnh vôùi camera kyõ thuaät soá ñoä phaân giaûi cao: queùt baûn moûng vôùi
heä thoáng phaân tích thu nhaän hình aûnh cuûa veát saéc kyù. Xöû lyù döõ lieäu aûnh baèng
maùy tính

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

 Söû duïng baûn moûng traùng saün coù beà daøy 0,1 mm

 Pha tónh silica vaø pha lieân keát siloxan 5 m

 Taêng ñoä tin caäy cuûa keát quaû phaân tích

 Taêng ñoä phaân giaûi vaø ñoä nhaïy:

 Veát saéc kyù nhoû hôn

 Thôøi gian saéc kyù ngaén hôn

 Löôïng dung moâi duøng ít hôn

 Sai soá cuûa phöông phaùp: 5 ‟ 10% chuû yeáu do ñöa maãu leân baûn
moûng

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Ñaùnh giaù SKLM: Öu ñieåm
 Phöông phaùp ñôn giaûn: thöû tinh khieát, xaùc ñònh giôùi haïn taïp chaát, phaùt hieän caùc
chaát laï, ñònh tính, baùn ñònh löôïng vaø ñònh löôïng
 Söû duïng phoå bieán ñeå nghieân cöùu, saøng loïc
 Kyõ thuaät vaø thieát bò ñôn giaûn
 Söû duïng linh hoaït: deã thay ñoåi chaát haáp phuï, dung moâi khai trieån cuõng nhö thuoác
thöû phaùt hieän, keå caû caùc loaïi thuoác thöû aên moøn maø saéc kyù giaáy khoâng duøng ñöôïc
 Thôøi gian tieán haønh nhanh (15 - 30 phuùt, toái ña vaøi giôø) vaø ñoä nhaïy cao hôn saéc
kyù giaáy
 Laø moät phöông phaùp vi phaân tích
 Coù theå duøng ñeå tìm caùc ñieàu kieän toái öu cho söï taùch baèng saéc kyù loûng treân coät
 Phaïm vi öùng duïng roäng raõi: kieåm tra hieäu quaû chieát taùch cuûa caùc phöông phaùp
khaùc nhö saéc kyù coät, chieát xuaát, chöng caát, taùi keát tinh,…
 Phaùt hieän taát caû caùc chaát keå caû caùc chaát khoâng di chuyeån theo pha ñoäng
 Thöïc hieän taùch deã daøng caùc maãu coù nhieàu thaønh phaàn
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñaùnh giaù SKLM: Nhöôïc ñieåm

 Trò soá Rf coù ñoä laëp laïi thaáp do thaønh phaàn pha ñoäng thay
ñoåi trong quaù trình khai trieån saéc kyù

 Taêng giaõn roäng vết do khueách taùn vì toác ñoä doøng pha
ñoäng thaáp

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM