Vežba br.

12 - Spektrofotometrija – biuretska metoda 1

BIURETSKA METODA
ZA ODREĐIVANJE RASTVORLJIVIH PROTEINA

Biuretska proba za kvalitativno dokazivanje proteina u rastvoru se može naći u svakom

udžbeniku biohemije, a već više decenija se koristi i kao kvantitativna spektrofotometrijska metoda.
Ona se zasniva na već opisanom svojstvu bakarnog jona (Cu2+) da s donorima elektronskih parova,
kao ligandima, obrazuje kompleksna jedinjenja intenzivno plave boje. U vežbi 10 je prikazano kako
bakarni jon reaguje sa amonijakom i piridinom – jedinjenjima u kojima je atom azota donor
elektronskih parova. To svojstvo takođe leži u osnovi reakcije biureta s bakarnim jonom (slika 1, levo),
a na njemu se zasniva i metoda za kvantitativno određivanje proteina u rastvoru jer se amino-azot iz
peptidne veze (-CO-NH-) proteina koordinativno vezuje za jon bakra (slika 1, desno) baš kao i
amonijak. Dakle, koncentracija stvorenog kompleksa, pa i intenzitet njegove boje u rastvoru,
proporcionalni su broju peptidnih veza, tj. količini proteina.

O R1 H O
C C N C
N C C
O H H O H O R2
NH2 +
C O Cu2 C N N C
NH H N Cu N H Cu2+
+
C O Na C N N C
NH2 O R3 H O
NaO H H ONa
C C N C
N C C
H O R4

Slika 1. Reakcija Cu2+ s biuretom (levo) i koordinativno vezivanje

jona Cu2+ za dva susedna peptidna niza (desno).

Što se tiče pouzdanosti određivanja, biuretska metoda ne može da zameni klasičnu metodu
određivanja proteina spaljivanjem uzorka po Kjeldahlu (Vežba 7), ali može veoma korisno da posluži
za različite specijalizovane rutinske analize, kao što je npr. određivanje proteina u krvnom serumu, a u
oblasti namirnica animalnog porekla i za praćenje rastvorljivosti proteina u različitim fazama
tehnološke obrade, npr. pri soljenju i zrenju mesa, odnosno pri zrenju sireva. U svim tim slučajevima je
apsolutna količina proteina u rastvoru od manjeg značaja nego njena promena tokom vremena ili
posle različitih faza obrade.

Biuretska reakcija se u načelu izvodi tako što se biuretski reagens (vodeni rastvor Na,K-
tartarata, bakar-sulfata i natrijum-hidroksida) pomeša u određenom odnosu s rastvorom uzorka i
smeša ostavi barem 30 minuta da se ljubičasta boja potpuno razvije, a zatim spektrofotometrijski meri
njena apsorbansa pri talasnoj dužini 520–560 nm, obično pri 540 nm. Iz dobijene apsorbanse se tada,
na osnovu prethodno utvrđene standardne prave, očitava procenat proteina u rastvoru.
Eksperimentalno je utvrđeno da vrsta proteina malo utiče na rezultat biuretske reakcije, pa se za
konstruisanje standardne prave može upotrebiti svaki protein koji se kao preparat može dobiti u
čistom obliku. Najčešće se za to koristi tzv. frakcija V goveđeg serum-albumina (engl. bovine serum
albumine, BSA), ali se za istu svrhu mogu upotrebiti i druge čiste proteinske frakcije, npr. alfa-kazein.

Sastav biuretskog reagensa i odnos u kome se on meša s rastvorom uzorka široko variraju od
autora do autora, kao i u zavisnosti od prirode ispitivanog proteinskog rastvora. Sam biuretski reagens
ima ograničen rok trajanja (vremenom se zamućuje), pa je čest slučaj da se odvojeno prave i čuvaju
vodeni rastvori K,Na-tartarata, bakar-sulfata i natrijum-hidroksida, i mešaju u određenom odnosu tek
neposredno pre upotrebe. Apsorbansa ljubičastog kompleksa se meri prema slepoj probi uzorka –
SPU (umesto biuretskog reagensa se sa uzorkom meša ista zapremina destilovane vode) jer i sam
 Vežba br. 12 - Spektrofotometrija – biuretska metoda 2

uzorak može da nespecifično apsorbuje svetlost pri istoj talasnoj dužini. Neki autori od rezutujuće
apsorbanse odbijaju i slepu probu biuretskog reagensa – SPBR (biuretski reagens u smeši s vodom
umesto s rastvorom uzorka) jer i biuretski reagens u izvesnoj meri apsorbuje svetlost, a opet drugi
autori koriste kombinovanu slepu probu – KSP koja predstavlja smešu biuretskog reagensa u kome je
rastvor bakar-sulfata (prekursor boje) zamenjen istom količinom destilovane vode, i uzorka. Svrha svih
navedenih modifikacija je da se dobije linearna standardna prava koja prolazi kroz koordinatni
početak, dakle stroga proporcionalnost između koncentracije proteina u rastvoru i njegove
apsorbanse, što su različiti autori postizali s više ili manje uspeha.

Postupak određivanja

Osnovni rastvori za pripremu biuretskog reagensa

a. Kalijum-natrijum-tartarat sa četiri molekula kristalne vode – 12 g/l

b. Bakar-sulfat s pet molekula kristalne vode – 15 g/l
c. Natrijum-hidroksid, 2,5n – 100 g/l

Biuretski reagens (BR): pre upotrebe se mešaju (tim redom): 5 zapremina rastvora a, 1
zapremina rastvora b, 3 zapremine rastvora c i 1 zapremina destilovane vode.

Biuretski reagens bez bakra (BR-Cu): pre upotrebe se mešaju (tim redom): 5 zapremina
rastvora a, 1 zapremina destilovane vode, 3 zapremine rastvora c i 1 zapremina destilovane vode.

Biuretski reagens (s bakrom i bez njega) se sa uzorkom meša u odnosu 4:1 (na primer, 4 ml
BR + 1 ml rastvora uzorka).

Slepa proba biuretskog reagensa (SPBR): 4 ml BR + 1 ml destilovane vode.

Slepa proba uzorka (SPU): 4 ml destilovane vode + 1 ml rastvora uzorka
Kombinovana slepa proba (KSP): 4 ml BR-Cu + 1 ml rastvora uzorka.

Posle mešanja s biuretskim reagensom rastvori se ostavljaju 60 minuta pri sobnoj temperaturi
da se u potpunosti razvije boja, a zatim im se meri apsorbansa.

Na slici 2 je prikazan bruto apsorpcioni spektar rastvora BSA u fiziološkom rastvoru (ca. 1%),
uporedo sa apsorpcionim spektrima slepih proba (SPBR i SPU) i neto apsorpcionim spektrom BSA,
sve mereno prema fiziološkom rastvoru. Neto apsorbanse su dobijane odbijanjem apsorbansi slepih
proba od bruto apsorbansi pri istim talasnim dužinama.

1% BSA u fizioloskom rastvoru

1,4
Slepa proba biuretskog reagensa
1,2 Slepa proba uzorka
Bruto uzorak
1 Neto uzorak
Apsorbansa

0,8

0,6

0,4

0,2

0
350 400 450 500 550 600 650 700
Talasna duzina (nm)

Slika 2. Apsorpcioni spektar biuretskog kompleksa obrazovanog u 1% rastvoru BSA.

Vidljivo je da se maksimum apsorpcije nalazi u području između 520 i 600 nm.
 Vežba br. 12 - Spektrofotometrija – biuretska metoda 3

Uočava se sličnost ovog spektra sa apsorpcionim spektrom bakar-sulfata (Vežba 10), s tim
što je ovde apsorpcija više pomerena ka kraćim talasnim dužinama zbog prirode liganada – peptidnih
veza. Zapaža se takođe da u mernom području (520–600 nm) apsorbanse slepe probe uzorka i slepe
probe biuretskog reagensa nisu zanemarljive, ali da im značaj opada u smeru manjih talasnih dužina.

Standardne prave

Od navedenog 1% rastvora BSA u fiziološkom rastvoru (FR) se naprave odgovarajuća

razređenja, rastvori se obrade biuretskim reagensom, a zatim im se izmeri apsorbansa. Rezultati
prikazani na slici 3 (bruto apsorbanse) odgovaraju takvom jednom eksperimentu.

Standadne prave
0,3
540 nm R2 = 0,9914
560 nm R2 = 0,9954
0,25
580 nm R2 = 0,9965
Apsorbansa prema FR

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Koncentracija BSA (%)

Slika 3. Standardne prave dobijene za rastvore BSA koncentracije manje od 1%. Zapaža se striktno
važenje Lambert-Beerovog zakona, o čemu svedoče i visoki koeficijenti determinacije (>0,99).

Ljubičasti kompleks se gradi između bakarnog jona i peptidnih veza. Kada se za proteine veže
sav bakar iz rastvora, boja se dalje ne pojačava (slika 4).

Odredjivanje granicne koncentracije

0,45
540 nm
Aps orbans a pre m a FR

0,4
0,35 560 nm
0,3
580 nm
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 0,5 1 1,5 2
% BSA u rastvoru

Slika 4. Kada se primeni odnos mešanja biuretskog reagensa i uzorka 4:1, dovoljan je 1% proteina da
veže sav bakar. Daljim povećanjem koncentracije se boja ne pojačava – standardna kriva se
završava horizontalnim platoom.
 Vežba br. 12 - Spektrofotometrija – biuretska metoda 4

Već je navedeno da se za konstruisanje standardne prave može upotrebiti bilo koji čist protein
jer priroda proteina malo utiče na ishod biuretske reakcije. Na slici 5 su zbirno prikazani podaci za
rastvore BSA i alfa-kazeina. Uočljivo je da se podaci međusobno dobro slažu.

Apsorpcija kazeina i BSA pri 560 nm

0,25
Kazein
BSA
Apsorbansa 0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
% kazeina ili % BSA

Slika 5. Uporedo merene apsorbanse standardnih rastvora alfa-kazeina i BSA. Apsorbanse očito ne
zavise od vrste proteina, već samo od njihove koncentracije.

Vežba:

1. Napraviti osnovne rastvore za pripremu biuretskog reagensa i sastaviti biuretski reagens.

2. Tokom 30 minuta ekstrahovati uzorak od 5 g mlevenog junećeg mesa u 100 ml fiziološkog
rastvora i ekstrakt proteina procediti kroz filtar-papir.
3. Uključiti spektrofotometar.
4. Pomešati biuretski reagens i uzorak u odnosu 4:1 i posle 60 minuta izmeriti apsorbansu pri
talasnoj dužini 560 nm, u odnosu na fiziološki rastvor.
5. Izračunati % proteina u rastvoru koristeći jednačinu standardne prave:

A = 0,2354 x (% proteina).

6. Izračunati % rastvorljivih proteina u uzorku mesa (pomoć: sva masa proteina u 100 ml
fiziološkog rastvora je potekla od 5 g mesa).