BÀI 4: NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

 Quan sát hình thái và đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae.
 Cố định nấm men trong gel alginate
 Xác định hiệu suất cố định nấm men
II. NGUYÊN TẮC
Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae là những tế bào sống được ứng
dụng trong: sản xuất đồ uống lên men, sản xuất bánh mì, sữa chua...và trong y học như
sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa biolactovin... Ngoài ra S.cerevisiae còn được quan tâm
nhiều trong lĩnh vực thu nhận enzyme invertase để thủy phân đường saccharose thành
đường nghịch đảo.
Saccharomyces cerevisiae là Eukaryote đơn bào có kích thước 5-10μm nên có
thể tiến hành thí nghiệm như vi khuẩn, có thể nuôi trong môi trường lỏng hoặc đặc và
tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch. Thích nghi với môi trường chứa đường cao, tính
acid cao. Có thể nuôi tế bào nấm men quy mô lớn trong nồi lên men và dễ dàng thu
nhận sinh khối tế bào.
Nấm men bia thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, có hoạt tính enzyme
invertase (EC 3.2.1.26). Enzyme này thường tập trung chủ yếu trong lớp không gian
chu chất của tế bào nấm men. Ngành công nghiệp sản xuất bia hàng năm thải ra một
lượng rất lớn bã nấm men bia. Trung bình sản xuất 100 lít bia sẽ thu được 2 lít bã nấm
men với độ ẩm 88%. Hiện nay, bã nấm men bia được sử dụng để sản xuất bột chiết
nấm men (yeast extract) hoặc làm thức ăn gia súc.
Alginate là loại polymer sinh học phổ biến và nhiều thứ hai trên thế giới sau
cellulose. Nguồn alginate chủ yếu được tìm thấy ở thành tế bào và ở gian bào của tảo
nâu sống ở biển dưới dạng muối alginate. Alginate tồn tại dưới 2 dạng không tan là
alginate canxi và magie (AlgCa, AlgMg) rất bền vững ở thành tế bào cây rong. Cấu tạo
hóa học của alginate gồm các gốc β-D-manuronat và α-L-guluronat liên kết với nhau
bằng 1,4-glucosit. Phân tử alginate được tạo thành bởi liên kết của 3 loại block khác
nhau là block polyguluronat, block mannuronat và block xen kẽ có độ dài ngắn khác
nhau và trình tự sắp xếp khác nhau. Chính điều đó tạo nên tính chất đặc thù của
alginate làm cho nó được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau: thực phẩm,
mỹ phẩm, in vải, giấy… Ngày nay, việc cố định tế bào sống trong gel alginate canxi đã
trở thành một kỹ thuật ứng dụng rộng rãi. Kỹ thuật cố định tế bào bằng gel alginate
được mô tả trong hình dưới đây:
 Hình II.1: Cố định tế bào bằng gel alginate

III. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

1. Quan sát hình thái và đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae
Cân 1g nấm men khô hòa tan trong 99 ml nước cất để thu được dung dịch nấm
men pha loãng 100 lần. Sau đó lấy 1 ml dung dịch trên thêm vào 99 ml nước ta thu
được dịch nấm men với độ pha loãng là 104.
Cho một giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên buồng đếm rối cho dịch pha
loãng 104 với lượng vừa đủ lên trên đậy lamelle lại sao cho không có bọt khí quan sát
ở vật kính 40X đếm số lượng tế bào nấm men rồi tính mật độ tế bào.
Sau đó lấy dịch pha loãng trên để lên lamelle khác chuyển sang vật kính 100X
quan sát hình thái nấm men.
2. Cố định nấm men trong gel alginate
Cân 0,2g nấm men hòa tan trong 20 ml nước cất tạo thành dung dịch tế bào nấm
men 1%. Sau đó bổ sung vào dung dịch trên 20 ml dung dịch alginate 2%. Hút dung
dịch trên nhỏ từ từ từng giọt vào 50 ml dung dịch CaCl 2 2% tạo thành các hạt nhỏ và
ngâm trong 30 phút. Sau đó lọc lấy hạt và ngâm trong dung dịch muối sinh lý để bảo
quản. Đếm số lượng nấm men trong dung dịch CaCl2 ngâm hạt trước khi lọc để xác
định hiệu suất cố định, tại đây ta có độ pha loãng là 102
IV. GIẢI THÍCH THÍ NGHIỆM
1. Quan sát hình thái và đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae
Các tế bào nấm men nếu còn sống thì sẽ không bắt màu, nếu tế bào đã chết sẽ có màu
xanh của thuốc nhuộm. Từ đó có thể quan sát tế bào sống chết và tính được mật độ tế
bào.
2. Cố định nấm men trong gel alginate

1
 Alginate khi kết hợp với kim loại có hóa trị II thì tạo thành các hợp chất có độ
chắc cao, khó thấm nước.
Khi alginate Na tiếp xúc với dung dịch CaCl2, xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa
hai dung dịch theo phản ứng
2[C5H7O4COONa]n + nCaCl2 > [(C5H7O4COO)2Ca]n + 2nNaCl
Alginate Na Alginate Ca
Ở dạng này, alginate Ca kết tủa, trở thành dạng không tan, tạo thành màng không
thấm nước. Toàn bộ bề mặt của giọt hỗn hợp sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginate
Ca không thấm nước và tạo thành một hạt. Khi dung dịch alginate tiếm xúc với dung
dịch CaCl2 thì sẽ hình thành một lớp màng bao bên ngoài ngăn không cho dịch nấm
men bên trong tràn ra dung dịch ngoài do đó khi nhỏ từng giọt dung dịch alginate
xuống dung dịch CaCl2 thì sẽ hình thành các hạt tròn như giọt nước.
Khi nồng độ alginate không phù hợp tức là nồng độ alginate thấp thì sẽ không tạo
hạt trong CaCl2 do hạt không được làm cứng nên sẽ không giữ được nấm men bên
trong vì thế không cố định nấm men được. Với nồng độ như trên ta đang kiểm tra xem
hiệu suất cố định nấm men như thế nào.
V. KẾT QUẢ
1. Kết quả đếm số lượng và quan sát hình thái nấm men đã nhuộm

Hình 1.a: cấu tạo lưới đếm và vị trí ô đếm

2
 Kết quả đếm số lượng nấm men

Hình 1.1: Ô 1 - 12 tế bào Hình 1.2: Ô 2 - 11 tế bào

Hình 1.3: Ô 5 – 6 tế bào

Hình 1.4: Ô 4 – 9 tế bào Hình 1.5: Ô 3 – 14 tế bào

3
  Tổng số tế bào trong 5 ô là: 12+11+14+9+6=52 (tế bào)
 Tính mật độ tế bào (mật độ tế bào trước cố định)
Số lượng tế bào trong 1mm3 được tính theo công thức
A x 4000 x ĐPL
Số tế bào trong 1 m m3 =
5 x 16
 A: số lượng tế bào trong 80 ô nhỏ (A=52)
 4000 = 400 x 10 (1/400 mm2: diện tích 1 ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt
buồng đếm đến tấm lamelle)
 ĐPL: độ pha loãng (104)
52 x 4000 x 10000
Số tế bà o trong1 mm3 = =26 x 106
5 x 16
 Số tế bào trong 1 ml là 26 x 109
Theo quan sát thì không có tế bào nấm men nào bắt màu thuốc nhuộm có thể kết
luận rằng không có tế bào chết. Vậy mật độ tế bào nấm men 26 x 109 tế bào/ml

 Kết quả quan sát hình thái nấm men ở vật kính 100X

Hình 1.6: hình thái nấm men ở vật kính 100X

4
 2. Cố định nấm men trong gel alginate

Hình 2.1: gel alginate chứa nấm men tạo hạt trong dung dịch CaCl2

Hình 2.2: Nấm men sau khi cố định được bảo quản trong nước muối sinh lý

5
  Kết quả số lượng nấm men trong dung dịch CaCl2 sau khi cố định.

Hình 2.3: Ô 1 – 8 tế bào Hình 2.4: Ô 2 – 10 tế bào

Hình 2.5: Ô 5 – 7 tế bào

Hình 2.6: Ô 4 – 2 tế bào Hình 2.7: Ô 3 – 5 tế bào

Tổng số tế bào trong 5 ô là: 8+10+5+2+7=32 (tế bào)

6
  Tính mật độ tế bào (mật độ tế bào sau cố định)
Số lượng tế bào trong 1mm3 được tính theo công thức
A x 4000 x ĐPL
Số tế bào trong 1 m m3 =
5 x 16
 A: số lượng tế bào trong 80 ô nhỏ (A=32)
 4000 = 400 x 10 (1/400 mm2: diện tích 1 ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt
buồng đếm đến tấm lamelle)
 ĐPL: độ pha loãng (102)
32 x 4000 x 100
Số tế bào trong 1 m m3 = =16 x 10 4
5 x 16
 Số tế bào trong 1 ml là 16 x 106
 Hiệu suất cố định nấm men
TCĐ−SCĐ
Hiệu suất cố định = x 100
TCĐ
TCĐ: mật độ tế bào trước cố định = 26 x 109
SCĐ: mật độ tế bào sau cố định = 16 x 106
9 6
26 x 10 −16 x 10
Hiệu suất cố định = x 100=99,94 %
26 x 10 9
3. Kết quả quan sát nấm men sau khi cố định trong gel alginate

Hình 3.1: Quan sát nấm men sau khi cố định trong gel ở vật kính 40X
VI. KẾT LUẬN
Quan sát tế bào nấm men ở vật kính 40X và đếm số lượng ta nhận thấy rằng hầu
như không có tế bào nào bắt màu với thuốc nhuộm nguyên nhân có thể là do:
 Thao tác nhuộm không chính xác lượng thuốc nhuộm không đủ để bắt màu.
 Thời gian nhuộm chưa đủ để tế bào bắt màu.
 Không có tế bào chết.
Hiệu suất cố định nấm men bằng gel alginate là 99,94% cố định nấm men bằng
gel alginate cho hiệu suất cao
 Nồng độ gel là phù hợp cho việc tạo màng của hạt cố định
 Thao tác tạo hạt trong dung dịch CaCl2 chính xác ít gây thất thoát.

7
 Hình thái nấm men ở vật kính 100X còn kết dính nhiều không quan sát được
riêng lẻ từng tế bào nguyên nhân là do mật độ pha loãng quá dày
Kết quả quan sát nấm men cố định trong gel thấy rằng sau một thời gian số lượng
nấm men nhân lên nhiều và dày đặc. Do lớp cắt từ hạt cố định còn dày nên chưa quan
sát được rõ nấm men được cố định trong mạng lưới gel như thế nào.