Specidlni fermentaéni procesy Vyroba fenylacetylkarbinolu a efedrinu - méné znéma oblast pouziti kvasinek v primyslu RNDr. IRI NETRVAL, Ing, MILAN VODRANSK®, Vfzkumng stav antiblotik biotransformact, Roztoky u Praby 1. Ovop Fonylacotyikarbinol [D-(—}fonylacstylmetanol, dale FAK] Jo vfchoz! surovinou pro vfrobu L-(—)-ofedrinu. Elodrin, klerg patti mezi alkaloldy, je dGlezitou sloZkou riznjch farmacoutickich propardti. Svjm Gfinkom so Fad{ mozt tv. sympathomimetica; zojména vyvolévé 2¥9- Son{ Kkrovatho (aku a pisobf 62 oa dfehac! contcum, V pitrodd so ofedrin vyskytuje mj. vo wyS8ieh rostlingch z rodu Epliodra; jedné se zpravidia o rostliny kefovitého vardstu, s0 kterfimi se setkavame predevsin teplei8ich oblastech, Hzolace efedrinu 2 nékterfch druht téchto rostlin pfedstavuje neljednodussi zpUsob zisként veto dtky. V abltorfch zomfch, kde se rostliny 2 rodu Ephed- ra ¥ dostaletném mno%sivi vyskytujt v prleode, mi, 11 SSSR, so efodrin ziskéva timto zptsobem ve znatném rossahu. ‘Byly 162 vypracovany rhzné zplsoby syntetické vyroby efedring; 2iskave so vEake pf nich efedvin ra comicks, Ktory Je nutno dBlit na optické izomery, nebot pouze levototiva forma Je fermakologicky akfivnt. Ve 90. letech tohoto stolett byl v Nemecku a v USA objeven nov postup véroby etedrinu, pH kterém vaniks primo levototivé forma. Tento postup je zalozon na z2i8t6n! Neuberga a jeho spoluprecovniki (Neuberg a Liebermann, 1921; Neuberg a Hirsch, 1922; Neuberg a Onde, 1922), #6 po pNadnf bonzaldehyau k butkam ive sinek v plitomnosti fermentovatelngeh cule veniki FAK, cod je litka, 2 ni lzo J pombnd snadno vyrobit love totivou formu ofedrina. Presnf mochanismus vzniias FAK zUstéval dosti dlouho nojasnf: pfedpoklédala so east 2vlaStatho enaymu, ,karboligazy", DalS{ podstalng po- rok anamenala tepive prace Hante a Kakdte (1956). ‘Tio autoM prokézali, 4e kyselina pyrohroznové, vanika- Jick phi fermentaci cukrd, je dekarboxylovéna dokarboxy- izou kyseliny pyrobreznové na yaktivn{ acetaldehyd" (acetaldehya vazang na thiamindifostat), 2 nOho® vaniké FAK reakel s extern’ dodanfm bonzaldehydem. Celf proces Je mozno velmi zlednodugené znazorait takto: Teton —MEMAY _. checacaon shin aetaideny" Gets oH meget Optimalizact podminck pro produkel FAK se zabyvala Tada autord. BefvdFovd of al. (1968) studovall vilv benz aldehydu, pRidévaného samostatne nebo ¥ kombinact132 Varoba fonytacetytkarbinoly a ofedrinu KVASN® PROMYSL rob. 24/198 — Aislo 6 ‘5 acotaléehydem, na produkei FAK u Saccharomyces ¢o- revlsiae. Zystilt, 20 ptidavek acotaldehydu mé na pro Gukei FAK poritivni vilv. Groger et al. (1966) dosahovall nha pods, obsamujfet tHinovou melasu a minerdint soli, produles FAK § mg/ml; pfidavek plvovarské. sladiny fomounil avjient produce na & mg/ml. Voets et a. (1973) s0 mj, zabgvail vlivem aorace na produkel FAK u Saecha: romyees corentsiae. Zistili, 20 Jo treba dodrZovat uréitou optimaint intensitu aerace: v kulturéen vzdusntngeh prt 15 intonzivné nebo naopak vaboc nevzdusnényeh jo pro dokco FAK snizona. Proben produkeo FAK by! znacno ondling v opanych Kulturdch a vo fermentorech. Uve dont autori dosahovali produkco FAK kolem 5 mg/m. Gupte et at. (3979) 2}istovalt proaukel FAK u nékolika Grund kvasinek; Jako nojlopst producent byl uréen Je don 2 kment, Saccharomyces cerevisiae. U whoto kmene pak 2y18fovall vilv vellKostl inokula, pk s Koncentrace noktergeh organlekych létek na produket FAK. Dosato: vall produkce FAK rovnéz Kolem 5 mg/ml. 2, OBECNE PRINCIPY VYROBNIHO POSTUPU Postup pM vprobé FAK a efedrinu D9v4 tento: Ve fer. mentagnim tanku se pripravt suspenze kvasnic ve voas. Pouttvait se tekuté odpadnt kvasnice ze spilky. Optimal nf Je powaitt tsovangeh kvasnic. (2 tekutgch kvasnie, ‘kter6 jsou pM novhodném skladovant 2a vy88ich teplot Gastetne Iyzovang, ge do fermentované phdy zandéojt Dalasint latky 2 lyzovangch bundk 1 ze zbytk@ piva. Tyto thy pale ptechdzelf 1 do organického rozpoubtédla a ‘salut vft@2ek FAK ph extraket 2e¥Senou tvorbou emul 21 a rovnt# sniont v9t8%ku efedrinu tim, 22 zpOsobuit travu atalyzdtoru.) Do susponzo kvasnic se postupn’ vndSojt davky benz aldehyds, sacharézy a acctaldehydu, kterg slow jako akcoptor’ vodtku, tak dlouho, dokud nonf onzymovy fystém kvasinck’ inibovén bonzaldehydem, vedlojétml produkty vanikajfcim ph biotransformaci 1 samotajm FAK. FAK, kerf je ve vodS norozpustng, jo v pd ptftomon ve form® jemné vmulze. Po odsepirovant kvasnle so fextrahuje do organickéhe rozpoustédla nomisilolného 5 vodou. Organické faz0 so ve vakuu zahustf asl na 20 % plvodaiho objemu. Zahuitiny ruztok so podrobl reduk tival aminaci za pHtomaosti methylaminu @ speciéintho Xatalyzdtoru na béal platiny pH nfakém aku vodtku, Fax cqnisenoncoc, atoning yeeuancH nHeHs)Ch o odsoparovant katalyzétoru so venikié béze ofodrinu provede na hydrochlorid efedrinu roapustay ve vod®, Yodnd faze oo vakuovd zahustl a podrobt krystaliza Krystaly L-ofodrinu slouif potom Jako substance pro pHipravu rfzmfch 16k6, 5. STRUCNY PREHLED NEKTERYCH NOVECH POZNATKO ‘0 PRODUKCI FAK Zabyvalt jsme se moznostmi dalfiho 2dokonalent uve densho postup. 3.1 Vilv kyseliny pyrohroauoeé V prent etapa préce jsme vychazeli x pfedstavy, za lotent na nakterfch lterarnich dajich, podle které Dlavntn limitujlctm faktorem, urcujicim rychlost wvorby S eolkové mnozstvt vytvoteného FAK, je sktivite zminé rného enzyinu dekarboxylézy kyseliny pyrobrozmové. Vy pracovall [sme tedy metodu stanovent aktivity tohoto fenzymu v bulkéch kvasinek. Zjistii jsme, Ze aktivita ekarboxylézy kyseliny pyrobroznové, steiné jako pro ukci FAK, je motno ovlivalt pidavky kukuriéného ex- feaktu nebo keasnigného hydrolyzétu. V_laboratornieh formentorach o objemu 1 1 jsme pak 2a poutitt oapaa. nich piwovarskyeh kvasnic z)iStovalt zavislost mort akt vitou dekarboxylazy kyscliny pyrobroznové a produkel FAK. Uvedena ptedstava o aloze dekarboxylany leyseliny Pyrohroznové v8ak nebyla potvrzena. Naopak, nejvySst rychlost tvorby 1 nolyyssi calkoxé mnozstvt vytvatenéha FAK bylo z)isteno w hunek, které vykazovaly nejniaa akiivity wvedendho enzymu, vytvotil jsme tedy jinow hypotézu, podie kieré mnor- ivi vytvoreného FAK zévisi pfedovsim na intraceluléent oncentraci kyseliny pyrohrognove. Tuto predstavu jsme se pokusill experimentdine ovértt. Ve dvau laboratornien Termentorecn © objemu 1 1 djl nejprve po aobu 6 proveden rozkvas. Bylo pouzito play 0 slozont: 0,36 % 1MgSOx.7 H,O, 0,19 % (NH]2 $0, 0.06 % KH,PO,, 0,05 % NHH,PO,, 2% kukuriéneno extrait a 19 kvasnicneno hydrolyzatu; pH bylo upravgno na 6.0. ¥_prabenu roz ‘kvasu bylo postupnt pfidano colkem 15% sacharday. Phaa obeahovala 23% vIBk6 vahy bunBk. Pak pyle ¥ obou fermontorech provédéna biotransformaco analo gickym zpDsobem, Jako pFi vgrobnim postupu; do. Jed ‘oho 2 fermentorh byla vSak soutssnd pridavana kysoll hha pyrohroznové v celkovém mnodstvt 8.5%. Jak uka zuje tad, 2, za pritomnostt Kysoliay pyrohroznové bylo skutetnt dosazeno wy88! produkce FAK. Tento vgsiedek sloe nelze poklddat 21 nesporny alkaz. sprévnost! zm néné hypotézy, nepochybné visk pedstavuje argument felt prospésc. Taputka 1. Viv pridavk kysetiny pyrohroenoué na pro uke FAK w Saccharomyces carisbergensis 0.5 a 755 h biotransjormace BEE] Hrooaccemak | _mioautro Pa wey g | moantneian | pest tagta is ap 72 8% oe 88 Tabulka 2, Produkce FAK u rdsngen kmend koasinek po 30 min Dioiransformace Produkce FAR {mami} [© [animes] oxo7| a Potet kmend ‘evasinek 32 Biotransformace 22 powzitt steriIné propagovonfch ‘evasinek. P2I dosud uvedenyen pokusoch bylo pouzivano edpad: nich plvovarskjcn Kvasnlc. Pouzivant odpadnicn pivover skye kvasnic, | kdy2 s2 2d byt ekonomicky vpnodné, ind Wak také Yeden negattvnt rys, projevujiet se Jake pr vfrobG, tak 1 pt experimentélnt précis témét_nevyhnu telnd venikalt znatné vokyey v produket FAK v 2avis lost na kvalt® pouitgeh kvasnic. Ta bjva bohwtel vet ‘mi prombnliva a Ut so jak podie pivovaru, 20 kierého Kvasnico pochézo}i, tsk I podlo rota doby (nopriznivy wily vysokgeh teplot v lotnim obdot#). Snaha 0 zlepSent Feprodukovatelnostt produkee FAK modifikact podminek roxkvasu nebyla pHs tepting, Froto jeme st-pokusll vypracovat postup, pi kterém by se pracovalo s kvasin- emi, Kultivovaninl 2a steriinich nebo. semisterinich podminek na nagem pracovis, 1ejprve jsme vypracovali postup sterlInt kultivace ky sinek lkmene Saccharomyces. carisbergensis ,.udvar’ ¥ baikéch 0 objemu 500 ml, Bafky byly plneny 250 ml Phdy, Kter@ obsahovela minerdint soli ve stejnfch kon-KVASN® PROMYSE rot, 29/1982 — Cts10 6 Vijroba Jenylacetytearbinotu @ efedrina ... 133 centracten, Jako pda popeand v pledchout kapitole, 3% ‘sacharozy 5 % Kukunléneno extraktu (pH upravono ma 60}. Naackované Daniky byly Kuluvovdny pM 20°C na rotaenim tfepacim stroji po dobu 24 h; pak byla kultura pteodkovana (1% Inokula) co 2 gonerace, vo kterd kultivace pokragovala dalsich 24 h za tfeh! podminok. Pak byla ¥ batkéch provadéna blotransformace benzal daehyan; jejt praneh ukezuse abr. 1 — FAK oa benzalcenya ° Zk &, tr. 1, Blotransjormace benzaldehyeu na FAK kulturow Saccharomyces carlsbergensis,Budoar” 33 Produkee FAK u riznjeh drubit keasinek PAL poutitt metodiky, popsané v pfodchozim odstavet, jsme se pokusilt zjstit, 2da ntkteré druny kvasinek ne- vwykezujt wySSt produke! FAK ne Saccharomyces carls- Dergonsis. Nejprve jsme u 39 testovangch kment zjiSto- vali produket FAK ve 30. min pa zahdjenf biotransfor- mace, Ukézalo se, Ze v produkel FAK existuje u keasinek Vatiabilita anaéné siokeho rozsahu, Pro prehlednost Dyly kmeny arbitrasné rardéleny do 4 kstegorif: 1. pro: Gukce nulovd, Ml nfzké (0,01—0,4 mg/ml), 111 strednt {0A1—0.7 mg/ml) 2 IV. vysoké (vice ne? 0,7 mg/ml FAK) ~via tab. 2. Nent ber zajimavosti, 2e vetSina testovangch Jkmend spadé do 1. nebo IV. kategorie, tj. vykazaje bud nulogou, nebo relativné vysokon produkei FAK, zatimco Jkmend § nizkou a stfedni produke! je pomérné malo. Kmeny.s relativné vysokou produkes FAK néletely do rod Saccharomyces, Candida a Hansenula. U kmend, iktaré ve 30. min vykazovaly relativné vysokou produkt FAK, se nynt provadi cela biotranstormace. U 4 kment, naledejicich do todd Saccharomyces, Candida a Hansen: I, bylo dosafeno produkce FAK, blBict se produket uu ‘Saccharomyces carlsbergensis; snaha 0 nalezent kme- ne s wy$8i produket pokraguje, Literatura 1) BEQVAROVA HL. ANE 0. MAGEK K: Folia muerebiaf® a mS, [21 Green 0, ScmMAUDER 1. P,, HOMHES XK: 2 Alle. arab (ay Hate 0. RAKAD Be matorwtes ©, 256 2 8 [s} Neonene ¢, Rinses 1: Biochem. 2 M8, act, 2 282 [o) MEDBERG ©. LIEBERMANN Lt Bloekom. 231, mh, a. ma I) NBUBERG ©, OF Hs Bloshem. 2.39% 18829, 327 (6) Yorss oy vaxavowe Jy ViRKIC © 2 alg. sinzobio etytkarbinot 2 efedrinu — méné mama oblast pouziti kyasinek v pri- isla. Kvas. prm, 28, 1902, © 6, 5. 131134 Fenylncetylkarbinol (PAK) je vfchor\ surovinou pro vjrobu efedrinu, ktery je slofkou rlznyeh farmaceutic- ‘kjch proparati. PH wyrobb PAK so pouzivé odpadntch plvovarskjch kvasnle. Do susponze kvasnie so postupné ‘vadtojt davky benzaldehydu, sacharGzy a acetaldehydu, lor} slouif jako akvoptor ‘vodtku, tek dlouho, dokud se uozastavt biotransformace inbbiet enaymového systé- mu. Vylvofeny FAK eo extrehufe do organickeho rox poustsdla; po Joho zehustint so provadt reduktivat ami- hace 2a pHlomnosti mothylaminu speciélntho kataly- 2toru na bézt platiny pf nizkém tlaku vodtleu, timz vanlké ofedrin. Byly provadBay experimenty s ‘cflem ‘adokonalit uvedeng postup. Zjstlo se, 2e kyselina pyro- heoznova mé stimulant Vilv na produkel PAK. Byl vy- pracovan postup produkce FAK kvasinkaml, kultivova nnémt 2a stertinfch podminok. Byla testovana produkee FAK u $6 kmond rGzngch druhd kvasinek; u 4 kmend bylo dosszeno produkce, biel se produkel u druhu Saccharomyces carlsbergensis, kter) se zatim jevl jako nejlepSt producent FAK. Herpsan, H., Boamaucxn, Mz Mpowssoxcrso dennaaue- ankap6mona Mw offeapMa — weHee neBecrHaR OBaacTE ipuneviema apoxoxel » npowumaennoers. Kase. npy¥ 28, 1989, Ho. 6, exp, 131134, SemuraueriasepGuvoa (AK) saawerew HexonMUN es een suis upowsponersa siexpuia,. apanomeroen Kos Honearoh pasmax apwauestuveexiix apenapatos. Tip aporsponerse PAK’ npnwexsores orpadoraixe muno ‘apie apoxsa, Bo novece apoxcxel| oereneao nuoestea Joo Gexaaazerwta, caxaposu Mt allevamae ia, Xoopuiit cayar axitenropow wox0pOxa 20. MO- "Fa, NOKS He npexpauiaetes Guorpaueopwaiin MAT Guponamew auaxMHoR cucreans. Ospazonasmniea DAK okcrpeTupyeres ® opramnmecxuit pacrsopureat; nocae ero cryulesiia nposoaurea PexYsTuaHOe auutexponame w mpi- eyrerunt Nenuaasctua M elemuamnoro Karaxarops Ha ape A2THULE pH KOKO aaQIeiM sOROpORa, mpave somukacr sGexpu, Tipososianes sseuepiotenr © xem yopepuseucrsosainia npuseseworo upouecca, Buao yera- Nonreno, ro mupoamiorpaanan ywenora oxaawsaer crH- syaupyiouice nausune na npoaysumo AK, Bua paapa Goratt exo00s npoaykum AK upx nowoum apex, Kyabrmpupopamnrx p erepuassiix yexouuax. Bago po: neteno Henuvanne mpoayaum OAK sax 39 wrawvoo Dastine si203 posed; © werupesen ura CHAO ocrmriyt0 pOAYSuM, | nNpHéawkarowekex — npoxysuu © mpaveieunen pact Saccharomyces eartsborgensis, swagioueles oxa ayaa npoayuenrom Genuzaueraa- sepsuuoaa, \Notrval, J. - Vodiansk9, M-: Production of Phenalacety eerbinol and Ephedrine — Less Known Region of Yeast Uiilization in Industry. Kvas. prdm. 28, 1952, No. 6, p. 131-134 Phenylacetylcarbinol (PAC) 1s a base materiel for ‘ephodrine production. Bphadrine is a consiituent of many pharmacoutical preparations. For the PAC. production ‘easte brewer's youst are used, The yeast suspension is supplied stopwiso uy benzaldehyde, sucroso and facclaidenyide where the last compound serves as hydrogen acceptor, as long as the blotransfermation is stopped due to the inhibition of the enzymo systom. PAG formed 1s then extracted into te organic solvent.134 KVASNE PROMYSL rot. 2a/1982 — Bislo 6 After its thickening the reduction In presence of methy famine and a special catalyst on a base of platinum under low hydrogen pressure is performed. Tho alm of oxp% iments made was to improve the described procedure. Mt was found that pyruvic acid has a slimulative effect fon the PAC production. The procedure of the PAC pro- duction by yeast under sterile conditions was elaborated, ‘The PAC production was tested with 30 strains of various species of yeasis. With 4 yeast streins the production of PAC achieved was almost as high as that achieved ‘with the strain Saccharomyces carlbergensis which hes ‘boen considered as the best producer up to now. Notrval, J. - Vodilansk§, M.: Die Herstellung von Fenyl- ‘acetylkarbinol und Efendrin — ein weniger bekanntos Gebiet der industriellen Hefenanwendung. Kvas, pri. 28, 1982, No.6, 8. 131134 Das Fenylacatylkarbinol (PAK) Ist der Ausgengsroh- ‘tof! fOr dio Produktion des Efedrins, des Bestendteils verschiedonor pharmazeutischer Praparate, Bel der FAK- Produktion wird aie Abfallhete aus Brauerelen ausge- fndtzt, In dle Hefesuspension werden Benzaldehya, Sac- charose und Acotaldehya, das al Wasserstotfakzeptor dient, dosiert, und zwar so lange, bis aie Biotransforma- Hon durch die Inpibition des Enzymsystems zum Ab- schla8 gebracht wird. Das entstandene FAK wird in ein organisches Lésungsmittel extrablert; nach seiner Ein- dickung wird die reduktive Animation bel Anwesenhett von Methylamin und elnes spezialen Ketalysators aut Platinbasis bei niedrigem Wassorstoffdruck durchge- fant, wodurch das Efedrin entstent. Es wurden Versuche Gurehgefahirt mit dem Ziel, das erwannto Verfahren za verbessern. Es wurde fesigestelt, daB dio Bronztrau- Densaure einen stimulierenden Eintius aut die FAK Produktion aufweist. Die Autoren haben ein Verfahren nur FAK-Produktion mit Hefen, die unter sterilen Be- ingungen kultiviert wurden, ‘susgearbeltet. Die FAK Produktion wurde bei 39 Hefestammen verschledener He- fearten getestet; mit 4 Stimmen wurde ein Produktions- lergebnis erreicht, das der Produktion der Saccharomyees carlsbergensis — der bisher besten PAK-Produzenten — sehr nahe kommt,