Serologic testing for HIV

HIV antibody assays by ELISA and Western blot

Antibodies  to  HIV proteins  may  be  detected  by  various  methodologies;  the  current  standards  are  enzyme‐linked  immunosorbent 
assays  (ELISAs)  for  screening  and  Western  blot  (WB)  for  confirmation.  Other  acceptable  methodologies  are  particle  cell  agglutination 
for  screening,  and  immunofluorescence  and  radioimmunoblot  assay  for  confirmation.  ELISA  is  highly  sensitive  but  has  been  fraught 
with  the  major  issues  of  false  positives  resulting  from  insufficient  specificity  and  false  negatives  mainly  from  low  levels  of  antibody  in 
very  early  infection,  the  so‐called  window  period  (Box  3.1).  With  each  successive  generation  of  assays,  the  rate  of  false  positives  has 
fallen  and  the  window  period  shrunk  significantly.  This  improvement  owes  itself  to  the  replacement  of  viral  lysate  by  recombinant 
antigens  and  the  use  of  double‐antigen  sandwich  to  enhance  capture  of  IgM  and  IgG  antibodies.  Its  overall  performance 
characteristics compare very  favourably  with the  best diagnostic  tests in other  areas of medicine. 
 

 
 
 
HIV p24 antigen assay

The  p24  protein  is  a  product  of  the gag gene  and  resides  in  the  viral core.  Prior  to  the  availability  of  viral  load  testing,  p24  was  used 
for  monitoring  disease  activity  as  well  as  diagnosis.  It  is  specific  as  a  diagnostic  test  but  falls  short  on  sensitivity,  as  a  negative  test  is 
not  uncommon  in  genuine  HIV  infection.  In  general,  the  level  of  p24  rises  early  soon  after  infection  but subsequently  falls  as  specific 
antibody  develops,  only  to  rise  again  in  the  advanced  stage  of  AIDS.  Nevertheless,  its  presence  generally  precedes  that  of  antibody 
and  will  shorten  the  window  period  if  tested  positive.  It  is  now  incorporated into  the  current,  fourth‐generation  ELISA  antibody  test 
that  is  used  by  the  Public  Health  Laboratory  Centre.  This  generation  of  ELISA  combines  testing  for  both  p24  and  antibodies  to  HIV‐1 
and  HIV‐2,  detects  IgM  as  well  as  IgG,  and  has  an  average  window  period  of  only  16  days.  The  sensitivity  is  >99.5%  and specificity 
>99%  to  both  B  and  non‐B  subtypes.  However,  there  is  the  theoretical possibility  of  a  brief  second  window  period,  during  which  p24 
falls and HIV‐antibody  remains at low, undetectable levels.  
Virology tests for HIV

Both  HIV  RNA  and  proviral  DNA  are  amenable  to  assay.  The  major  application  of  RNA  assay  in  HIV  medicine  is  in  the  measurement  of 
viral  load,   w h i c h   is  essential  to  gauge  the  efficacy  of  antiretroviral  therapy.  Proviral  DNA  is  incorporated  in  host  cells,  of  which 
the  peripheral  blood  mononuclear  cells  (PBMC)  are  the  most  accessible  for  testing.  Both  proviral  DNA  and  HIV  RNA  may  be  tested 
for  diagnosis.  HIV  isolation  in  lymphocyte  culture  is  also  diagnostic  but  has  a  long  turnaround  time  and  places  extraordinary  demands 
on  facilities  and  expertise.  These  virologic  tests  are  mainly  used  for  diagnosis  in  infants  and  patients  in  the  window  period.  The 
term,  Nucleic  acid  amplification  test  (NAT),  is  also  used  to  denote  virologic  testing  algorithms  for  further  reduction  of  the  window 
period  in  donated blood. 
 
Use of NAT in blood donor screening

Blood  borne  pathogens  in  donated  blood  may  escape  detection  if  only  serologic markers  are  used  for  screening.  With  the  concurrent 
use  of  NAT,  this  window  period  for  HIV  detection  is  reduced  to  about  11  days.  They  are  implemented  as standard  in  many  developed 
countries,  including  Hong  Kong,  to  assure  the  safety  of  blood  supply.  In  light  of  the  high  sensitivity  of  current  serologic  assays,  the 
cost‐effectiveness  of  NAT  in  routine  HIV  testing  is  doubtful  and  will  depend  highly  on  the  prevalence  of  HIV  in  the  population.12  It 
must be noted that NAT complements HIV antibody test, and is rarely used in isolation. 
 
Indications for a diagnostic HIV test

For  individual  diagnosis,  the  standard  testing  algorithm  is  the  two‐step  use  of  ELISA  for  screening  and  WB  for  confirmation.  The 
requesting  physician  should  ensure  that  all  tests  are  done  in  a  quality  laboratory.   An  HIV  diagnostic  test  is  indicated  in  people  at 
risk of the infection, including persons with: 
 
(a) Behavioural  risks  of  and  potential  exposure  to  HIV  infection,  such  as injecting  drug  use,  any  form  of  cocaine  use, 
male‐male  sex,  multiple  sexual partners,  and  commercial  sex.  All  sex  partners  of  persons  with  these  risk  factors  are  also 
at  risk. 
 
(b) Occupational  exposure  to  a  possibly  infected  source,  normally  referring to  that  in  the  health  care  setting  such  as 
after  a  needlestick  injury. 
 
(c) Other  sexually  transmitted  infections  (STI)  ‐  It  is  known  that  either  ulcerative  or  non‐ulcerative  STI  facilitates  HIV 
transmission. 
 
(d) Clinical  conditions  associated  with  HIV  infection,  varying  from  classical  AIDS‐defining  conditions  to  tuberculosis, 
herpes zoster in a young patient,  oral thrush, unexplained fever, and lymphadenopathy. 
 
(e) Receipt  of  blood  or  blood  products  between  1978  and  1985,  the  year  when  screening  of  donated  blood  and  organs 
began  in  Hong  Kong. 
 
 

 
 
 

 
 
 New CDC Recommendations for HIV Testing in Laboratories
A step-by-step account of the approach
CDC’s new recommendations for HIV testing in laboratories capitalize on the latest available technologies to help diagnose HIV infections earlier – as much as 3-4 weeks sooner
than the previous testing approach. Early diagnosis is critical since many new infections are transmitted by people in the earliest (“acute”) stage of infection.
By putting the latest testing technology to work in laboratories across the United States, we can help address a critical gap in the nation’s HIV prevention efforts.

Step 1: “Fourth generation” Step 2: HIV-1/HIV-2 antibody

HIV test differentiation immunoassay
Detecting HIV sooner Diagnosing HIV-1 vs. HIV-2
Positive
Detects HIV in the blood earlier than Produces results faster than the previously
previously recommended antibody tests recommended Western Blot.
by identifying the HIV-1 p24 antigen, a
viral protein which appears in the blood Distinguishes between HIV-1 and HIV-2, which the
sooner than antibodies. previously recommended Western Blot cannot
do – this distinction can have important treatment
implications for a patient.

Negative Negative or Positive

Indeterminate

Diagnosis False Negative

HIV-negative Positive Step 3: Nucleic Acid Test (NAT) Interpret Test
Acute HIV-1 infection or “false positive”?
Results as
Ensures accurate detection of early infection or indicates
Diagnosis a false positive from the fourth generation test.
HIV-1 or HIV-2
Positive
Acute HIV-1 Infection

Diagnosis
HIV Infection

This graphic is designed to illustrate key concepts of the new testing approach in laboratories. For more detail, please see the full guidelines here:
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/HIVtestingAlgorithmRecommendation-Final.pdf.

U.S. Department of Health and Human Services

Centers for Disease Control and Prevention

www.cdc.gov/nchhstp/newsroom JUNE 2014