746840.anamarija Perkovic Diplomski Rad

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET
DIPLOMSKI RAD
Zagreb, prosinac 2011. ANAMARIJA PERKOVIĆ
90/BPI
Selekcija autohtonih bakterija
mliječne kiseline za pripravu
probiotičkih starter kultura
Ovaj rad je izrađen u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter
kultura Zavoda za biokemijsko inženjerstvo Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu, pod mentorstvom dr. sc. Blaženke Kos, izv. prof.
Zahvaljujem se mentorici dr. sc. Blaženki Kos, izv. prof. na pruženoj prilici izrađivanja
diplomskog rada te stručnom vodstvu.
Također se zahvaljujem, dr. sc. Jagodi Šušković, red. prof. na susretljivosti prilikom izrade
i pisanja mog rada.
Posebno se zahvaljujem Kseniji Habjanič, dipl. ing. na pomoći tijekom izvođenja
eksperimentalnog dijela i pisanja ovog rada.
Veliko hvala dr. sc. Slobodanu Grbi (pok.), red. prof. na dragocijenim savjetima tijekom
studiranja.
Veliko hvala roditeljima na ljubavi i podršci koju su mi pružali tijekom studija,također
veliko hvala Goranu i svim mojim prijateljima na podršci.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Diplomski rad
Sveučilište u Zagrebu
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Zavod za biokemijsko inženjerstvo
Laboratorij za tehnologiju antibiotika,
enzima, probiotika i starter kultura
Znanstveno područje: Biotehničke znanosti
Znanstveno polje: Biotehnologija
Selekcija autohtonih baterija mliječne kiseline za pripravu probiotičkih starter kultura

Anamarija Perković 90/BPI
Sažetak: Autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline (BMK) identificirani su sekvencioniranjem

16S rRNA gena te su provedena istraživanja u okviru probiotičkog koncepta s ciljem in vitro odabira
potencijalnih probiotičkih kultura. Kako bi se isključila mogućnost širenja antibiotičke rezistencije,
ispitivana je osjetljivost autohtonih izolata BMK na različite skupine antibiotika. Autohtoni izolati
BMK su pokazali osjetljivost na svih 12 ispitanih antibiotika, a jedino su predstavnici Lactobacillus
vrsta bili rezistentni na vankomicin, zbog urođene rezistencije na taj antibiotik. Kako je glavni zahtjev
pri izboru probiotičkih sojeva njihovo preživljavanje u gastrointestinalnom traktu (GIT), ispitano je
preživljavanje autohtonih izolata BMK u simuliranim uvjetima GIT. Osobito visok stupanj
preživljavanja pri pH vrijednosti simuliranog želučanog soka 2 i u simulaciji soka tankog crijeva,
pokazali su bakterijski sojevi: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3 , BGLE1-6,
BGAL1-1 i ZG5-9. Za postizanje probiotičkog učinka potrebno je u organizam unijeti visok broj živih
probiotičkih bakterija u koncentriranom, praškastom pripravku koji se može dobiti liofilizacijom.
Stoga je u ovom radu ispitano preživljavanje autohtonih izolata BMK, odabranih na temelju in vitro
testa simuliranih gastrointestinalnih uvjeta, tijekom liofilizacije, uz dodatak različitih lioprotektora.
Autohtoni izolati BMK preživljavaju proces liofilizacije u većem broju kad su prisutni lioprotektori
obrano mlijeko, inulin i oligosaharidi. Lactococcus lactis subsp. lactis BGLE1-6 najbolje preživljava u
prisutnosti inulina, Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 uz dodatak
prebiotika oligosaharida, dok Lactococcus lactis BGAL1-1 i Lactobacillus pentosus ZG3-17 najbolje
preživljavaju proces liofilizacije u obranom mlijeku. Liofilizacija odabranih sojeva BMK s različitim
lioprotektorima, doprinosi povećanju broja živih bakterijskih stanica u probiotičkim pripravcima što
doprinosi iskazivanju njihovog probiotičkog učinka kad se primjene kao bioterapeutici.
Ključne riječi: autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline, inulin, liofilizacija, obrano mlijeko,
oligosaharidi, probiotici, probiotičke starter kulture
Rad sadrži: 56 stranica, 13 slika, 13 tablica, 62 literaturnih navoda
Jezik izvornika: hrvatski
Rad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u : Knjižnica Prehrambeno-
biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb
Mentor: Dr. sc. Blaženka Kos, izv. prof.
Pomoć pri izradi: Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof.
Ksenija Habjanič, dipl.ing
Stručno povjerenstvo za ocjenu i obranu:
1. Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof.
2. Dr. sc. Blaženka Kos, izv. prof.
3. Dr. sc. Tonči Rezić, doc.
4. Dr. sc. Jadranka Frece, doc. (zamjena)
Datum obrane: 16. prosinac, 2011.

BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Graduate Thesis
Faculty of Food Technology and Biotechnology
Department of Biochemical Engineering
Laboratory for Antibiotic, Enzyme, Probiotic
And Starter Cultures Technology
Scientific areea: Biotechnical sciencis
Scientific field: Biotechnology
Selection of autochthonous lactic acid bacteria for preparation of probiotic starter cultures
Anamarija Perković 90/BPI
Summary:
Research was conducted in probiotic concept with the main goal of in vitro selection of the
potential probiotic cultures. Autochthonous lactic acid bacteria (LAB) isolates were identified by
sequencing of 16S rRNA genes. Sensitivity of LAB isolates was tested to various groups of
antibiotics to exclude the possibility of the spread of antibiotic resistance. LAB isolates showed
sensitivity to all tested antibiotics, with exception of Lactobacillus species which were resistant to
vankomycin due to their intrinsic resistance. The survival of LAB isolates in simulated
gastrointestinal tract (GIT) was examined since it is the main requirement in the selection of probiotic
strains. High rate of survival in simulated gastric juice at pH 2.0 and simulated small intestine juice
was exhibited by the following bacterial strains: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54,
BGGO5-3, BGLE1-6, BGAL1-1 and ZG5-9. To achieve the probiotic effect, it is necessary to ingest
high numbers of live probiotic bacteria in concentrated, powdered form. LAB can be obtained in such
form by lyophilization. LAB isolates (selected on the basis of in vitro test) was tested for survivability
during lyophilization. LAB isolates survived the process of lyophilization in higher numbers with
lyoprotectants such as skimmed milk, inulin and oligosaharides. Lactococcus lactis subsp. lactis
BGLE1-6 survives in highest numbers with inulin present in the system, Lactobacillus
pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 survives in highest numbers with oligosaharides as
lyoprotectonts while Lactococcus lactis BGAL1-1 and Lactobacillus pentosus ZG3-17 survives the
process of lyophilization in highest numbers with skimmed milk. Lyophilization of selected LAB
strains with different lyoprotectants contributes to increase in number of live bacterial cells in
probiotic formulations thus contributing to the demonstration of the probiotic effect when used as
biotherapeutics.
Key words: native lactic acid bacteria isolates, inulin, lyophilization, skimmed milk,
oligosaharides, probiotics, probiotic starter cultures
Thesis conatians: 56 pages, 13 figures, 13 tables, 62 references
Original in: Croatian
Graduate Thesis is printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the
Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb
Mentor: PhD Blaženka Kos, Associated professor
Technical support and assistance: PhD Jagoda Šušković, Full professor
Ksenija Habjanič, BSc
Reviewers: 1. PhD Jagoda Šušković, Full professor
2. PhD Blaženka Kos, Associated professor
3. PhD Tonči Rezić, Assistant professor
4. PhD Jadranka Frece, Assistant professor (substitute)
Paper defended: 16 December, 2011.

Sadržaj:
1. UVOD ............................................................................................................................ 1
2. TEORIJSKI DIO ............................................................................................................ 3
2.1. Bakterije mliječne kiseline kao probiotici ............................................................ 2
2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu ............................................................. 4
2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika ................................................................. 8
2.2. Liofilizacija probiotičkih bakterija ..................................................................... 11
2.3. Primjena različitih lioprotektora pri liofilizaciji bakterijskih kultura ................ 15
3. EKSPERIMENTALNI DIO ......................................................................................... 25
3.1. Materijal ............................................................................................................. 20
3.1.1. Mikroorganizmi .......................................................................................... 20
3.1.2. Hranjive podloge i kemikalije ..................................................................... 20
3.1.2.1. Hranjive podloge ..................................................................................... 20
3.1.2.2. Kemikalije ............................................................................................... 21
3.1.3. Aparatura i pribor ........................................................................................ 22
3.2. Metode rada ........................................................................................................ 22
3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama ..................................................... 22
3.2.2. KOH metoda ............................................................................................... 23
3.2.3. Katalaza test ................................................................................................ 23
3.2.4. Određivanje pH vrijednosti u supernatantu kulture .................................... 23
3.2.5. Izolacija DNA ............................................................................................. 23
3.2.6. Identifikacija bakterija sekvencioniranjem 16S rRNA gena....................... 24
3.2.7. SDS-PAGE površinskih proteina ................................................................ 24
3.2.8. Ispitivanje osjetljivosti autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na

različite antibiotike ..................................................................................... 25
3.2.9. Ispitivanje preživljavanja bakterija u simuliranim uvjetima
gastrointestinalnog trakta ........................................................................... 26
3.2.10. Preživljavanje probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije.............................. 27
3.2.11. Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom ............. 27
4. REZULTATI ................................................................................................................ 20
4.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta ............................................. 28
4.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije ................................................. 39
5. RASPRAVA................................................................................................................. 46
5.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta ............................................. 44
5.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije ................................................. 47
6. ZAKLJUČCI ................................................................................................................ 47
7. LITERATURA ............................................................................................................. 61
1. UVOD
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Uvod
Bakterije mliječne kiseline (BMK) tradicionalno se primjenjuju u proizvodnji

fermentirane hrane, dakle važne su starter kulture u proizvodnji fermentiranih, prvenstveno
mliječnih proizvoda te, zatim u proizvodnji kiselih tijesta, kobasica i, alkoholnih pića.
Pojedini sojevi BMK, osobito oni iz rodova Lactobacillus, su definirani su kao probiotici jer
imaju dokazane pozitivne učinke na zdravlje ljudi i životinja. Probiotik je jedna ili više
kultura živih stanica mikroorganizama koje primijenjene u životinja i ljudi, djeluju korisno na
domaćina poboljšavajući svojstva autohtone mikroflore probavnog sustava domaćina
(Šušković, 1996). Međutim, da bi iskazali svoje pozitivne učinke na zdravlje, probiotički
pripravci moraju sadržavati žive mikrobne stanice u koncentracijama višim od 106 po gramu
proizvoda (Shah, 2007). Zbog toga se istražuju različite metode koje mogu doprinijeti
povećanju preživljavanja probiotika tijekom biotehnološke proizvodnje, čuvanja ili primjene
u različitim proizvodima, te nakon oralne primjene u gastrointestinalnom traktu domaćina.
Mnogi znanstveni radovi opisuju liofilizaciju kao najpogodniju metodu priprave bakterijskih
stanica u praškastom obliku, a kojom se osigurava visoki broj živih bakterijskih stanica kroz
duži vremenski period (G-Alegria i sur., 2004; Capela i sur., 2006; Meng i sur., 2008).
Liofilizacija ili sušenje proizvoda u zamrznutom obliku je postupak sušenja kojim se tekući
dio materijala odvodi sublimacijom. Tijekom liofilizacije razlikuju se dvije faze. Prva je
fazase faza sastoji od zamrzavanja a materijala u tankom sloju pri na temperaturi od -15°C do
-70°C, i pri tome čemu se voda prisutna unutar bakterijskih stanica i u ekstracelularnom
mediju prevodi u led. Druga faza je faza sušenja zamrznutog materijala u vakuumu, pri čemu
se kristali leda sublimacijom prevode direktno u paru, , sublimacijom, što uzrokuje
dehidrataciju bakterijske stanice (Šušković, 2009).
Bakterijske kulture su prilikom zamrzavanja i sušenja u vakuumu izložene stresnim
uvjetima koji uzrokuju oštećenja stanica. Kako bi se ta oštećenja svela na minimum, tijekom
liofilizacije se primjenjuju različiti lioprotektori. Lioprotektori su tvari koje različitim
mehanizmima sprečavaju oštećenja stanica tijekom zamrzavanja, sušenja i skladištenja. U
literaturi su opisani brojni lioprotektori kao što su, primjerice obrano mlijeko, proteini sirutke,
glicerol, betain, adonitol, dekstran, polietilen glikol, šećerni alkoholi manitol i sorbitol, a
najčešće se spominju šećeri poput saharoze, laktoze, trehaloze i glukoze (Carvalho i sur.,
2004; Santivarangkna i sur., 2008; Siaterlis i sur., 2009).
Cilj ovoga rada je bio ispitati zaštitnu ulogu inulina, fruktooligosaharida i obranog
mlijeka u prahu, na preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije.
1
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Uvod
Autohtoni izolati BMLK identificirani su sekvencioniranjem pomoću 16S rRNA gena

te su provedena istraživanja u okviru probiotičkog koncepta s ciljem in vitro odabira
potencijalnih probiotičkih starter kultura.
2
2. TEORIJSKI DIO
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Teorijski dio
2.1. Bakterije mliječne kiseline kao probiotici Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
Bakterije mliječne kiseline su gram-pozitivni, nesporogeni mikroorganizmi s niskim

sadržajem gvanina i citozina u molekuli DNA, kemoorganotrofi, mezofili i mikroaerofili. One
rRastu na kompleksnim hranjivim podlogama i imaju GRAS status (engl. Generally Regarded
as Safe), a mogu biti homofermentativne ili heterofermentativne. Homofermentativne vrste
proizvode više od 80% mliječne kiseline iz glukoze, dok heterofermentativne vrste proizvode
manje mliječne kiseline (50% ili više), a veće količine octene i mravlje kiseline, ugljičnog
dioksida i etanola. Bakterije mliječne kiseline proizvode i komponente arome poput diacetila,
acetoina i acetaldehida. Ove bakterije mogu rasti u najrazličitijim, katkada i ekstremnim
uvjetima, acidotolerantne su te sprječavaju rast ostalih mikroba proizvodeći mliječnu kiselinu
i zbog toga uspješno rastu i razmnožavaju se na različitim staništima. Bakterije mliječne
kiseline mogu biti svrstane u slijedeće rodove: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus,
Pediococcus, Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus,
Alloicoccus, Tetragenococcus, Atopobium, Bifidobacterium i Sporolactobacillus. Iako rodovi
Bifidobacterium i Sporolactobacillus filogenetički pripadaju drugim grupama bakterija, ovdje
su uključene zbog svojih fizioloških karakteristika, odnosno proizvodnje mliječne kiseline kao
finalnog proizvoda metabolizma (Šušković, 2009). Formatted: Font color: Auto
BMK su važni industrijski važni mikroorganizmi koji se primjenjuju kao funkcionalne

starter kulture u proizvodnji različitih fermentiranih proizvoda poput jogurta, sireva, maslina,
kiselog zelja, krastavaca, kobasica, gljiva, kruha i alkoholnih pića ameđu kojima se istuču ,
pivoa, brandy i, whisky. Vrlo brzo proizvode mliječnu kiselinu, i spuštaju pH vrijednost
prehrambenog proizvoda, ite utječu na aromu, proizvodnjom diacetila i acetaldehida, teksturu
, proizvodnjom različitih egzopolisaharida, te na nutritivnu vrijednost proizvoda. Pojedini
sojevi BMK proizvode antimikrobne supstancije bakteriocine, primjerice, soj Lactococcus
lactis spp. lactis proizvodi bakteriocin nisin koji se primjenjuje kao biokonzervans. Osim
proizvodnjom bakteriocina, BMK mogu djelovati antagonistički i zbog sniženjema pH
uslijed nakupljanja organskih kiselina kao što su mliječna kiselina i octena kiselina, te zbog
proizvodnjeproizvodnjom diacetila i vodikova peroksida u aerobnim uvjetima. Na taj
načinTim mehanizmima sprječava se kvarenje proizvoda tei mu se produžuje se vijek
trajanja. proizvoda. One se također nalaze u našem probavnom traktu gdje su kao dio prirodne
mikrobne populacije i uključene su u naš metabolizam. Metchnikoff je početkom prošlog
stoljeća uočio kako BMK unesene fermentiranim mliječnim proizvodima povoljno utječu na
regulaciju mikroflore crijevnog trakta. Međutim, tek se zadnjih tridesetak godina nastoji
2
razviti Metchnikoffova teorija i pronaći prirodan način poboljšanja zdravlja ljudi i životinja
korištenjem fermentiranih proizvoda i čistih kultura BMK.
Izraz probiotik se odnosi na proizvode koji sadrže žive mikroorganizme, kao što su Formatted: Not Highlight
liofilizirane stanice ili u fermentiranim proizvodimaa, poboljšavaju zdravlje ljudi i životinja Formatted: Not Highlight
što može uključivati i poticanje rasta životinja. D, djeluju u ustima ili i u probavnom traktu Formatted: Not Highlight
preko hrane ili u obliku kapsula, te u gornjem respiratornom traktu (aerosol) ili u
urogenitalnom traktu području (lokalna primjena) (Šušković, 2009). Formatted: Not Highlight
Mehanizam djelovanja probiotika je raznolik. Oni inhibiraju rast nepoželjnih

mikroorganizama u gastrointestinalnom traktu proizvodnjom antibakterijskih supstancija,
poput primarnih metabolita mliječne i octene kiseline, diacetila, acetaldehida, vodikova
peroksida i bakteriocina, zatim natjecanjem za hranjive tvari te, natjecanjem za mjesta vezanja
na crijevniom epitelu. Oni također modificiraju metaboličke procese u crijevima tako što
povećavaju aktivnost nekih enzima kao npr. β-galaktozidaze, a smanjuju aktivnost enzima
koji sudjeluju u kancerogenim procesima, kao što su β-glukuronidaza, nitroreduktaza,
azoreduktaza i steroid-7-α-dehidroksilaza. Također stimuliraju imunološki sustav domaćina
povećanjem razine antitijela i povećanjem aktivnosti makrofaga. Ciljno mjesto djelovanja
probiotika je narušen integritet crijevnae sluznicae čiji je integritet narušen, a koja je
predstavlja obrambenua barijerua nepoželjnog i nekontroliranog prolaska antigena, odnosno
patogenih mikroorganizama.
Probiotici se klasificiraju kao bioterapeutici, odnosno proizvodi za terapiju ili
prevenciju bolesti te kaoi probiotičke kulture, odnosno proizvodie koji promoviraju zdravlje i
koji služe kao dodaci hrani ili služe se koriste za proizvodnju funkcionalne hrane. Počeli su se
popularizirati uslijed nedostatka učinkovitih antibiotika te zbogi razvoja antibiotičke
rezistencije. Naime, velikom primjenom kemijskih dodataka i antibiotika u prehrani, dolazi do
kroničnog poremećaja crijevne mikroflore i nedjelotvornosti kemoterapeutika pri liječenju
različitih infektivnih bolesti. Zbog toga se u prehrani i terapiji primjenjuju probiotici zbog
zahvaljujućinjihova širokomg rasponu njihovoga korisnog djelovanja. Oni poboljšavaju
metabolizam laktoze, stimuliraju imunološki sustav, suzbijaju urogenitalne i crijevne
infekcije, reguliraju koncentraciju kolesterola, imaju antitumornu aktivnost, te suzbijaju
alergijske reakcije i modificiraju crijevnu mikrofloru.
3
2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu Formatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold
Bakterijski sojevi za probiotičku uporabu trebaju zadovoljiti tzv. opće, tehnološke i Formatted: Font: Bold
funkcionalne izborne kriterije (Slika 1). Ako je probiotički soj namijenjen za specifičnu Formatted: Font: Bold
zdravstvenu primjenu može se još dodatno postaviti “specifičan izborni kriterij” (Sanders i
Huis in’t Veld, 1999).
Probiotička svojstva koja iskazuje određeni bakterijski soj ne mogu se pripisati
drugom soju, bez obzira pripadaju li istoj ili različitim bakterijskim vrstama. Poželjno je da Formatted: Croatian (Croatia)
probiotički soj bude humanog podrijetla, te da se suvremenim molekularnim metodama

odredi kojem rodu i vrsti pripada. Najbolji je dokaz o zdravstvenoj sigurnosti BMK je duga
tradicija njihove primjene bez štetnog utjecaja na zdravlje čovjeka, zbog čega su, prema US
FDA, dobile GRAS (“generally recognised as safe”) status. Formatted: Croatian (Croatia)
Odabir potencijalnih probiotičkih sojeva temelji se na in vitro istraživanjima što jesu Formatted: Croatian (Croatia)
dobar preduvjet za utvrđivanje probiotičkih svojstava u in vivo uvjetima. Pri tome se koriste
različiti statički i dinamički modeli koji simuliraju uvjete u humanom GIT (Havennar i sur.,
1992; Dunne i sur., 1999; Alander i sur., 1999). Formatted: Croatian (Croatia)
4
Podrijetlo Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font

color: Auto
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
OPĆI
Zdravstvena sigurnost Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
KRITERIJI color: Auto
Otpornost prema niskom pH, color: Auto
želučanom soku, soku gušterače i Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
žučnim solima color: Auto
color: Auto
Preživljavanje i zadržavanje Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
TEHNOLOŠKI aktivnosti tijekom priprave i čuvanja color: Auto
KRITERIJ probiotičkog proizvoda Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
Adhezija na crijevni epitel color: Auto
i/ili color: Auto
Antimikrobno djelovanje, posebno color: Auto
prema patogenim mikroorganizmima Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
i/ili color: Auto
FUNKCIONALNI
KRITERIJI Poticanje imunološkog odgovora color: Auto
color: Auto
i/ili
Promjene mikrobnog metabolizma color: Auto
u probavnom traktu Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto, Polish
color: Auto, Polish
color: Auto
Slika 1. Opći, tehnološki i funkcionalni kriteriji za odabir probiotičkih sojeva (Sanders i Huis Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
in’t Veld, 1999, Kos, 2001, Šušković i sur., 2001). Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
color: Auto
Glavne prepreke za preživljavanje potencijalnih probiotičkih sojeva u GIT Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
predstavljaju niski pH želuca, žučne soli tei probavni enzimi, kao što su lizozim, pepsin i Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
enzimi gušterače. Bakterije roda Lactobacillus pokazale su uglavnom veću otpornost prema
color: Auto
niskim pH-vrijednostima u usporedbi sa sojevima Bifidobacterium vrsta (Dunne i sur., 1999).
Nadalje, jedan od važnih izbornih kriterija je preživljavanje i rast potencijalnih probiotičkih color: Auto
sojeva na hranjivoj podlozi kojoj je dodano 0,15-0,3 % žučnih soli, što odgovara fiziološkoj color: Auto
koncentraciji u ileumu čovjeka (Goldin i Gorbach, 1992). Visok stupanj preživljavanja Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font
color: Auto
5
probiotičkih sojeva u GIT prijeko je potreban preduvjet za adheziju, tj. vezanje na crijevni
epitel, zatim za antimikrobno djelovanje i stimulaciju imunološkog sustava. Probiotičko
djelovanje koje nije uvjetovano aktivnošću stanica odnosi se na poboljšanje metabolizma
laktoze i neke imunološke modifikacije (Marteau i Rambaud, 1993; Fuller i Perdigon, 2000).
Utvrđivanje antagonističkog djelovanja potencijalnih probiotičkih sojeva prema patogenim i
drugim mikroorganizmima provodi se različitim in vitro metodama. Posebnu pozornost
privlači bakteriocinska aktivnost BMK (Kos, 2001; Cotter i sur., 2005; Šušković i sur., 2010).
Nadalje, važno je osigurati i optimalne uvjete tijekom priprave i čuvanja probiotika (sastav
hranjive podloge, temperatura rasta, trajanje fermentacije, miješanje, homogenizacija itd.) radi
mikrobiološke stabilnosti proizvoda. Dodatkom protektora, inkapsuliranjem i
mikroinkapsuliranjem probiotičkih sojeva tijekom zamrzavanja, sušenja ili čuvanja, može se
bitno povećati broj živih stanica po gramu pripravka (Laulund, 1994). Nakon provedenih in
vitro istraživanja za izbor probiotičkih sojeva, slijede istraživanja na animalnim modelima te
zatim i i klinička istraživanja (Havenaar i sur., 1992; Reid, 1999). Dnevno potrebna,
minimalna doza živih mikrobnih stanica, koja bi mogla polučiti korisni učinak na zdravlje, je
između 108 i- 1010 stanica/mL, ali je još uvijek predmet mnogih rasprava (Ouwehand i sur.,
2002, Swenson, 1999; Sanders i Huis in’t Veld, 1999). Popis svih očekivanih svojstava
potencijalnog probiotičkog soja prema općim (1-6), tehnološkim (7-10) i funkcionalnim
zahtjevima (11-17), prikazan je u Tablici 1. (Kullen i Klaenhammer, 1999; Kos, 2001;
Šušković i sur., 2001).
6
Formatted: Croatian (Croatia)
Tablica 1. Zahtjevi za izbor probiotičkih sojeva (Kullen i Klaenhammer, 1999; Kos,

2001;Šušković i sur., 2001).
1. točna taksonomska identifikacija
Opći zahtjevi
2. humano podrijetlo za humane probiotike
3. netoksičnost i nepatogenost
4. genetička stabilnost (nema prijenosa plazmida)
5. otpornost prema žučnim kiselinama
6. otpornost prema niskim pH vrijednostima
7. stabilnost poželjnih karakteristika tijekom priprave kulture, skladištenja i isporuke
Tehnološki zahtjevi
8. visoka razina broja živih bakterija u probiotičkom proizvodu (106-108 mL-1 ili g-1), npr. 100
g proizvoda osigurava 108-1010 živih stanica
9. brzo i lako razmnožavanje, izdvajanje, koncentriranje, smrzavanje i liofiliziranje tijekom

procesa priprave probiotičkih kultura, te visok stupanj preživljavanja tijekom čuvanja i
distribucije
10. dobivanje poželjenih organoleptičkih svojstava kad su uključeni u fermentacijske procese
11. sposobnost preživljavanja, razmnožavanja i metabolizamske aktivnosti u "ciljanom"

području primjene u organizmu
12. sposobnost adhezije i kolonizacije crijevnog epitela

Funkcionalni zahtjevi
13. sinteza antimikrobnih supstancija, uključujući bakteriocine, vodikov peroksid i organske

kiseline
14. antagonistička aktivnost prema patogenim i kariogenim bakterijama

15. mogućnost kompeticije sa sudionicima normalne mikroflore, uključujući iste ili srodne vrste,
otpornost prema bakteriocinima, kiselinama ili drugim antimikrobnim supstancijama koje
proizvodi autohtona mikroflora
16. imunostimulatorni učinak

17. sposobnost iskazivanja jednog ili više klinički dokumentiranih korisnih učinaka na zdravlje
7
2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika Formatted: Font: Bold
Mehanizam probiotičkog djelovanja nije još u potpunosti razjašnjen. Prema Fulleru

(1989, 1992),; Huis in’t Veld i Havenaaru (1993) te; Šušković i sur. (2001) probiotičko
djelovanje bakterija mliječne kiseline (BMK) izražava se pomoću tri glavna mehanizma:
A. Inhibicija rasta nepoželjnih mikroorganizama u intestinalnom traktu:

a) proizvodnjom antibakterijskih supstancija, što obuhvaća primarne metabolite: mliječnu
kiselinu, octenu kiselinu, diacetil, acetaldehid, vodikov peroksid i bakteriocine (proteinske
supstancije s antimikrobnim djelovanjem, u prvom redu prema srodnim bakterijskim
vrstama);
b) natjecanjem za hranjive tvari, u prvom redu za neprobavljive ugljikohidrate u debelom
crijevu;
c) natjecanjem za mjesta vezanja u intestinalnom traktu. Adhezija probiotičkih sojeva u
intestinalnom traktu može biti specifična i nespecifična. Specifična adhezija označava
vezanje adhezina na površini bakterijske stanice s receptorom na crijevnoj epitelnoj stanici.
Nespecifična adhezija obuhvaća hidrofobne i elektrostatske interakcije koje su često
inicijalna faza koja prethodi specifičnoj adheziji. Adhezija bakterija na sadržaj u lumenu
crijeva također je nespecifična.
B. Modifikacija metabolizamskih procesa u intestinalnom traktu:

a) povećanjem aktivnosti nekih enzima kao npr. β-galaktozidaze, što omogućava
podnošljivost laktoze pri deficijenciji tog enzima;
b) smanjenjem aktivnosti enzima koji sudjeluju u kancerogenim procesima kao što su: β-
glukuronidaza, nitroreduktaza, azoreduktaza i steroid-7α-dehidroksilaza.
C. Stimulacija imunološkog sustava domaćina:

a) povećanjem razine protutijela
b) povećanjem makrofagne aktivnosti
Prema posljednjim istraživanjima, oralno primijenjeni laktobacili poboljšavaju imunost
domaćina jer povećavaju broj cirkulirajućih i lokalnih protutijela, koncentraciju gama
interferona, aktivnost makrofaga i broj stanica ubojica. Nakon adhezije probiotičkih BMK na
crijevnu sluznicu (mukozu) slijedi njihova translokacija do limfoidnog tkiva crijeva (engl.
8
gut-associated lymphoid tissue, GALT), što je presudan korak u jačanju mukozalne i

sistemske imunosti (Fuller i Perdigon, 2000; Shu i Gill, 2002, Bakker-Zierikzee i sur., 2006).
Na temelju iznesenog mehanizma probiotičkog djelovanja, mogući su poželjni učinci
probiotičkih sojeva na zdravlje (Tablica 2.). Mehanizam probiotičkog djelovanja iznesen pod
točkom A sudjeluje u sprječavanju gastrointestinalnih infekcija, dok mehanizmi probiotičkog
djelovanja pod točkama B i C omogućavaju smanjenje učestalosti raka debelog crijeva te
općenito antikancerogeno djelovanje, smanjenje koncentracije kolesterola u krvi, poboljšanje
metabolizma laktoze, sprječavanje zatvora (konstipacije), suzbijanje alergija, stimulaciju
imunokompetentnih stanica (Limfocita B i T, stanica ubojica) i povećanje makrofagne
aktivnosti (Šušković i sur., 2001).
Nakon što je određeni autohtoni izolat ispunio opće i funkcionalne izborne kriterije za
probiotičke sojeve, te je okarakteriziran kao probiotik, potrebno je i ispitati da li zadovoljava
i tehnološke kriterije, te je tek nakon toga moguće proizvesti probiotički pripravak koji će se
primjeniti kao probiotička starter kultura ili kao bioterapeutik.
9
Tablica 2. Poželjna svojstva i mehanizam djelovanja probiotičkih bakterija (Sanders i Huis

in’t Veld, 1999; Kos, 2001).
Poželjna svojstva probiotika Mehanizam djelovanja probiotika

β-galaktozidazna aktivnost probiotičkog soja u
Sudjelovanje u metabolizmu laktoze
tankom crijevu.
Antimikrobno djelovanje mliječne kiseline,
kratkolančanih masnih kiselina, vodikovog peroksida,
diacetila i bakteriocina.
Sprječavanje gastrointestinalnih i
Stimulacija imunološkog sustava (povećana
urogenitalnih infekcija
proizvodnja protutijela).
Natjecanje za hranjive komponente i mjesta vezanja u
GIT.
Sprječavanje rasta bakterija koje proizvode
prokancerogene enzime: β-glikozidazu, β-glukuronidazu,
nitroreduktazu, azoreduktazu i inhibicija djelovanja tih
Antikancerogeno djelovanje enzima.
Stimulacija imunološkog sustava (aktivacija
makrofaga koji djeluju tumoricidno).
Utjecaj na koncentraciju sekundarnih žučnih soli. Formatted: Croatian (Croatia)
Stimulacija nespecifičnog (fagociti) i specifičnog Formatted: Croatian (Croatia)
imunološkog odgovora: aktivacija humoralnog Formatted: Croatian (Croatia)
Modulacija imunološkog sustava
imunološkog odgovora (IgA i IgG) i staničnog Formatted: Croatian (Croatia)
imunološkog odgovora (T-limfociti).
Suzbijanje alergija Sprječavanje translokacije antigena u krv. Formatted: Croatian (Croatia)
Snižavanje razine masnoće u krvi, Asimilacija kolesterola. Formatted: Croatian (Croatia)
sprječavanje bolesti srca i krvnih žila Aktivnost hidrolaze žučnih soli. Formatted: Croatian (Croatia)
Inhibicija rasta mikroorganizama koji proizvode
Suzbijanje hepatičke encefalopatije Formatted: Croatian (Croatia)
ureazu.
U Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura na
Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu, na temelju istraživanja provedenih u sklopu Formatted: Croatian (Croatia)
probiotičkog koncepta, probiotičke bakterije Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus
10
plantarum L4 i Enterococcus faecium L3 su ispunile vrlo stroge izborne probiotičke kriterije Formatted: Croatian (Croatia)
(Šušković, 1996, Kos, 2001, Šušković i sur., 2001; Šušković, 2010), te je razvijen proces
biotehnološke proizvodnje probiotičkih bakterija u liofiliziranom obliku (Slika 2). Formatted: Croatian (Croatia)
Zbirka probiotičkih sojeva

Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima, Precjepljivanje
Mikrobiološka i
probiotika i starter kultura
genetička kontrola
Inokulum
Hranjiva podloga
Uzgoj Kontrola procesa
Sterilizacija
proizvodnje
Odvajanje hranjive podloge
Vlažna biomasa probiotičkog soja
Dodatak
Duboko
MIKROINKAPSULACIJA krioprotektora i
smrzavanje
lioprotektora
Mikrobiološka
LIOFILIZACIJA i genetička kontrola
MIKROINKAPSULACIJA
Mikrobiološka i Probiotička bakterija Čuvanje na +4 oC

genetička kontrola - živi lijek -
Slika 2. Primjer proizvodnje liofiliziranih probiotičkih bakterija kao živih lijekova u

Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura na Prehrambeno-
biotehnološkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu (Šušković, 2009).
2.2. Liofilizacija probiotičkih bakterija
11
Probiotičke bakterije se učestalo primjenjuju kao pripravci u koncentriranom obliku s

ciljem direktne inokulacije u prehrambene proizvode. Preživljavanje i aktivnost koncentrirane
probiotičke kulture mora biti dovoljno visoka da bi proces fermentacije započeo nedugo
nakon inokulacije funkcionalne starter kulture. Koncentrirane probiotičke kulture su dostupne
u zamrznutom i suhom, praškastom obliku. Suhe, praškaste kulture se koriste zbog malih
troškova skladištenja i transporta, jer se ne moraju čuvati na niskim temperaturama. Danas se
primjenjuje nekoliko različitih metoda sušenja vlažne biomase BMK :
a) sušenje u vakuumu (manje od 1 mmHg) pri temperaturi od 40°C do 45°C
b) sušenje biomase raspršivanjem
c) kontrolirano sušenje u vakuumu pri niskim temperaturama (od -2°C do -3°C)
d) sušenja biomase iz zamrznutog stanja sublimacijom tzv. liofilizacija
Liofilizacijom se probiotici stabiliziraju kako bi bili upotrebljivi tijekom duljeg
perioda čuvanja te tijekom primjene kao bioterapeutika i u proizvodnji funkcionalne hrane.
Liofilizacija se provodi u uređaju nazvanom liofilizator (Slika 3.), a sastoji od dvije faze: faze
zamrzavanja i faze sušenja. Stanice se u prvoj fazi zamrzavaju pri temperaturi od -15°C do -
70°C, a u drugoj fazi se suše tako što se zamrznuta voda iz krutoga stanja, sublimacijom,
prevodi direktno u paru pod vakuumom i niskim temperaturama. Postizanje vakuuma je od
presudnog značaja za uspješnu liofilizaciju. Ukupan tlak unutar uređaja mora biti niži od tlaka
pare na površini pripravka koji se liofilizira, a tlak pare na površini kondenzatora mora biti
niži od tlaka pare u unutrašnjosti liofilizatora. Ova razlika tlakova upravlja brzinom sušenja.
Uobičajeni vakuum koji se primjenjuje tijekom liofilizacije iznosi između 50 i 100 mmHg.
Tijekom sušenja razlikuju se dvije faze: faza primarnog sušenja i faza sekundarnog sušenja.
Primarno je sušenje iz zamrznutog stanja (od -15°C do -70°C), tijekom kojeg se u pripravak
dovodi toplina. Primarno sušenje završava kada u pripravku preostane još samo 6-8% vode jer
tada u pripravku više nema leda pa zbog čegai završava i sublimacija tada završava.
Primarnim sušenjem se iz pripravka izdvaja tzv. slobodna voda. Sekundarno sušenje je
sušenje iz „tekućeg“ stanja i njime se nastoji ukloniti tzv. vezana voda. Ako vezana voda
ostane u pripravku, ona može spriječiti njegovo uspješno čuvanje, osobito pri sobnoj
temperaturi. Temperatura se u vakuum sušnici održava pomoću tople vode koja cirkulira kroz
police na kojima se nalaze bočice. Vodena para se kondenzira u kondenzatorima koji se hlade
rashladnim sredstvom. Tijekom cijeloga procesa se mora osigurati sterilnost. Pri opadanju
brzine sušenja materijala dolazi do izjednačavanja temperature preparata i okoliša. Proces
sušenja završava kada se ove temperature izjednače. Izbor konačne temperature sušenja ovisi
12
o samoj termostabilnosti mikroorganizama. Preostalih 2-3% vlage se teško uklanja, najčešće

pri 60-70°C, kroz 2-3 sata.

Slika 3. Liofilizator Christ Alpha 1-2 LD PLUS iz Laboratorija za tehnologiju antibiotika, Formatted: Croatian (Croatia)
enzima, probiotika i starter kultura na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu Sveučilišta u Formatted: Croatian (Croatia)
Zagrebu.
Tijekom liofilizacije dolazi do inaktivacije pojedinih stanica i to najčešće tijekom faze
zamrzavanja. Prema literaturi, 60-70% stanica koje prežive u fazi smrzavanja opstaju također Formatted: Croatian (Croatia)
i u fazi sušenja (Meng i sur. 2008). Tijekom zamrzavanja, oko stanice se formira led koji Formatted: Croatian (Croatia)
uzrokuje povećanje osmotskog tlaka izvanstanične otopine te zbog toga dolazi do
dehidratacije stanice. Koncentracija otopina unutar i izvan stanice, a tako i osmotski tlak, će Formatted: Croatian (Croatia)
se povećavati padom temperature. Dva su načina zamrzavanja -, sporo ili brzo zamrzavanje Formatted: Croatian (Croatia)
(Slika 4.). Tijekom sporog zamrzavanja stanice su izložene temperaturama od 20°C, 4°C, -
4°C,-20°C te -80°C i to kroz 3h, dok se tijekom brzog zamrzavanja stanice naglo zamrzavaju Formatted: Croatian (Croatia)
pri temperaturi od -80°C. Najveći broj stanica odumire tijekom sporog zamrzavanja pri Formatted: Croatian (Croatia)
temperaturi između -4 i -20°C (Santivarangkna i sur., 2008). Tijekom sporog zamrzavanja Formatted: Croatian (Croatia)
izvan stanice se postupno stvara led. To dovodi do dehidriranja stanice i njenog oštećenja, dok Formatted: Croatian (Croatia)
se pri brzom zamrzavanju to može izbjeći, jer nastaju manji kristali koji imaju veću površinu
isparavanja leda. U tom slučaju Tada dolazi i do stvaranja viskoznije otopine koja okružuje Formatted: Croatian (Croatia)
13
kristale leda nakon zamrzavanja. Viskoznija otopina pri sublimaciji zadržava porozniju formu
što olakšava sublimaciju.
Slika 4. Shematski prikaz „ponašanja“ stanice tijekom zamrzavanja (preuzeto od

Santivarangkna i sur., 2008): a) Tijekom postupnog zamrzavanja povećava se koncentracija
kristala vode izvan stanice. Voda difundira i zamrzava se van stanice. b) Tijekom optimalne
brzine zamrzavanja količina kristala leda je veća. Difuzija vode je usporena povećanjem
viskoziteta. Kada je brzina zamrzavanja dovoljno visoka, stanice dosegnu temperaturu
stabilizacije prije nego što previše vode difundira izvan stanice. c) Pri velikoj brzini
zamrzavanja naglo smanjenje temperature prekida difuziju vode van stanice usprkos velikom
koncentracijskom gradijentu. Kristali leda se stvaraju unutar stanice.
Veličina same bakterijske stanice također je značajna za preživljavanje tijekom

liofilizacije. Što je veća površina stanice, dolazi do većeg njihovog oštećenja stanice
stvaranjem leda izvan stanice. Male sferne stanice poput stanica onih kod enterokoka, su
otpornije su na smrzavanje i liofilizaciju nego dugački štapićasti lactobacili (Meng i sur.,
2008).
Prilikom sušenja također dolazi do oštećenja stanice jer uklanjanje vezane vode uzrokuje
oštećenje strukture proteina, stanične stjenke i citoplazmine membrane. Voda je pomoću
različitih nekovalentnih interakcija vezana na makromolekule prisutne u staničnoj stjenci i
citoplazminoj membrani, čime se stabilizira njihova struktura i omogućuje odvijanje važnih
bioloških funkcija unutar stanice. Stoga uklanjanjem vezane vode tijekom sušenja može doći
14
do narušavanja strukture makromolekula, što opet uzrokuje i gubitak bioloških funkcija.

Prema literaturi, tijekom sušenja se prvenstveno oštećuju lipidi unutar citoplazmine
membrane jer dolazi do njihove oksidacije. Također je posljedica i gubitak konformacije
molekula DNA i RNA, što ometa DNA replikaciju, transkripciju i translaciju proteina (Meng
i sur., 2008). Da bi oštećenja bakterijskih stanica tijekom sušenja i skladištenja bila
minimalna, potrebno je nadzirati brojne parametre, poput početne koncentracijea biomase
mikroorganizama, uvjeta tijekom bakterijskog rasta, sastava hranjive podloge i, medija
tijekom procesa sušenja tei uvjeta rehidratacije.
Liofilizacija, iako relativno skup proces, koji zahtjeva sterilnost i hermetičnost, ima i
brojne prednosti u usporedbi s drugim metodama čuvanja bakterijskih kultura. Prednost
liofilizacije pred drugim metodama je prvenstveno mogućnost postizanja veće stabilnosti
liofiliziranog pripravka i dobro otapanje liofilizirane suspenzije. Također je kod liofilizacije
smanjena mogućnost kontaminacije, minimalna su oštećenja bakterijskih stanica ii minimalni
gubici aktivnosti termolabilnih supstancija, rehidratacija je brza i cjelovita, a uzorkovanje
finalnog proizvoda je precizno i sterilno. U današnje vrijeme traže se alternativne metode koje
bi zamijenile skup postupak liofilizacije, a to su npr. vakuum sušenje, sušenje u struji toplog
zraka i sušenje u lebdećem sloju, ali se tim metodama još uvijek ne postiže dovoljno visok
postotak preživljavanja mikroorganizama (Santivarangkna i sur., 2007). Postupak liofilizacije
kojim se proizvode probiotičke bakterije u praškastom obliku u Laboratoriju za tehnologiju
antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta
prikazan je na slici 2.
2.3. Primjena različitih lioprotektora pri liofilizaciji bakterijskih kultura Formatted: Font: Bold, Polish
Lioprotektori su tvari koje se dodaju u medij prije liofilizacije kako bi se stanice

zaštitile, te povećao postotak preživljavanja tijekom dehidratacije. Kao lioprotektori se često
primjenjuju različiti šećeri jer su ekonomski isplativi, kemijski su neškodljivi, te te jer se često
koriste u prehrambenoj industriji. Prema literaturi, šećeri poput trehaloze, sorbitola, manoze,
saharoze, manitola i laktoze se uspješno primjenjuju kao lioprotektori tijekom liofilizacije.
Uloga lioprotektora osobito je značajna u procesu sušenja, ali i tijekom kasnijeg skladištenja
bakterijskih kultura (Santivarangkna i sur., 2008). Pretpostavlja se da utjecaj lioprotektora
ovisi i o hranjivoj podlozi primijenjenoj za uzgoj mikroorganizma i medija u kojem se
provodi sušenje, odnosno liofilizacija bakterijske kulture. Primjerice, prema Santivarangkna i
sur. (2008), saharoza ima značajniji protektivni učinak tijekom liofilizacije ako su bakterijske
15
stanice prethodno rasle u MRS hranjivoj podlozi koja je sadržavala saharozu umjesto glukoze.
Lioprotektori se također mogu dodati u hranjivu podlogu prije fermentacije kako bi pospješili
prilagodbu bakterije na novi okoliš (Meng i sur., 2008). Osim šećera, kao lioprotektori mogu
se primijeniti i obrano mlijeko u prahu, proteini sirutke, glicerol, betain, adonitol i polimeri
poput dekstrana i polietilen glikola.
Preživljavanje BMK tijekom liofilizacije ovisi o količini šećera tijekom rasta jer su šećeri
primarni izvor ugljika, ali previsoka koncentracija šećera može uzrokovati smrt stanice uslijed
naglog povećanja osmotskog tlaka. Zbog toga se tijekom rasta stanica u hranjivu podlogu
dodaju odgovarajuće topljive tvari tj. osmoliti. To su male organske molekule koje ne utječu
na stanične funkcije i koriste se za prilagođavanje osmotskog tlaka kako stanice ne bi
doživjele osmotski stres. Štite citoplazminu membranu i proteine pri zamrzavanju, sušenju i
visokim temperaturama. To mogu biti različite aminokiseline poput glutamata ili prolina te
kvaterni amini poput betaina i karnitina. Makromolekule unutar stanice imaju veći afinitet
prema vodi nego prema topljivim tvarima te se voda prekomjerno nakuplja na površini
makromolekula (Slika 5.). Na taj način se stabilizira prirodna konformacija makromolekula.
Topljive tvari su veće molekule nego molekule vode te zbog svojega oblika ne pristaju na
površinu makromolekula. Češće dolazi do stvaranja veza topljiva tvar - voda nego veza voda -
voda ili topljiva tvar - topljiva tvar. Povećanjem veza voda - voda dolazi do stvaranja naslaga
topljivih tvari. Tijekom sušenja, tj. uklanjanja vode, može doći do oštećenja stanice ako je u
suspenziji prisutna visoka koncentracija topljivih tvari, soli ili proteina. Do pomanjkanja
količine citoplazmatske vode i oštećenja stanice može doći pri više od 0,3 g H2O/suhoj tvari
(Santivarangkna i sur., 2008). Tijekom osmotskoga šoka, u bakterijskoj stanici se nakupljaju
topljive tvari. Kako bi se topljive tvari akumulirale, potreban je utrošak energije, stoga je
njihovo nakupljanje potrebno inducirati tijekom bakterijskog rasta jer tada stanica raspolaže
izvorima energije. Bakterije nemaju sposobnost sinteze određenih tvari de novo poput prolina
ili betaina, pa je potrebno osigurati njihov izvor ili prekursore u hranjivoj podlozi (Le i sur.,
2007). Uz mliječnu kiselinu, BMK proizvode i neke druge metabolite koji povećavaju stupanj
preživljenja tijekom sušenja. Tako u prisutnosti saharoze ili fruktoze bakterija Leuconostoc
(pseudo)mesenteroides proizvodi veliku količinu manitola koji stabilizira stanice pri niskom
aktivitetu vode i štiti stanicu od oksidacije. U prisutnosti laktoze, fruktoze i galaktoze
Lactobacillus helveticus proizvodi veće količine egzopolisaharida koji zaštićuju stanice pri
isušivanju (Santivarangkna i sur., 2008).
16
Slika 5. Stabilizacija A) proteina i B) citoplazmine membrane dodatkom šećera pri čemu

nastaje hidratizirani sloj (sivo obojeno) oko proteina i membrane što održava njihovu nativnu
konformaciju (Santivarangkna i sur., 2008).
Tijekom sušenja se smanjuje količina vode u stanicama kako bi se usporili metabolički

procesi i sačuvala stanična struktura i stanične funkcije tijekom skladištenja. Stanica bi trebala
sadržavati 0,1 g H2O/suhoj tvari, a nikako više od 0,3 g H2O/suhoj tvari (Santivarangkna i
sur., 2008). Pri niskim koncentracijama vode stanične makromolekule poput DNA, RNA i
proteina, a i lipidi unutar citoplazmine membrane mogu se oštetiti. Oštećenje citoplazmine
membrane tijekom sušenja se temelji na činjenici da se stabilnost lipida održava ravnotežom
između Van der Waalsovih sila i sila odbijanja molekula poput odbijanja hidrofilnih
molekula. Zbog toga su lipidi termodinamički nestabilni i lako dolazi do njihova oštećenja.
Oštećenje membrane se očituje povećanjem osjetljivosti stanica na NaCl ili povećanjem
koncentracije intracelularnih enzima poput laktat dehidrogenaze u mediju u kojima se provodi
ponovna rehidratacija sušene kulture. U citoplazminoj membrani fosfolipidi su hidratizirani.
Uklanjanjem vode povećavaju se Van der Waalsove sile između lanaca ugljikovodika.
Citoplazmina membrana sadrži oko 0,25 g H2O/g suhe tvari i tijekom uklanjanja vode dolazi
do stresa unutar membrane i fosfolipidi moraju podnijeti prelazak iz tekuće faze u gel fazu.
Iako se u staničnoj membrani nalaze najčešće otopljeni i u tekućoj fazi, oni također često
prelaze u gel fazu. Također dolazi i do povećavanja temperature unutar membrane. Povećanje
temperature se najčešće očituje kada je količina vode u stanici manja od 0,2 g H2O/g suhe
tvari. Primjerice, kod funkcionalne starter kulture Lactobacillus plantarum uočena je
promjena temperature od 4°C u stanici bogatoj vodom pa sve do 20°C u suhim stanicama
(Santivarangkna, i sur., 2008). Šećeri mogu utjecati na snižavanje temperature pri kojoj
17
stanica prelazi iz tekućeg stanja u gel stanje (u daljnjem tekstu Tm). Upravo je to razlog što se
mnogi šećeri primjenjuju kao lioprotektori.
Postoje dvije hipoteze o ulozi šećera u snižavaju Tm (Slika 6.). Prema prvoj hipotezi za
taj učinak su zaslužne vodikove veze između fosfatne grupe fosfolipida i hidroksilne grupe
šećera. Voda unutar membrane opkoljuje hidrofilnu glavu fosfolipida i malo zadire do
hidrofobnog djela koji se sastoji od estera glicerola i viših masnih kiselina. Tako je
ustanovljeno da trehaloza može tvoriti vodikove veze s karbonilnom grupom fosfolipida. Pri
usporedbi sa saharozom ustanovljeno je da, za manje nego 18 molekula po molekuli lipida, tri
ili četiri molekule vode su zamijenjene saharozom ili trehalozom, sedam molekula vode su
čvrsto vezane na karbonilnu skupinu i mogu biti zamijenjene jedino trehazolom i sedam
molekula vode su čvrstim vezama vezane za fosfat i mogu biti zamijenjene saharozom ili
trehalozom ako je dehidratacija brza. Polisaharidi se usprkos svojoj veličini također mogu
umetnuti u fosfolipidnu membranu i sniziti Tm. Međutim, interakcija između polisaharida i
fosfolipida ovisi o savitljivosti strukture šećera. Ako polisaharidi imaju krutu strukturu
interakcije između njih i fosfolipida ovise o njihovoj veličini. Tako npr. inulin koji ima
nasumičnu strukturu tzv. „slučajno klupko“ (engl. „random coil“) stvara čvršću vezu sa
membranom nego, primjerice, polisaharid levan koji ima strukturu uzvojnice.
Prema drugoj hipotezi, sile odbijanja između hidrofilnih molekula razdvajaju membranu
fosfolipida u prisutnosti prekomjerne količine vode. Tijekom sušenja, pada koncentracija
vode i sile odbijanja su sve manje tei dolazi do stresa porastom kompresije uzrokovane
približavanjem fosfolipida u membrani. Šećeri limitiraju prekomjerno približavanje molekula
fosfolipida osmotskim i volumetrijskim karakteristikama i uzrokuju pojavu kristalizacije.
Naime, povećane koncentracije šećera uzrokuju povećavanje osmotskog tlaka u otopini i
granična voda se uklanja s površine membrane. Nadalje, sam volumen umjereno velike
molekule šećera držat će fosfolipide odvojenima. Šećer također može tijekom sušenja postati
krut i stvarati mehanički otpor u međumembranskom prostoru te na taj način također može
spriječiti približavanje molekula fosfolipida. Sniziti Tm mogu samo šećeri kojima je
molekulska masa manja od 1000. Šećeri koji imaju molekulsku masu između 1000 i 5000 ne
snižavaju Tm kao ni polimeri velikih molekulskih masa jer ne ulaze unutar membrane (Slika
6.).
18
Slika 6. Prikaz uloge šećera u snižavanju Tm prema A) prvoj odnosno B) drugoj hipotezi.
(Preuzeto iz C.Santivarangkna i sur., 2008).
Tijekom liofilizacije bakterije mliječne kiseline se zamrzavaju pri vrlo niskim

temperaturama. Stanice se zamrzavaju i pri -196°C, pomoću tekućeg dušika, što može
uzrokovati inaktivaciju i oštećenja stanica. Kristali leda unutar stanice mehanički oštećuju
stanicu, te zamrzavanjem stanice otopina postaje hipertonična što ima toksični učinak na
stanicu. Tako primjerice početna 0,15 M izotonična otopina soli poveća svoju koncentraciju
na 3 M pri -10°C (Santivarangkna i sur., 2008). Za zaštitu stanica tijekom zamrzavanja
najčešće se primjenjuju šećeri poput saharoze i laktoze. Tijekom liofilizacije led se sublimira i
struktura osušene stanice jako ovisi o strukturi koja se formira tijekom zamrzavanja. Kada je
sušenje pravilno vođeno, poroznost i cjelokupna površina sušenih stanica nalikovat će onima
u otopini za zamrzavanje, sa velikim rupama koje su prije bile popunjene kristalima leda.
Nakon stvaranja kristala leda nezamrznuta faza tvori amorfnu strukturu poput stakla. Ovakvu
strukturu potrebno je očuvati tijekom uklanjanja kristala leda i skladištenja da ne bi došlo do
oštećenja stanica tijekom liofilizacije. Temperatura oštećenja (Tc) je maksimalna dozvoljena
temperatura tijekom liofilizacije a pri kojoj još uvijek nema oštećenja stanice. Ova
temperatura je različita ovisno o bakterijskoj stanici i koncentraciji bakterija. Disaharidi i
oligosaharidi se često dodaju u otopinu tijekom procesa liofilizacije zato što povećavaju Tc
tijekom zamrzavanja.
ŠMolekule šećeria imaju zaštitnu ulogu i kada su stanice izložene visokim temperaturama
(tijekom zagrijavanja i tijekom skladištenja) i to najčešće šećeri glukoza, fruktoza, laktoza,
manoza, saharoza, trehaloza te šećerni alkoholi sorbitol i inozitol (Carvalho i sur., 2004).
19
3. EKSPERIMENTALNI DIO
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Eksperimentalni dio
3.1. Materijal Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
Formatted: Font: (Default) Arial, Portuguese (Brazil)
3.1.1. Mikroorganizmi Formatted: Font: Bold
Probiotički sojevi Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4 i

Enterococcus faecium L3 su selekcionirani u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima,
probiotika i starter kultura na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu, na temelju istraživanja
provedenih u sklopu probiotičkog koncepta. Autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline su
izoliranih iz svježih sireva ili sireva u salamuri proizvedenih na tradicionalan način u
različitim regijama.
3.1.2. Hranjive podloge i kemikalije Formatted: Font: Bold
3.1.2.1. Hranjive podloge
Tijekom rada korištene su sljedeće podloge:

Hranjive podloge za održavanje, čuvanje i uzgoj bakterija mliječne kiseline: Formatted: Croatian (Croatia)
 MRS (De Man, Rogosa i Sharpe) agar sljedećeg sastava (g/L destilirane vode): pepton Formatted: Croatian (Croatia)
10 g/L; mesni ekstrakt 10 g/L; kvaščev ekstrakt 5 g/L; glukoza 20 g/L; Tween 80
1g/L; MgSO4 · 7 H2O 0,1 g/L; MnSO4 · 7 H20 0,05 g/L; natrijev acetat 5 g/L; agar 20 Formatted: Croatian (Croatia)
g/L. pH vrijednost podloge iznosi 6,5, a sterilizacija se provodi pri 121ºC tijekom 15
min. Formatted: Croatian (Croatia)
 MRS bujon je istog sastava kao podloga MRS agar, ali bez dodatka agara. Formatted: Croatian (Croatia)
 GM17 agar sljedećeg sastava (g/L destilirane vode): kazein nakon razgradnje
tripsinom 2,50 g/L; pepton 2,50 g/L; pepton iz soje 5,00 g/L; kvaščev ekstrakt 2,50 Formatted: Croatian (Croatia)
g/L; goveđi ekstrakt 5,00 g/L; laktoza 5,00 g/L; natrijev glicerofosfat 19,00 g/L; Formatted: Croatian (Croatia)
magnezijev sulfat 0,25 g/L; askorbinska kiselina 0,50 g/L; agar 13 g/L i glukoza 0,5 Formatted: Croatian (Croatia)
g/L. Formatted: Croatian (Croatia)
 GM17 tekuća hranjiva podloga je istog sastava kao podloga GM17 agar, ali bez
dodatka agara. Formatted: Croatian (Croatia)
Sterilizacija svih hranjivih podloga se provodi pri 121ºC tijekom 15 min. Formatted: Croatian (Croatia)
20
3.1.2.2. Kemikalije
 saharoza, „Kemika“, Hrvatska

 laktoza, „Kemika“, Hrvatska
 sorbitol, „Kemika“, Hrvatska
 inulin, „Difco“, SAD
 raftilose P95, Orafti, Tienen, Belbium
 obrano mlijeko u prahu, „Dukat“, Hrvatska
 fosfatni pufer (PBS), „Kemika“, Hrvatska
 agaroza, „Appligane“, Strasbourg
 natrijev acetat, „Kemika“, Hrvatska
 natrijev dodecilsulfat, „Sigma“, SAD
 etanol, „Kemika“, Hrvatska
 glukoza, „Kemika“, Hrvatska
 pepsin (P-700), „Sigma“, SAD
 kloridna kiselina, „Kemika“, Hrvatska
 pankreatin (165 U/mg) iz svinjske gušterače, „BioChemika“, Fluka, Švicarska
 goveđa žuč (oxgall), „Difco“, SAD
 glicin, „Gram-mol“, Hrvatska
 akrilamid, „Sigma“, SAD
 TEMED (N, N, N', N'-tetrametiletilen), „Sigma“, SAD
 Β-merkaptoetanol, „Sigma“, SAD
 metilensko modrilo R-250, „Sigma“, SAD
 izopropanol, „Kemika“, Hrvatska
 metanol, „Kemika“, Hrvatska
 etanol, „Kemika“, Hrvatska
 ledena octena kiselina, „Kemika“, Hrvatska
 standard proteina poznatih relativnih molekulskih masa, „Pharmacia“, SAD
raftilose P95, Orafti, Tienen, Belbium
21
3.1.3. Aparatura i pribor Formatted: Font: Bold
 termostat, „Instrumentarija“, Hrvatska

 vibro- mješač EV-100, „Kartell“, Italija
 vaga, „Tehtnica“, Slovenija
 centrifuga CENTAUR 2, „Sanyo“, Engleska
 centrifuga Centric, „Tehtnica“, Slovenija
 liofilizator, model Christ Alpha 1-2 LD plus, „Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen
GmbH“, Njemačka
 elektroforetske kadice Cleaver, Scientific Itd
 DNA- termoblok, Mastercycler personal „Eppendorf“
 Anaerocult A. Merck, Njemačka
 filter diskovi natopljeni određenim koncentracijama antibiotika, „Oxoid“, Velika
Britanija)
 elektroforetske kadice Cleaver, Scientific Itd
3.2. Metode rada
3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama
Ispitivani sojevi bakterija mliječne kiseline Lactobacillus helveticus M92, Formatted: Croatian (Croatia)
Lactobacillus plantarum L4 i Enterococcus faecium L3 čuvani su pri -80°C u MRS tekućoj
hranjivoj podlozi uz dodatak 15 % (v/v) glicerola. Navedeni Pprobiotički sojevi L. helveticus Formatted: Croatian (Croatia)
M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3 su dio su Zbirke mikroorganizama Laboratorija za Formatted: Croatian (Croatia)
tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Autohtoni izolati čuvani su pri -80°C u MRS, odnosno GM17 Formatted: Croatian (Croatia)
tekućoj hranjivoj podlozi uz dodatak 15 % (v/v) glicerola. Dan prije eksperimenta, probiotički Formatted: Croatian (Croatia)
sojevi, odnosno autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline su inokulirani u svježu optimalnu Formatted: Croatian (Croatia)
hranjivu podlogu, te inkubirani pri optimalnoj temperaturi rasta, prema uvjetima navedenim u Formatted: Croatian (Croatia)
tablici 3.
22
3.2.2. KOH metoda
KOH metoda se koristi za određivanje gram-pozitivnih odnosno gram-negativnih

bakterija. Na predmetno stakalce dodano je 10 μL 3% kalijeva hidroksida (KOH) te se
vidljiva količina bakterijskih stanica sterilno prenijela, pomoću mikrobiološke ušice, u
kapljicu KOH. Bakterijske stanice i otopina 3% KOH su se promiješale, proširivanjem mjesta
do promjera od 1,5 cm. Ako je suspenzija bila viskozna ili gelasta unutar 50-60 s, ispitivana
bakterija je definirana kao gram-negativna, a u protivnom kao gram-pozitivna (Buch, 1982).
3.2.3. Katalaza test Formatted: Font: Bold
Katalaza test služi kako bi se ispitalo da li istraživani mikroorganizam proizvodi enzim

katalazu. Mikrobiološkom ušicom se dio ispitivane bakterijske kulture prenio na predmetno
stakalce, a zatim se dodaloa 1-2 kapi svježeg 3% vodikovog peroksida. U slučaju prisutnosti
katalaze, vidljiva je pojava mjehurića uslijed oslobađanja kisika (Duraković, 1996.,Kos,
2001).
3.2.4. Određivanje pH vrijednosti u supernatantu kulture
pH vrijednost supernatanta prekonoćne kulture autohtonih izolata bakterija mliječne

kiseline određena je pomoću pH metra, „Metrohm“, Švicarska.
3.2.5. Izolacija DNA
MRS podloga inokulirana je s 5% prekonoćne kulture i inkubirana 18 h pri 37°C.

Volumen od 1,5 mL kulture je centrifugiran i ispran u GTE puferu (25 mM TRIS + 10 mM
EDTA + 50 mM glukoze). Stanice su resuspendirane u 500 μL GTE pufera, uz dodatak Formatted: Croatian (Croatia)
lizozima (8 mg/500 μL) i RNA-ze (50 μL/mL), i inkubirane 30 min pri 37°C. Zatim je dodano
250 μL 2% SDS-a i vorteksirano 1 min. Slijedio je dodatak 100 μL neutralnog fenol- Formatted: Croatian (Croatia)
kloroforma,, te miješanje tijekom 30 sekundi tei centrifugiranje na 13 000 okr/5 min. Formatted: Croatian (Croatia)
Supernatant, bez interfaze, je pomiješan s 1/10 volumena 3M natrijeva acetata (pH=4,8), i 1
volumenom izopropanola. Nakon inkubacije (5 minuta pri sobnoj temperaturi) slijedilo je
23
centrifugiranje na 13 000 okr/10 min. Talog je resuspendiran u 300 μL 0,3 M NaAc i 10 mM Formatted: Croatian (Croatia)
MgCl2 i vorteksiran. Nakon dodatka 700 μL apsolutnog etanola (ohlađenog na -20°C), uzorak Formatted: Croatian (Croatia)
je inkubiran preko noći pri -20°C. Nakon toga je slijedilo centrifugiranje pri 14000 okr/20
min. Talog je suspendiran u 75%-tnom etanolu (ohlađenom na -20°C) i ponovno centrifugiran
na 13 000 okr/5 min. Talog DNA je resuspendiran u 50 μL TE pufera (Gardiner i sur., 2002). Formatted: Croatian (Croatia)
3.2.6. Identifikacija bakterija sekvencioniranjem 16S rRNA gena
Odabrani autohtoni izolati su čuvani u MRS (DeMan i drugi, 1960 ; Difco) bujonu ili Formatted: Croatian (Croatia)
agaru (1-7 % w/v) pri 30°C, u aerobnim ili anaerobnim uvjetima – uvjetima optimalnim za
rast , u optimalnim uvjetima rasta pojedinog soja, nakon čega je provedena izolacija DNA Formatted: Croatian (Croatia)
prema postupku opisanom u 3.2.5. Za amplifikaciju željene sekvence DNA upotrebljena je

KAPA Taq DNA polimeraza s odgovarajućim oligonukleotidnim početnicama , primerima,
specifičnim za konzervirane regije 16S rRNA gena pomoću PCR-a; 16S FW universal Tm =
52 °C I 16S REW universal Tm = 57 °C.
Amplifikacija DNA provedena je pomoću PCR reakcije programirane započete
ninicijalnom denaturacijom na 5 min pri 94 °C, nakon čega je slijedilo (inicijalna
denaturacija), te 30 ciklusa od 30 s pri 94 °C (denaturacija), 30 s pri 50 °C (prijanjanje), 30 s
pri 72 °C (produljivanje), dok je završno produljivanje vođeno i 77 min pri 72 °C. (završno
produljivanje). Produkti PCR reakcije su detektirani elektroforezom u 1,5 % (w/v) agaroznom
gelu i bojanjem gela etidijevim bromidom. Dobiveni PCR produkti pročišćeni su pomoću
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Njemačka) prema uputama proizvođača i zatim
sekvencionirani.
3.2.7. SDS-PAGE površinskih proteina Formatted: Font: Bold

Stanice autohtonih izolata BMK, koncentrirane centrifugiranjem 10 000 okr./min Formatted: Font: Bold
tijekom 5 min i dva puta isprane sterilnom destiliranom vodom, resuspendirane su u 50 µL
1%-tne otopine SDS-a. Tako resuspendirane stanice kuhale su se , kuhaju se 10 min. Nakon
toga je slijedilo ponovno centrifugiranje suspenzije stanica pri 9000 okr./min kroz 5 min. i
supernatant je podvrgnut SDS-poliakrilamidnoj gel-elektroforezi (SDS-PAGE). U svrhu
uklanjanja površinskog sloja proteina (engl. “S-layer” proteins) bakterijske stanice su tretirane
s 5 M litijevim kloridom 30 min pri 37 oC.
24
U 15µL uzorka dobivenog supernatanta dodano je 5 µL reducirajućeg reagensa i

prokuhano 2-3 min. Nakon kuhanja, ukupni volumen uzorka je nanešen na 10 %-tni
poliakrilamidni gel. U svrhu uklanjanja površinskog sloja proteina (engl. “S-layer” proteins)
bakterijske stanice su tretirane s 5 M litijevim kloridom 30 min pri 37 oC.
SDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) je provedena postupkom prema
Laemmli-ju (1970) u komori za elektroforezu (Sigma), pri konstantnom naponu od 200 V
kroz 45 min. Bojanje gela na proteine provedeno je u 0,1 %-tnom metilenskom modrilu R-
250 s 50 % metanola i 7 % octene kiseline kroz najmanje 3 sata. Nakon bojenja, gel je
inkubiran u 7 %-tnoj octenoj kiselini do obezbojenja pozadine. Kao pozitivna kontrola
poslužio je S-layer protein izoliran s površine stanica probiotičkog soja L. helvecitus M92.
Nakon provedene SDS-PAGE elektroforeze proteinski profili različitih autohtonih izolta
BMK su međusobno uspoređeni pomoću programskog paketa Gel-Compar II, Applied Maths.
3.2.8. Ispitivanje osjetljivosti autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na Formatted: Font: Bold
različite antibiotike
Osjetljivost autohtonih izolata na antibiotike ispitana je metodom difuzije iz filter

diska u agar, pomoću komercijalno dostupnih diskova Oxoid (Basingstoke, Velika Britanija),
natopljenih određenom koncentracijom antibiotika. Osjetljivost svakog pojedinog autohtonog
izolata ispitana je na 12 različitih antibiotika tako da su obuhvaćene sve poznate skupine
antibiotika: ampicilin, bacitracin i, vankomicin kao inhibitori sinteze stanične stijenke;,
eritromicin, gentamicin, klindamicin, kloramfenikol, streptomicin i, tetraciklin kao inhibitori
sinteze proteina;; novobiocin i, rifampicin, kao inhibitori sinteze nukleinskih kiselina tei
azitromicin. Kolonije pojedinog izolata porasle na krutoj hranjivoj podlozi, (na MRS ili
GM17 hranjivomi agaru), inokulirane su prekonoćno uu tekuću hranjivu podlogu te
inkubirane preko noći pri temperaturi optimalnoj za određeni soj. Gustoća stanica u
prekonoćnoj kulturi određena je očitavanjem stupnja McFarland pomoću densitometra te je
podešena na istu vrijednost. 100µL. 100 ul dobivene suspenzije stanica je inokulirano u
otopljenu krutu hranjivu podlogu koja je potom razlivena u Petrijeve zdjelice. Na svaku sve
nacjepljene ploču podloges određenim autohtonim izolatom postavljeno je po šest filter
diskova, a zatim su podloge koje su zatim stavljenei na inkubaciju pri optimalnoj temperaturi
rasta. određenog autohtonog izolata. Nakon 24 sata inkubacije pri optimalnim uvjetima rasta
za pojedini autohtoni izolat, slijediloi je mjerenje promjera zona inhibicije, uključujući i
promjer diska. Rezultati (prosjek od 3 čitanja) su izraženi u milimetrima (Zhou i sur. 2005).
25
Amp N
B TE
E NV
C S
Cn P
Da
VA
Slika 7. Raspored nanošenja filter-diskova s antibioticima na hranjivu podlogu nacjepljenu

test-mikroorganizmom.
(Oznake antibiotika: Amp – ampicilin; B – bacitracin; C – kloramfenikol; Da – klindamicin;
Cn – gentamicin; E – eritromicin; N – neomicin; NV – novobiocin; P – penicilin G; VA –
vankomicin; S – streptomicin i TE – tetraciklin.
3.2.9. Ispitivanje preživljavanja bakterija u simuliranim uvjetima Formatted: Font: Bold, Croatian (Croatia)
Formatted ...
gastrointestinalnog trakta
Formatted: Font: Bold, Croatian (Croatia)
Simulirani želučani sok pripravljen je suspendiranjem pepsina (3 g/L) u 0,5% sterilnoj Formatted ...
otopini natrijevog klorida, kojoj je pH podešen na 2 koncentriranom kloridnom kiselinom.

Simulirani sok tankoga crijeva pripravljen je suspendiranjem pankreatina (1 g/L), samog ili Formatted ...
sa i žučnihm solima (3,0 mg/mL goveđe žuči) u 0,5% sterilnoj otopini natrijeva klorida, kojoj
je pH podešen na 8,0 s natrijevom lužinom.
26
Prekonoćna kultura pojedinog autohtonog izolata BMK centrifugirana je pri 3300 g/10 min Formatted ...
i dva puta isprana sa sterilnom fiziološkom otopinom. Priređena suspenzija bakterijskih

stanica (1 mL) dodana je u simulirani sok želuca ili tankoga crijeva (4 mL) (sa ili bez dodatka
žučnih soli). Broj živih stanica određivan je u simuliranom soku želuca tijekom 2 sata, a u
simuliranom soku tankoga crijeva tijekom 43 sata, indirektnom metodom.
3.2.10. Preživljavanje probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije Formatted: Font: Bold, Croatian (Croatia)
Formatted ...
Bakterijske kulture uzgojene su u MRS hranjivoj podlozi. Nakon toga smo ihu Formatted ...
centrifugiraline na 3300 okretaja/10 min. Nakon centrifugiranja hranjiva podloga je odbačena,

smo te smo biomasu stanica resuspendirali u 500 μL fiziološke otopine (0,9% NaCl). Biomasi
stanica smo zatim dodali 5%-tnu otopinu inulina odnosnoi obranog mlijeka u prahu kao
lioprotektore tei fosfatni pufer pH 6 koji je služio kao kontrola. Tako priređene suspenzije
stanica zamrznuli smo pri na – 820°C preko noći, a zatim liofilizirali u liofilizatoru. Broj živih
stanica (CFU/mL) smo određivali prije i nakon liofilizacije indirektnom metodom kako je
opisano u točci 3.2.11. (Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom).
U eksperimentima ispitivanja preživljavanja mikroinkapsuliranih i liofiliziranih
mikroinkapsuliranih stanica bakterija u različitim nosačima (alginat, karagenan i kazein),
preživljavanje imobiliziranih kultura u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta,
uspoređeno je s preživljavanjem biomase kultura probiotičkih sojeva koje nisu
mikroinkapsulirane odnosno liofilizirane.
3.2.11. Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom
Iz uzorka koji sadrži bakterijske stanice pripremljena su decimalna razrjeđenja u Formatted: Indent: First line: 0.5"
sterilnoj destiliranoj vodi. MRS hranjiva podloga u Petrijevoj zdjelici nacijepljena je sa 100
μL petog, šestog, i sedmog i osmog decimalnog razrjeđenja. Nakon 48 h inkubacije pri 37°C
izbrojane su izrasle kolonije i proračunat je broj živih stanica po mililitru uzorka.
27
4. REZULTATI
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Rezultati
4.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
kiseline u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta
Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
Da bi se neki mikroorganizam mogao definirati kao probiotik mora ispuniti opće, Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
funkcionalne i tehnološke zahtjeve. Iako BMK karakterizira GRAS (engl. Generally
Recognisedegarded As Safe) status, pri odabiru sojeva za daljnja ispitivanja njihovih Formatted: Font: Bold
funkcionalnih svojstava, neophodno je provesti ispravnu taksonomsku identifikaciju soja, te
ispitati osjetljivost na pojedine antibiotike, kako bi se spriječila mogućnost širenja antibiotičke Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
rezistencije. Povećana primjena antibiotika u terapijske svrhe, te za poticanje rasta životinja Formatted: Font: Bold
na farmama, utjecala je na širenje antibiotičke rezistencije. Odabrani autohtoni izolati su
identificirani kao predstavnici rodova BMK, a da bi se potvrdila sigurnost odabranih Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
autohtonih izolata s aspekta antibiotičke rezistencije, u ovom radu je ispitana i osjetljivost na Formatted: Font: Bold
određene antibiotike metodom difuzije u agaru s filter diskovima. Rezultati su prikazani u
tablici 6 ite za autohtoni izolat BGAL1-1 na slici 9. U tablici 7 je radi usporedbe prikazana Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
osjetljivost probiotičkih starter kultura okarakteriziranih u Laboratoriju za tehnologiju Formatted: Font: Bold
antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta. Formatted: Font: Bold
Odabrane autohtone BMK su osjetljive na većinu ispitivanih antibiotika, no uočen je Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
izostanak zone inhibicije kod rasta pojedinih sojeva prilikom inkubacije u prisutnosti, na
vankomicina, neomicina i streptomicina. Formatted: Font: Bold
Iz uzoraka tradicionalno proizvedenihog sirevaa, izolirane su, s visokog razrjeđenja, na Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
MRS ili GM17 hranjivoj podlozi, autohtono prisutne BMK. Ispitan je rast odabranih bakterija
u aerobnim i anaerobnim uvjetima, te su definirane njihove optimalne temperature rasta Formatted: Font: Bold
(Tablica 3.). Učinkovito spuštanje pH vrijednosti, kao rezultatuslijed sinteze mliječne kiseline Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
kao primarnog metabolita BMK, nakon prekonoćnog uzgoja u optimalnoj hranjivoj podlozi za
uzgoj, također je karakteristika koja doprinosi fiziološkoj karakterizaciji BMK, a koja je
važnao s aspekta antimikrobnog djelovanja ovih bakterija. U tablici 3 su navedene pH
vrijednosti određene u supernatantu kulture pojedinog autohtonog izolata nakon prekonoćnog
uzgoja u tekućoj hranjivoj podlozi pri optimalnim uvjetima uzgoja.
Autohtone BMK koje su uspješno izrasle na MRS hranjivimoj podlogamazi, bojane su po
Gramu. Prisutnost enzima katalaze kod pojedinog bakterijskog izolata ispitana je katalaza
testom, te je provedena KOH metoda, kako bi se potvrdilo da su izolirani sojevi gram-
pozitivni, zatim je napravljen test sporogenosti i određivanje homofermentativnosti odnosno
heterofermentativnosti (Tablica 4.).
28
Smatra se da su i svojstva površine stanica izoliranih sojeva bakterija mliječnih kiselina

važna za njihovu probiotičku aktivnost. Poznato je da proteini prisutni s vanjske strane
stanične stijenke bakterija, poput S-layer proteina, imaju funkcionalnu ulogu kod nekih
probiotičkih sojeva kao što je L. helveticus M92 otprije definiran kao probiotik (Beganović i Formatted: Croatian (Croatia)
sur., 2011). Biološka uloga površinskih proteina bakterija mliječnih kiselina iz roda Formatted: Croatian (Croatia)
Lactobacillus nije u potpunosti razjašnjena, ali su istraživanja ukazala na važnost ovih

proteina za preživljavanje nepovoljnih uvjeta u GIT. Nadalje, S-layer proteini mogu biti
uključeni u ekskluziju patogena i imunomodulaciju domaćina, kojišto su sve važna
funkcionalna svojstva probiotičkih sojeva. Stoga je u ovom radu provedena i SDS-PAGE
elektroforeza površinskih proteina izoliranih bakterijskih sojeva gdje je kao pozitivna kontrola
upotrebljen proteinski profil probiotičkog soja L. helveticus M92, za koji se zna da posjeduje
S-layer protein (Kos i sur.; 2003, Frece i sur., 2005, Beganović i sur., 2011), te su dobiveni Formatted: Croatian (Croatia)
proteinski profili međusobno uspoređeni pomoću Gel-Compar II programskog paketa,
Applied Maths, St-Materns-Latem, Belgija (Slika 8.). Formatted: Croatian (Croatia)
Da bi neki probiotički soj mogao kolonizirati GIT, te iskazati pozitivne učinke na zdravlje Formatted: Croatian (Croatia)
domaćina, mora preživjeti nepovoljne uvjete u GIT-u i adhezirati se na epitelne stanice GIT-a.
Glavnu prepreku njihovom preživljavanju čine niske pH vrijednosti u želucu, probavni enzimi Formatted: Croatian (Croatia)
i žučne soli. U ovom radu je glavni selekcijski kriterij pri odabiru autohtonih izolata BMK za Formatted: Croatian (Croatia)
daljnja ispitivanja potencijalnih probiotičkih sojeva bilo preživljavanje sojeva tijekom

direktnog prijelaza iz simuliranog želučanog soka pH-vrijednosti 2 u simulirani sok tankog
crijeva gdje se izlučuje sok gušterače i žuč (Tablica 8; Slika 10.). Većina odabranih sojeva je
osjetljiva na nepovoljne uvjete GIT-a in vitro, no pojedini bakterijski sojevi koji rastu na MRS
hranjivoj podlozi, koja je optimalna podloga za laktobacile, su pokazali visok stupanj
preživljavanja: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3 (Tablica 8.) Uočeno
je da preživljavanje kolonija koje rastu na GM17 hranjivoj podlozi, koja je optimalna podloga
za rast laktokoka, bilo slabije, jer je smrtnost stanica izražena kao log CFU/mL bila puno
veća (Tablica 8.).
29
Tablica 3. Autohtone bakterije mliječne kiseline (BMK), optimalni uvjeti uzgoja te pH

vrijednosti postignute nakon prekonoćnog uzgoja pri navedenim uvjetima.
Autohtoni izolati Hranjiva

Uvjeti uzgoja pH
BMK podloga
BGGO7-28 GM17 30°C, anaerobno 4,92
BGAL1-1 GM17 30°C 4,81
BGLE1-6 GM17 30°C, anaerobno 4,88
BGGO5-3 MRS 30 °C, anaerobno 4,24
BGGO5-7 MRS 30 °C, anaerobno 4,6
BGGO5-47 MRS 30°C, anaerobno 4,36
ZG1-54 MRS 37°C 5,01
ZG2-25 MRS 30°C 4,01
ZG3-17 MRS 30°C, anaerobno 4,72
ZG5-9 GM17 30°C 4,8
30
Tablica 4. Karakterizacija Lactobacillus i Enterococcus vrsta autohtono prisutnih u siru

pomoću klasičnih mikrobioloških metoda.
Autohtoni
KOH Bojanje po Test
izolati Katalaza test
metoda Gramu sporogenosti
BMK
BGGO7-28 G+ G+ Katalaza-negativna Nesporogena
BGAL1-1 G+ G+ Katalaza-negativna Nesporogena
BGLE1-6 G+ G+ Katalaza-negativna Nesporogena
ZG1-54 G+ G+ Katalaza-negativna Nesporogena
G +, Gram-pozitivna bakterija Formatted: Indent: First line: 0.49"
31
Tablica 5. Identifikacija autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline sekvencioniranjem 16S

rRNA gena.
Autohtoni izolati
16S identifikacija (UNIR, UNIF)
BMK
BGGO7-28 Lactobacillus sucicola/uvarum/capillatus
BGAL1-1 Lactococcus lactis
BGLE1-6 Lactococcus lactis subsp. lactis
BGGO5-3 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum
BGGO5-7 Lactobacillus casei
BGGO5-47 Lactobacillus rhamnosus
ZG1-54 Enterococcus faecium
ZG2-25 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum
ZG3-17 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum
ZG3-18 Lactobacillus plantarum/pentosus
ZG4-14 Leuconostoc mesenteroides/pseudomesenteroides
ZG5-9 Lactococcus lactis
32
Slika 8. SDS-PAGE površinskih proteina autohtonih BMK izoliranih iz tradicionalno

proizvedenih sireva.
33
Tablica 6. Određivanje osjetljivosti ispitivanih autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na predstavnike različitih skupina antibiotika. Formatted: Croatian (Croatia)
Ampicilin Bacitracin Kloramfenikol Klindamicin Eritromicin Gentamicin Neomicin Novobiocin Penicilin G Vankomicin Streptomicin Tetraciklin
Autohtoni (Amp) (B) (C) (DA) (E) (CN) (N) (NV) (P) (VA) (S) (TE)Formatted: Croatian (Croatia)
izolati 10 μg 10 units 30 μg 2 μg 15 μg 120 μg 10 μg 5 μg 10 units 30μg 10 μg 30 μg
BMK Promjer zona inhibicije (mm) Formatted: Croatian (Croatia)
BGGO7-28 26,5 23,5 28 27,5 29 21 7 18,5 29,5 0 0 34,5Formatted: Croatian (Croatia)
BGAL1-1 27 27 29 27,5 29 24 13,5 22,5 33 22 13,5 33Formatted: Croatian (Croatia)
BGLE1-6 27 24 29 26,7 26 21,3 13 23,3 24,7 17,7 11,7 31,7
BGGO5-3 35 8 24 12 22 13 0 13 28 0 0 15
BGGO5-7 18 13 24 26 30 14 0 17 25 0 0 31
BGGO5-47 22 6 23 18 21 14 0 15 29 0 0 29
ZG1-54 26 11 16 12 11 10 0 20 25 21 0 27Formatted: Croatian (Croatia)
ZG4-14 25 13 23 27 24 18 9 10 32 0 0 27
ZG5-9 30 24 29 29 29 23 14 25 33 21 9 36
34
Tablica 7. Određivanje osjetljivosti probiotičkih i starter kultura na pojedine predstavnike različitih skupina antibiotika. Formatted: Croatian (Croatia)
Ampicilin Bacitracin Kloramfenikol Klindamicin Eritromicin Gentamicin Neomicin Novobiocin Penicilin G Rifampicin Streptomicin Tetraciklin
(Amp) (B) (C) (DA) (E) (CN) (N) (NV) (P) (RD) (S) (TE)
Bakterije mliječne
10 μg 10 units 30 μg 2 μg 15 μg 120 μg 10 μg 5 μg 10 units 5 μg 10 μg 30 μg
kiseline
Promjer zona inhibicije (mm)
L. acidophilus
18 17 22 26 23 14 0 11 14 19 0 15
ATCC 4365
L. helveticus
30 24 28 20 27 15 0 14 28 19 12 30
M92
L. plantarum
23 7 21 17 23 8 0 14 27 16 0 14
L4
E. faecium
23 14 0 0 0 13 0 14 20 11 0 35
L3
L. mesenteroides
18 0 16 16 15 0 0 12 22 17 0 13
LMG 7954
L. rahmnosus
20 10 23 19 26 13 0 16 20 22 0 26
GG
35
Slika 9. Osjetljivost autohtonog izolata Lactococcus lactis BGAL1-1 na antibiotike: Formatted
neomicin, novabiocin, penicilin, rifamipicn, streptomicin i tetraciklin.
36
Tablica 8. Preživljavanje kolonija poraslih na MRS i GM17 hranjivoj podlozi u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta (GIT) (direktan
prijelaz iz simuliranog želučanog soka u simulirani sok tankog crijeva).
Prijelaz iz želučanog soka Autohtoni izolati BMK / (CFU/mL)

(pH 2, t = 2 h) u sok BGGO BGAL BGLE BGGO BGGO BGGO ZG ZG ZG ZG ZG ZG
tankog crijeva (t = 4h, 6h) 7 - 28 1-1 1-6 5-3 5-7 5 - 47 1 - 54 2 - 25 3 - 17 3 - 18 4 - 14 5-9
Želučani sok (0 h)
1,11·107 5,60·107 5,96·107 1,87·109 4,86·108 6,37·108 5,5·107 4,32·108 1,4·108 1,14·108 2,15·108 1,13·1010
Želučani sok (2h)
0 2,83·107 4,67·106 3,5·107 9,66·105 7,75·106 3,55·105 8,45·107 7,21·105 2,33·107 2,59·106 4,56·105
Sok tankog crijeva (4h)
0 2,29·107 3,62·106 1,54·105 6,5·104 3,11·104 2,72·105 1,53·107 5,6·105 7,71·106 3,6·105 8,36·104
Sok tankog crijeva (6 h)
0 1,00·106 2,53·106 1,2·105 0 0 1,94·105 5,05·106 5,41·105 1,51·106 1,36·105 4,56·104
Smrtnost stanica
7,05 2,75 1.38 4,19 8,69 8,80 2,45 1,94 2,42 1,88 3,2 5,39
logCFU/ml (0h – 6h)
37
Slika 10. Preživljavanje autohtonih izolata BMK tijekom direktnog prolaska iz simuliranog
želučanog soka (pH=2) u simulirani sok tankog crijeva.
38
4.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
Formatted ...
autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije
Formatted ...
U prvom redu provedena je liofilizacija probiotičkih sojeva L. helveticus M92, L. Formatted ...
plantarum L4 i E. faecium L3 (Slika 11.-13.). Ti Bbakterijski sojevi L. helveticus M92, L.

plantarum L4 i E. faecium L3 definirani su kao probiotički sojevi prema strogim izbornim
probiotičkim kriterijima u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter
kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Osim njihove primjene,
kao funkcionalnih starter kultura u različitim fermentiranim proizvodima, istražuje se i njihov
bioterapijski učinak kao živih lijekova.
Stoga je biomasa bakterijskih stanica resuspendirana u fosfatnom puferu (PBS) i u 5%- Formatted ...
tnim otopinama različitih lioprotektora. Kao lioprotektori korišteni su obrano mlijeko u prahu,
inulin i raftilozaoligosaharidi. Postotak preživljavanja probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije
određen je uz nakon primjeneu obranog mlijeka, inulina i raftiloze oligosaharida kao
lioprotektora, te u slučaju kada je umjesto lioprotektora dodan korišten fosfatni pufer pH 6.
Kao najučinkovitiji lioprotektori za probiotički soj L. helveticus M92 tijekom liofilizacije, a
na temelju rezultata preživljavanja, pokazali su se obrano mlijeko i inulin (Slika 11.). Sličnio
rezultati su dobiveni i za probiotički soj L. plantarum L4 (Slika 12.), dok je za soj E. faecium
L3 preživljavanje nakon liofilizacije bilo najuspješnije kada je liofilizacija provedena uz
dodatak obranog mlijeka (Slika 13.).
Ispitan je i protektivni učinak obranog mlijeka nakon godinu dana čuvanja liofiliziranih Formatted ...
kultura L. helveticus M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3. Broj poraslih kolonija određen na
MRS hranjivom agaru iznosio je iznad 107 CFU/mL, što je iznad broja stanicavrijednosti
kojai je definirana za probiotičke sojeve kao minimalnaan za iskazivanje pozitivnih učinaka
na zdravlje domaćina (Tablica 9.).
Nadalje, su odabrani su autohtoni izolati BMK, koji pokazuju najbolje karakteristike s Formatted ...
probiotičkog aspekta -, BGGO7-28, BGAL1-1, BGAL1-1, BGG05-3, BGGO5-7, ZG1-54,

ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG5-9, a zatim te je provedena liofilizacija svježe
biomase njihovih stanica uuz korištenje lioprotektora lioprotektorima,, obranom mlijeku,
inulinu i raftilozi, koji su se pokazali kao najučinkovitiji za probiotičke sojeve L. helveticus
M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3, - obranog mlijeka, inulina i oligosaharida, te uz
fosfatnom fosfatni puferu pH 6 koji je služio, kao kontrola (Tablice 10.-13.) Preživljavanje je
bilo za svih dvanaest autohtonih BMK uspješnije kada su odabrani sojevi liofilizirani u
39
obranom mlijeku, inulinu ili u oligosaharidu u usporedbi s rezultatima dobivenim nakon Formatted: Croatian (Croatia)
liofilizacije u fosfatnom puferu. No uočeno je da je preživljavanje autohtonog izolata BGLE1-
6 osobito bilo osobito poboljšano uz dodatak prebiotika inulina. Formatted: Croatian (Croatia)
Slika 11. Preživljavanje (%) probiotičkog soja L. helveticus M92 nakon liofilizacije s Formatted: Croatian (Croatia)
različitim lioprotektorima. Formatted: Croatian (Croatia)
40
Slika 12. Preživljavanje (%) probiotičkog soja L. plantarum L4 nakon liofilizacije s različitim Formatted: Croatian (Croatia)
lioprotektorima. Formatted: Croatian (Croatia)
41
Slika 13. Preživljavanje (%) probiotičkog soja E. faecium L3 nakon liofilizacije s različitim Formatted: Croatian (Croatia)
lioprotektorima. Formatted: Croatian (Croatia)
Tablica 9. Preživljavanje probiotičkih sojeva nakon liofilizacije u obranom mlijeku tijekom

12 mjeseci čuvanja pri 4 C.
Vrijeme pohrane (mjeseci )/ CFU/g

Probiotički soj
0 3 6 9 12
L. helveticus M92 2.51·1010 9.41·109 8.84·108 5.06·108 1.06·108
L. plantarum L4 1.87·1010 3.55·109 2.96·108 1.14·108 7.36·107
E. faecium L3 9.98·1010 3.24·109 1.84·108 4.35·108 3.84·107
42
Tablica 10. Preživljavanje izoliranih bakterijskih sojeva nakon procesa liofilizacije s

dodatkom obranog mlijeka u prahu kao lioprotektora.
Autohtoni izolati Prije liofilizacije Poslije liofilizacije

BMK (CFU/mL) (CFU/mL)
BGGO7-28 1,1·1011 1,6·1010
BGAL1-1 3,73·109 3,8·109
BGLE1-6 2,6·1010 6,1·109
BGG05-3 2,8·1010 1,2·108
10
BGGO5-7 5,5·10 1,2·109
10
BGGO5-47 4,14·10 4,1·108
ZG1-54 5,3·109 1,9·109
ZG2-25 1,121010 1,23·1010
ZG3-17 2,7·109 3,7·109
ZG3-18 1,02·1010 4,6·109
ZG4-14 1,9·1010 1,5·108
10
ZG5-9 2,6·10 6,4·109

dodatkom inulina kao lioprotektora.

BGGO7-28 1,3·1011 1,7·109
10
BGAL1-1 1,37·10 5,7·109
9
BGLE1-6 7,2·10 5,5·109
BGG05-3 8·1010 7,7·108
BGGO5-7 3,9·1010 1·108
43
BGGO5-47 1,64·1010 1,9·108

9
ZG1-54 3,32·10 1,02·109
9
ZG2-25 8,84·10 8,87·109
9
ZG3-17 2,9·10 2,98·109
ZG3-18 1,02·1010 4,6·109
ZG4-14 1·1010 7·109
10
ZG5-9 6,03·10 7·109

dodatkom oligosaharida (Raftilose P95) kao lioprotektora.

BGGO7-28 3,66·1011 5,75·108
BGAL1-1 5,63·109 3,80·108
9
BGLE1-6 9,10·10 6,11·108
BGG05-3 3,78·1011 1,52·109
BGGO5-7 1,38·1010 2,26·109
10
BGGO5-47 3,65·10 9,80·108
ZG1-54 8,60·109 2,83·108
11
ZG2-25 2,71·10 3,55·1010
9
ZG3-17 1,62·10 3,77·108
ZG3-18 7,20·109 8,54·108
ZG4-14 1,35·1010 9,60·108
10
ZG5-9 2,60·10 2,71·109
Tablica 13. Preživljavanje izoliranih bakterijskih sojeva nakon procesa liofilizacije u

fosfatnom puferu pH 6.

BGGO7-28 1,1·1011 1,05·109
BGAL1-1 3,9·1010 3,1·108
BGLE1-6 6,1·109 7,2·108
BGG05-3 1,23·1010 4,7·108
10
BGGO5-7 4,52·10 1,04·1010
BGGO5-47 2,2·1010 9,23·109
44
ZG1-54 9,3·109 1,2·109

10
ZG2-25 1,27·10 8,5·109
9
ZG3-17 5,2·10 1,63·109
9
ZG3-18 9,8·10 2,95·109
ZG4-14 1,13·1010 5,6·109
ZG5-9 2,14·1010 9,8·109
45
5. RASPRAVA
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Rasprava
5.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne Formatted: Font: Bold
kiseline u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta
Crijevna mikroflora ljudskog gastrointestinalnog sustava sadrži preko 500 različitih Formatted: Font: Bold
bakterijskih vrsta u ukupnoj masi od 1,2 kg. Sudionici crijevne mikroflore mogu imati
pozitivne, ali uslijed narušavanja ravnoteže ovog ekosustava i negativne učinke na ljudsko Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
zdravlje. Upravo primjenom probiotika može se ponovno uspostaviti njena narušena Formatted: Font: Bold
ravnoteža. Probiotici su definirani kao jedna ili više živih stanica mikroorganizama koji Formatted: Font: Bold
primijenjeni u ljudi i životinja djeluju korisno na domaćina poboljšavajući svojstva autohtone Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
crijevne mikroflore (Šušković, 2001). Većina probiotika potječu iz rodova bakterija mliječne
kiseline, a najčešće iz roda Lactobacillus. Današnja populacija svjesna je važnosti ispravne Formatted: Font: Bold
prehrane, pa postoji veliki interes primjene probiotika kao funkcionalnih dodataka hrani, Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
osobito u fermentiranim mliječnim proizvodima (Capela i sur., 2006; Šušković, 2009). U
ovom je radu izolirano 12 sojeva BMK koji su ispitani u okviru probiotičkog koncepta. Formatted: Font: Bold
Najprije je ispitana acidifikacija ispitana nakon prekonoćnog uzgoja u optimalnim hranjivim Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
podlogama te je ustanovljeno da autohtone BMK uspješno spuštaju pH vrijednost podloge što
upućuje na njihov rast i sintezu mliječne kiseline (Tablica 3.). Formatted: Font: Bold
Primjena probiotika, bilo kao funkcionalnih dodataka hrani ili u svrhu njihove
primjene kao bioterapeutika, zahtjeva njihovu ispravnu fenotipsku i genotipsku Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
karakterizaciju (Kos i sur., 2008). Tradicionalne mikrobiološke metode poput bojanja po Formatted: Font: Bold
Gramu ili rasta na selektivnim hranjivim podlogama mogu poslužiti kao temelj primarne
karakterizacije bakterija, stoga su provedeni eksperimenti koji obuhvaćaju osnovne Formatted: Font: Bold, Portuguese (Brazil)
mikrobiološke metode, a koje su potvrdile da su svi korišteni sojevi gram-pozitivne, katalaza- Formatted: Font: Bold
negativne i nesporogene bakterije (Tablica 4.). Provedena je i genotipska identifikacija
autohtonih sojeva BMK sekvencioniranjem 16S rRNA gena, a dobiveni rezultati prikazani su Formatted: Font: Bold, Not Italic
u tablici 5. SDS – PAGE elektroforeza površinskih staničnih proteina je pokazala da su svi

sojevi međusobno različiti (Slika 8.).
Iako BMK karakterizira GRAS (engl. Generally Regarded As Safe) status, pri odabiru
sojeva za daljnja ispitivanja njihovih funkcionalnih svojstava, osim ispravne taksonomske
identifikacije soja, neophodno je ispitati osjetljivost na pojedine antibiotike, kako bi se
spriječila mogućnost širenja antibiotičke rezistencije. Povećana primjena antibiotika u
terapijske svrhe, te za poticanje rasta životinja na farmama, utjecala je na širenje antibiotičke
rezistencije. Odabrani autohtoni izolati su identificirani kao predstavnici rodova BMK, a da bi
44
se potvrdila sigurnost odabranih autohtonih izolata s aspekta antibiotičke rezistencije, u ovom

radu je ispitana i osjetljivost na određene antibiotike metodom difuzije u agaru s filter
diskovima.
Ako su definirani kao probiotici ili kao probiotičke starter kulture cCiljno mjesto
djelovanja sojeva koji su definirani kao probiotici ili kao probiotičke starter kulture je GIT
trakt, gdje odabrani sojevi stupaju u interakciju s mikrobnom populacijom GIT domaćina, a
gdje zbog prisutnosti velikog broja mikroorganizama lako dolazi do prijenosa gena
odgovornih za antibiotičku rezistenciju. Zbog toga je ispitivanje osjetljivosti potencijalnih
probiotičkih sojeva na antibiotike dio općih izbornih kriterija u okviru strogo definiranog
probiotičkog koncepta (Šušković i sur., 2001). U ovom radu je korištena metoda difuzije u
agaru s filter diskovima. Budući da je posljednjih nekoliko godina došlo do naglog širenja
antibiotičke rezistencije, nakon uspješne identifikacije prema kojoj su svi autohtoni izolati
dokazani kao predstavnici rodova BMK, ispitana je njihova i osjetljivost probiotičkih sojeva
iz Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, Prehrambeno-
biotehnološkog fakulteta, kao i odabranih autohtonih sojeva na određene antibiotike, a istoj
su metodi podvrgnuti i probiotički sojevi iz Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima,
probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta (Tablica 6.). Većina
autohtonih sojeva je osjetljiva na predstavnike različitih skupina antibiotika, no prema
rezultatima uočena je rezistencija sojeva iz roda Lactobacillus na vankomicin. Mnoge
bakterije iz roda Lactobacillus imaju urođenu rezistenciju na vankomicin pri čemu se, geni za
rezistenciju nalaze se na genomu. U tom slučaju se rezistencija, stoga se ne može prenijeti
prenosi na druge bakterijske sojeve, kao što to može biti slučajse to može dogoditi kod nekih
vankomicin - rezistentnih vrsta iz roda Enterococcus. Naime, smatra se da su
peptidoglikanske strukture kod laktobacila odgovorne za visoku rezistenciju na glikopeptidne
antibiotike (Flórez i sur., 2005). Također je uočen izostanak zone inhibicije rasta odabranih Formatted: Font: Not Italic
sojeva na neomicin i streptomicin. To su aminoglikozidni antibiotici koji su osjetljivi na

kisele pH vrijednosti, stoga je sintetizirana mliječna kiselina koju proizvode BMK vjerojatno
utjecala na degradaciju ovih antibiotika. Slični rezultati su dobiveni ispitivanjem
osjetljivostiih probiotičkih sojeva dobivenih u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima,
probiotika i starter kultura, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta (Tablica7.). Iako Pošto je Formatted: Font: Not Italic, Font color: Black
soj E. facium L3 pokazao rezistentnost na kloramfenikol, klindamicin, eritrocin i neomicin, Formatted: Font color: Black
Formatted: Font: Not Italic, Font color: Black
trebalo bi te bi trebalo PCR metodom dodatno provjeriti PCR metodom da li su te rezistencije
prenosive na druge bakterijske sojeve. Formatted: Font color: Black
45
Da bi polučili željene pozitivne učinke na zdravlje, probiotički pripravci moraju

sadržavati žive mikrobne stanice u koncentracijama višim od 106 po gramu proizvoda (Shah,
2007). Stoga je potrebno ispitati preživljavanje odabranih sojeva u GIT. Glavnu prepreku pri
prolasku mikroorganizama kroz želudac čine niska pH-vrijednost i pepsin. pH-vrijednost
želučanog soka, kada se izluči, iznosi oko 2, a udio soli oko 0,5 % , dok je vrijeme
zadržavanja u želucu oko 90 min (Kos, 2001; Lebeer i sur., 2008). Dakle, da bi se neki
mikroorganizam mogao primijeniti kao probiotik i korisno djelovati na zdravlje domaćina,
glavni je izborni kriterij preživljavanje u GIT-u.
Ispitano je preživljavanje autohtonih BMK tijekom direktnog prelaska iz simuliranog Formatted: Font: Not Italic
želučanog soka, pri pH-vrijednosti 2 u simulirani sok tankog crijeva (simulirani sok gušterače
uz dodatak goveđe žuči), tijekom šest sati. Većina odabranih sojeva je osjetljiva na
nepovoljne uvjete GIT in vitro, no pojedini bakterijski sojevi su pokazali visok stupanj Formatted: Font: Not Italic
preživljavanja: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3 , BGLE1-6, BGAL1-

1 i ZG5-9 (Tablica 8.) Uočeno je da je preživljavanje kolonija koje rastu na GM17 hranjivoj
podlozi, koja je optimalna većinom za rast laktokokae, bilo slabije, jer je smrtnost stanica
izražena kao log CFU/mL bila puno veća (Tablica 8.).
46
5.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i Formatted: Font: Bold, Not Italic, Portuguese (Brazil)
Formatted ...
autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije
Formatted ...
Uspješnost primjene probiotika ovisi i o tehnologiji proizvodnje probiotičkog Formatted ...
pripravka. Liofilizacija se smatra jednom od najučinkovitijih tehnologija za proizvodnju

metabolički aktivnih probiotičkih kultura s aspekta postotka preživljavanja i funkcionalnosti
(Otero i sur., 2007, Pekhonen sur, 2008).
Stoga je, istraženo ispitano preživljavanje tri probiotička soja prethodno istražena u okviru Formatted ...
probiotičkog koncepta u u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter

kultura tijekom liofilizacije uz primjenuom različitih lioprotektora. Rezultati pokazuju kako
preživljavanje probiotičkih stanica L. helveticus M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3 može
biti poboljšano uz dodatakk odgovarajućeg tipa i koncentracije ugljikohidrata, ali osobito uz
dodatak obranog mlijeka. Naime, pPreživljavanje probiotičkih stanica nakon liofilizacije
znatno je poboljšano kada je biomasa probitičkih stanica neposredno prije liofilizacije
suspendirana u obranom mlijeku
(Slike 11.-13.). To je posljedica zaštitnog utjecaja obranog mlijeka koje sprječava lizu Formatted ...
bakterijskih stanica, stabiliziranjem sastojaka stanične membrane, stvarajući poroznu

strukturu liofiliziranog proizvoda, što olakšava rehidrataciju, te sadrži proteine koji služe kao
zaštitni sloj stanice (Kos i sur., 2000; Kos, 2001, Carvalho i sur, 2004). No, liofilizacija
stanica probiotičkih sojeva L. helveticus M92 i L. plantarum L4 uz dodatak preobiotika
inulina pokazala se najučinkovitijom (Slike 11. i 12). Šećeri laktoza i saharoza, kao i sorbitol
pozitivno utječu na preživljavanje stanica prilikom liofilizacije (Slika 11. i 13.). Takvi
krioprotektori akumuliraju se unutarstanično te doprinose smanjenju osmotskog tlaka između
bakterijske stanice i vanjskog mikrookoliša, čime se sprječava liza stanica ( Capela i sur.,
2006). Zaštitni učinak obranog mlijeka tijekom 1 godine čuvanja liofiliziranih stanica L.
helveticus M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3 pri 4ºC je prikazan u tablici 9.
Preživljavanje Broj stanica u tomnakon tog periodau pri 4 ºC je 107 CFU/mL, čime je
ispunjen zahtjev za minimalnim potrebnim brojem metabolički aktivnih stanica u
probiotičkim pripravcima.
Ispitani probiotički sojevi preživjeli su u visokom broju tijekom perioda čuvanja, no
preživljavanje liofiliziranih kultura L. plantarum L4 i E. faecium L3 se pokazalo nešto
slabijim u odnosu na preživljavanje liofilizirane kulture L. helveticus M92. Ova razlika u
preživljavanju može se pripisati razlikama u strukturi stanične ovojnice, budući da probiotički
soj L. helveticus M92 sadrži površinski parakristalni S-sloj (Frece i sur., 2005) koji se smatra
47
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Rasprava Formatted ...
Formatted ...
odgovornim za selektivne prednosti tijekom preživljavanja ove bakterije u Formatted ...
gastrointestinalnom traktu, a koji ujedno sudjeluje i u procesu adhezije (Kos i sur., 2001.; Formatted ...
Formatted ...
Frece 2003.; Frece i sur., 2005). U prethodnim istraživanjima ustanovljeno je slabije
Formatted ...
preživljavanje stanica L. helveticus M92 tijekom liofilizacije nakon uklanjanja površinskog S- Formatted ...
sloja (Kos i sur., 2008). Mnogi autori istražuju učinak različitih lioprotektora, osobito izvora Formatted ...
Formatted ...
ugljika, na preživljavanje bakterija mliječne kiseline tijekom procesa liofilizacije (Capela i
Formatted ...
sur., 2006; Anal i Singh, 2007; Siaterlis i sur., 2009), pa će u skladu s tim daljnja istraživanja Formatted ...
biti usmjerena na ispitivanje učinka različitih ugljikohidrata, prvenstveno prebiotika, na Formatted ...
Formatted ...
preživljavanje probiotičkih kultura tijekom liofilizacije. Formatted ...
Stoga su odabrani autohtoni izolati BMK, koji su pokazali nabolje preživljavanje u Formatted ...
Formatted ...
stimuliranim uvjetima GIT-a: BGGO7-28, BGAL1-1, BGLE1-6, BGGO5-3, BGGO5-7,
Formatted ...
BGGO5-47, ZG1-54, ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14 i, ZG5-9, te je provedena Formatted ...
liofilizacija svježe biomase njihovih stanica uz dodatak lioprotektora -: obranog mlijeka, Formatted ...
Formatted ...
inulina i oligosaharida, dok je . A lliofilizacija stanica suspendiranih u fosfatnom puferu pH
Formatted ...
6,je poslužila kao kontrola (Tablice 10.-13.). Preživljavanje je bilo za svih dvanaest Formatted ...
autohtonih BMK uspješnije kada su odabrani sojevi liofilizirani u obranom mlijeku ili u Formatted ...
Formatted ...
inulinu, u usporedbi s rezultatima dobivenim nakon liofilizacije u fosfatnom puferu. No,
Formatted ...
uočeno je da je preživljavanje autohtonog izolata BGLE1-6 osobito bilo poboljšano uz Formatted ...
Formatted ...
dodatak prebiotika inulina, izolata BGGO5-3 uz dodatak prebiotika oligosaharida, a izolata
Formatted ...
BGAL1-1 i ZG3-17 uz dodatak obranogm mlijekua. Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
48
6. ZAKLJUČCI
DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Zaključci
1. Metodom difuzije s filtera u agar potvrđeno je da su svi autohtoni izolati BMK

osjetljivi na 12 ispitanih antibiotika te su, stoga sigurni s aspekta kontrole širenja
antibiotičke rezistencije. Kod pojedinih sojeva uočena je rezistentncija na vankomicin,
no radi se o urođenoj rezistenciji Lactobacillus vrsta, koja se nalazi na genomskoj
DNA, pa nema opasnosti od transfera gena odgovornih za tu rezistenciju.
2. Autohtoni sojevi, identificirani kao Lactobacillus pentosus / paraplantarum / Formatted: Croatian (Croatia)
plantarum BGGO5-3, ZG2-25 i ZG3-17 najbolje preživljavaju u simuliranim uvjetima
gastrointestinalnog sustava. Formatted: Croatian (Croatia)
3. Autohtoni izolati BMK, odabrani na temelju in vitro testa simuliranih
gastrointestinalnih uvjeta,, preživljavaju proces liofilizacije u većem broju kad su
prisutni lioprotektori obrano mlijeko, inulin i oligosaharidi. Izolat Lactococcus lactis
subsp. lactis BGLE1-6 preživljava bolje u prisutnosti inulina, izolat Lactobacillus
pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 uz dodatak oligosaharida dok izolati
Lactococcus lactis BGAL1-1 i Lactobacillus pentosus / paraplantarum / plantarum
ZG3-17 bolje preživljavaju proces liofilizacije uz obranom mlijekou u prahu.
4. Liofilizacija odabranih sojeva BMK s različitim lioprotektorima doprinosi povećanju

broja živih bakterijskih stanica u probiotičkim pripravcima što doprinosi iskazivanju
njihovog probiotičkog učinka kad se primjene kao bioterapeutici.
49
7. LITERATURA
Alander, M., De Smet, I., Nollet, L., Verstraete, W., von Wright, A., Mattila-Sandholm, T.
(1999) The effect of probiotic strains on the microbiota of the Simulator of the Human
Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME). Int. J. Food Microbiol. 46, 71-79.
Bakker-Zierikze, A. M., van Tol, E. A. F., Kroes, H., Alles, M. S., Kok, F. J., Bindels, J.
G. (2006) Faecal SIgA secretion in infants fed on pre- or probiotic infant formula. Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Font: Not Bold
Pediatric Allergy Immunol. 17(2), 134-140.
Beganović, J., Frece, J., Kos, B., Leboš Pavunc, A., Habjanič, K., Šušković, J. (2011) Formatted: Font: Not Bold, Croatian (Croatia)
Formatted: Font: Not Bold, Croatian (Croatia)
Functionality of the S-layer protein from the probiotic strain Lactobacillus helveticus M92
Antonie van Leeuwenhoek DOI 10.1007/s10482-011-9563-4 (u tisku) Formatted: Font: Not Bold, Croatian (Croatia)
Beganović, J., Leboš Pavunc, A., Gjuračić, K., Špoljarec, M., Šušković, J., Kos, B. (2011)
Improved sauerkraut production with probiotic strain Lactobacillus plantarum L4 and Formatted: Font: Not Bold, Croatian (Croatia)
Leuconostoc mesenteroides LMG 7954. J. Food Sci.: Food Microbiol. Safety, 76(2), (u Formatted: Font: Not Bold
tisku)
Bernardeau, M., Vernoux, J.P., Henri-Dubernet, S., Guéguen, M. (2008). Safety

assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. Int. J. Food Microbiol.
126, 278-285.
Bogovič Matijašević, B., Narat, M., Zoric, M. (2003) Adhesion of Two Lactobacillus
gasseri Probiotic Strains on Caco-2 Cells. Food Technol. Biotechnol. 41(1), 83-88. Formatted: Font: (Default) Arial
Capela, P., Hay, T.K.C., Shah, N.P. (2006) Effect of cryoprotectants, prebiotics and Formatted: Font: Not Bold
microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried

yoghurt. Food Res. Int. 39, 203-211. Formatted: Font: Not Bold
Casey, P.G., Casey, G.D., Gardiner, G.E., Tangney, M., Stanton, C., Ross, R.P., Hill, C., Formatted: Font: Not Bold
Fitzgerald, G.F. (2004) Isolation and characterization of anti-Salmonella lactic acid
bacteria from the porcine gastrointestinal tract. Lett. Appl. Microbiol. 39, 431–438. Formatted: Font: Not Bold
50
Casey, M.G., Häni, J.P., Gruskovnjak, J., Schaeren, W., Wechsler, D. (2006)
Characterisation of the non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) of Gruyère PDO cheese.
Lait. 86, (6), 407 – 414. Formatted ...
Cotter, P.D., Hill, C., Ross, R.P. (2005) Bacteriocins: developing innate immunity for Formatted ...
food. Nat. Rev. Microbiol. 3, 777-788.
Dunne, C., Murphy, L., Flynn, S., O’Mahony, L., O’Halloran, S., Feeney, M., Morrissey, Formatted ...
D., Thornton, G., Fitzgerald, G., Daly, C., Kiely, B., Quigley, E.M.M., O’Sullivan, G.C.,
Shanahan, F., Collins, J.K. (1999) Probiotics: from myth to reality. Demonstration of
functionality in animal models of disease and in human clinical trials. U: Proceedings of
the 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, metabolism and Applications,
Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, Antonie van Leeuwenhoek 76, str. 279-
292.
Duraković, S. (1996) Primjenjena mikrobiologija. Prehrambeno tehnološki inženjering,

Zagreb, str.115 – 119.
Đidić, S., Šušković, J., Kos B. (2008) Antibiotic Resistance Mechanisms in Bacteria: Formatted ...
Biochemical and Genetic Aspects. Food Technol. Biotechnol. 46, 11-21.
Fernandez, M.F., Boris, S. and Barbes, C. (2003) Probiotic properties of human

lactobacilli strains to be used in the gastrointestinal tract. J. Appl. Microbiol. 94, 449–455.
Flórez, A.B., Delgado, S., Mayo, B. (2005) Antimicrobial susceptibility of lactic acid Formatted: No underline, Font color: Auto
Formatted ...
bacteria isolated from a cheese environment. Can. J. Microbiol. 51(1), 51-8.
Formatted ...
Formatted ...
Forestier, C., De Champs, C., Vatoux, C. and Joly, B. (2001) Probiotic activities of Formatted ...
Formatted: Font: (Default) Times New Roman
Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial
Formatted: No underline, Font color: Auto
properties. Res. Microbiol. 152, 167–173.
Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan T.M., McSweeney P.L.H. (2000) Fundamentals of Cheese Formatted: No underline, Font color: Auto
science, Aspen Publishers Inc., Gaithersburg, Maryland.
51
Frece, J., Kos, B., Beganović, J., Vuković, S., Šušković, J. (2005) In vivo testing of Formatted: No underline, Font color: Auto
functional properties of three selected probiotic strain, World J. Microbiol. Biotechnol. 21,
1401-1408.
Fuller, R. (1989) Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378. Formatted: No underline, Font color: Auto
Fuller, R. (1992) Problems and prospects. U: Probiotics – The Scientific Basis, R. Fuller Formatted: No underline, Font color: Auto
(ured.), Chapman and Hall, London, str. 377-396.
Fuller, R., Perdigon, G. (2000) Probiotics 3: Imunomodulation by the Gut Microflora and
Probiotics, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Goh, Y.J., Azcarate-Peril, M.A., O´Flaherty S., Durmaz, E., Valence, F., Jardin, J., Formatted: No underline, Font color: Auto
Lortal, S., Klaenhammer, T.R. (2009) Development and Application of a upp-Based

Counterselective Gene Replacement System for the Study of the S-Layer Protein SlpX of
Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ. Microbiol. 75 (10), 3093-3105. Formatted: No underline, Font color: Auto
Goldin, B. R., Gorbach, S. L. (1992) Probiotics for humans. U: Probiotics – The Scientific Formatted: No underline, Font color: Auto
Basis, R. Fuller (ured.), Chapman and Hall, London, str. 355-376.
Hammes, W.P. (1990) Bacterial starter cultures in food production. Food Biotechnol. 4, Formatted: No underline, Font color: Auto
383-397.
Havenaar, R., Ten Brink B., Huis in´t Veld J. H. (1992) Selection of strains for probiotic Formatted: No underline, Font color: Auto
use. U: Probiotics - The Scientific Basis, R. Fuller (ured.). Chapman and Hall, London,
str. 209-221.
Huis in't Veld, J. H., Havenaar, J. R., (1993) Selection criteria for microorganisms for Formatted: No underline, Font color: Auto
probiotic use. U: Probiotics and Pathogenicity, Flair No. 6, J. F. Jensen, M. H. Hinton, R.

W. A. W. Mulder (ured.), DLO Spelderholt Centrer for Poultry Research and Information
Services, str. 11-19.
52
Klein, G., Pack, A., Bonaparte, C. i Reuter, G. (1998) Taxonomy andy physiology of Formatted: No underline, Font color: Auto
probiotic lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 103-125.
Kos, B. (2001) Probiotički koncept: in vitro istraživanja s odabranim bakterijama mliječne

kiseline. Disertacija, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Formatted: No underline, Font color: Auto
Kos, B., Šušković, J., Beganović, J., Gjuračić, K., Frece, J., Iannaccone, C., Canganella, Formatted: No underline, Font color: Auto
F. (2008) Characterization of the three selected probiotic strains for the application in food
industry. World J .Microbiol. Biotechnol. 24, 699–707
Kos, B., Šušković, J., Vuković, S., Šimpraga, M., Frece, J., Matošić, S. (2003) Adhesion Formatted: No underline, Font color: Auto
and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J. Appl.

Microbiol. 94, 981–987.
Kršev, Lj., Eri, S., Borović, A., Tratnik, Lj. (1992) Svježi mekani sir proizveden Formatted: No underline, Font color: Auto
upotrebom koncentrirane kulture, Mljekarstvo, 42 (4), 281-289.
Kullen, M. J., Klaenhammer, T. R. (1999) Genetic modification of intestinal lactobacilli Formatted: No underline, Font color: Auto
and bifidobacteria. U: Probiotics. A Critical Review, G. W. Tannock (ured.), Horizon

scientific press, England, str. 65-84.
Laulund, S. (1994) Comercial Aspects of Formulation, Production and Marketing of Formatted: No underline, Font color: Auto
Probiotic Products. U: Human Health: The Contribution of Microorganisms, S. A. W.

Gibson (ured.), Springer Verlag, London, str. 159-174.
Lebeer S. Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S. C. J. (2008) Genes and Molecules of Formatted: No underline, Font color: Auto
Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Lactobacilli Supporting Probiotic Action. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 72 (4), 728-764.
Leclercq, R., Courvalin, P. (1996) Resistance to Macrolides and Related Antibiotics in

Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (9), 2727-2734. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Marshall, V. M. E., Henry, C. J. K. (1990) Nutritional benefits of food biotechnology-the Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
microorganisms' contribution. U: Processing and Quality of food. 2., P. Zeuthen, J.C.
53
Cheftel, C. Ericsson, T.R. Gormley, P. Linko, Paulus, K. (ured.), Food Biotechnology:
Avenues to Healthy and Nutritious Products, Elsevier Applied Science, London i New
York
Marteau, P., Rambaud, J. C. (1993) Potential of using lactic acid bacteria for therapy and Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
immunomodulation in man. FEMS Microbiol. Rev. 12, 207-220. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Moineau, S., Y. Boutin and J. Goulet (1989). Effect of fermented milks on the immune
response in mice. J. Dairy Sci. 72 (Suppl.), 174.
Neefs, J. M., Van de Peer, Y., De Rijk, P., Chappele, S., De Watcher, R. (1993)
Compilation of small ribosomal subunit RNA structures. Nucleic Acids Res. 21 (13), Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
3025-3049. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto

Ouwehand, A.C., Salminen, S., Isolauri, E., (2002) Probiotics: an overview of beneficial Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
effects. Antonie Van Leeuwenhoek 82, 279–289.
Radošević, V. (2005) Proizvodnja svježeg probiotičkog sira uz dodatak transglutaminaze, Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Diplomski rad, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu.
Reid, G. (1999) Testing the Efficency of Probiotics. U: Probiotics. A Critical Review Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
(Tannock, G. W., ured.), Horizon scientific press, England, str. 129-140.
Sanders, M. E. i Huis in't Veld, J. (1999) Bringing a probiotic-containing functional food
to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issued. U: Proceedings of Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
the 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Kluwer Academic Publichers, The Netherlands, str. 293-316.
Schleifer, K. H., Amann, R. I., Ludwig, W. (1995) Phylogenetic identification and in situ Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.
54
Shu, Q., Gill, H. (2002) Immune protection mediated by the probiotic Lactobacillus Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto,
Croatian (Croatia)
rhamnosus HN001 (DR20) against Escherichia coli O157: H7 infection in mice.
Immunol. Med. Microbiol. 34-59. Formatted: Croatian (Croatia)
Smit, G., Smit, B.A., Engels, W.J.M. (2005) Flavour formation by lactic acid bacteria and
biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol. Rev. 29 (3), 591–610. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto,
Croatian (Croatia)
Stackebrandt, E., Goebel, B. M., (1994) A place for DNA-DNA reassociation and 16S
rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst.
Bacteriol. 44, 846-849.
Swenson, U. (1999.) Industrial perspectives. U: Probiotics. A. Critical Review, G. W. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Tannock (ured.), Horizon Scientific Press, London, str. 57-64.
Szabo, I., Wieler H.L., Tedin, K., Scharek-Tedin, L., Taras, D., Hensel, A., Appel, B., Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Nockler, K. (2009) Influence of a Probiotic Strain of Enterococcus faecium on Salmonella

enterica Serovar Typhimurium DT104 Infection in a Porcine Animal Infection Model.
Appl. Enviro. Microbiol. 75 (9), 2621-2628. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Šušković J., Kos, B., Beganović, J., Leboš Pavunc, A., Habjanič, K., Matošić, S. (2010) Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Antimicrobial Activity - The Most Important Property of Probiotic and Starter Lactic Acid
Bacteria. Food Technol. Biotechnol. 48 (3), 296-307. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Šušković, J. (1996) Rast i probiotičko djelovanje odabranih bakterija mliječne kiseline. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Disertacija. Prehrambeno-biotehnološki fakultet u Zagrebu.
Šušković, J. (2009) Probiotici kao živi lijekovi, predavanje iz kolegija "Probiotici i starter Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
kulture", Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu.

Šušković, J., Brkić, B., Matošić, S. (1997) Mehanizam probiotičkog djelovanja bakterija Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
mliječne kiseline. Mljekarstvo, 47, 107-112. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Šušković, J., Kos, B., Goreta, J., Matošić, S. (2001) Role of lactic acid bacteria and Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
bifidobacteria in synbiotic effect. Food Technol. Biotechnol. 39, 227-235. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
55
Šušković, J., Krobot, M., Mehak, M., Matošić, S. (1993) Antimikrobna aktivnost Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Lactobacillus acidophilus. Mljekarstvo, 43, 95-106. Formatted: Font: Not Bold, No underline, Font color: Auto
Tannock, G.W. (1999) A fresh look at the intestinal microflora. In: Probiotics: A Critical Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
Review. GW Tannock ed. Horizon Scientific Press, Wymondham, pp. 1–15.
Todoriki, K., Mukai, T., Sato, S., Toba, T. (2001) Inhibition of adhesion of food-borne Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
pathogens to Caco-2 cells by Lactobacillus strains. J. Appl. Microbiol. 91, 154–159.
Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K., Swings, J. (1996). Polyphasic Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev. 60, 407–438. Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
Zhou, J.S., Pillidge, C.J., Gopal, P.K., Gill, H.S. (2005) Antibiotic susceptibility profiles
of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Int. J. Food Microbiol. 98, Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto
211–217. Formatted: Font: Not Italic, No underline, Font color: Auto

56
57

746840.anamarija Perkovic Diplomski Rad

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

746840.anamarija Perkovic Diplomski Rad

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

Zagreb, prosinac 2011. ANAMARIJA PERKOVIĆ

Selekcija autohtonih baterija mliječne kiseline za pripravu probiotičkih starter kultura

Sažetak: Autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline (BMK) identificirani su sekvencioniranjem

Datum obrane: 16. prosinac, 2011.

Paper defended: 16 December, 2011.

2. TEORIJSKI DIO ............................................................................................................ 3

2.1. Bakterije mliječne kiseline kao probiotici ............................................................ 2

2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu ............................................................. 4

2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika ................................................................. 8

2.2. Liofilizacija probiotičkih bakterija ..................................................................... 11

2.3. Primjena različitih lioprotektora pri liofilizaciji bakterijskih kultura ................ 15

3. EKSPERIMENTALNI DIO ......................................................................................... 25

3.1. Materijal ............................................................................................................. 20

3.1.1. Mikroorganizmi .......................................................................................... 20

3.1.2. Hranjive podloge i kemikalije ..................................................................... 20

3.1.2.1. Hranjive podloge ..................................................................................... 20

3.1.2.2. Kemikalije ............................................................................................... 21

3.1.3. Aparatura i pribor ........................................................................................ 22

3.2. Metode rada ........................................................................................................ 22

3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama ..................................................... 22

3.2.2. KOH metoda ............................................................................................... 23

3.2.3. Katalaza test ................................................................................................ 23

3.2.4. Određivanje pH vrijednosti u supernatantu kulture .................................... 23

3.2.5. Izolacija DNA ............................................................................................. 23

3.2.6. Identifikacija bakterija sekvencioniranjem 16S rRNA gena....................... 24

3.2.7. SDS-PAGE površinskih proteina ................................................................ 24

3.2.8. Ispitivanje osjetljivosti autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na

3.2.10. Preživljavanje probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije.............................. 27

3.2.11. Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom ............. 27

4.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

4.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

5.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

5.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

Bakterije mliječne kiseline (BMK) tradicionalno se primjenjuju u proizvodnji

Autohtoni izolati BMLK identificirani su sekvencioniranjem pomoću 16S rRNA gena

Bakterije mliječne kiseline su gram-pozitivni, nesporogeni mikroorganizmi s niskim

BMK su važni industrijski važni mikroorganizmi koji se primjenjuju kao funkcionalne

Mehanizam djelovanja probiotika je raznolik. Oni inhibiraju rast nepoželjnih

2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu Formatted: Font: Bold

probiotički soj bude humanog podrijetla, te da se suvremenim molekularnim metodama

Podrijetlo Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 11 pt, Font

Formatted: Croatian (Croatia)

Tablica 1. Zahtjevi za izbor probiotičkih sojeva (Kullen i Klaenhammer, 1999; Kos,

1. točna taksonomska identifikacija

9. brzo i lako razmnožavanje, izdvajanje, koncentriranje, smrzavanje i liofiliziranje tijekom

10. dobivanje poželjenih organoleptičkih svojstava kad su uključeni u fermentacijske procese

11. sposobnost preživljavanja, razmnožavanja i metabolizamske aktivnosti u "ciljanom"

12. sposobnost adhezije i kolonizacije crijevnog epitela

13. sinteza antimikrobnih supstancija, uključujući bakteriocine, vodikov peroksid i organske

14. antagonistička aktivnost prema patogenim i kariogenim bakterijama

16. imunostimulatorni učinak

2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika Formatted: Font: Bold

Mehanizam probiotičkog djelovanja nije još u potpunosti razjašnjen. Prema Fulleru

A. Inhibicija rasta nepoželjnih mikroorganizama u intestinalnom traktu:

B. Modifikacija metabolizamskih procesa u intestinalnom traktu:

C. Stimulacija imunološkog sustava domaćina:

gut-associated lymphoid tissue, GALT), što je presudan korak u jačanju mukozalne i

Tablica 2. Poželjna svojstva i mehanizam djelovanja probiotičkih bakterija (Sanders i Huis

Poželjna svojstva probiotika Mehanizam djelovanja probiotika

Zbirka probiotičkih sojeva

Vlažna biomasa probiotičkog soja

Mikrobiološka i Probiotička bakterija Čuvanje na +4 oC