Professional Documents
Culture Documents
HCM
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ
Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn
lọc RV, ủ ở 420C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 370C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang
BHI hay TSA, ủ qua đêm
Ferric ammonium
citrate: 0.5g
Sodium thiosulfate: 0.5g
Agar: 15g
Phenol red: 0.025g
MR-VP Both Môi trường 1: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân
(Glucose Buffered peptone-water cất. phối 10ml/ống nghiệm.
Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Kiểm tra lại môi trường cung
Glucose: 5g cấp nào để pha môi trường.
K2HPO4: 5g (buổi 5)
Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
RSU Dipotassium Phosphate: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
(Rustigian-Stuart 9.5g cất. phối 3ml/ống nghiệm.
Urea Broth) Yeast Extract: 0.1g pH 6.8 ± 0.2 (buổi 5)
Urea: 20g
Monopotassium
Phosphate: 9.1g
Phenol Red: 0.01g
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng
ở 1210C trong 15 phút.
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng,
bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây.
Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô,
các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa
cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng
của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK).
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh
RV đã được ủ ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ
dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella
như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi
ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện
trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 18
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
+ Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA
được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,
lactose) và khả năng sinh H2S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy
ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và
lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được
đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có
màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có
xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng
sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy
lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm.
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có
VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men
lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí,
chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch
nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử
lưu huỳnh và sinh H2S.
+ Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường
urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là
pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ
khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô
trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48
giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea
màu vàng cam.
tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.