Informe: Laboratorio de Genética para Microbiología, Martes-1500

Laboratorio de Genética para Microbiología, martes-1500
INFORME
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGIA
LABORATORIO DE GENETICA PARA MICROBIOLOGIA
(BI-640)
CULTIVO CELULAR
PRACTICA #8
NUMERO DE GRUPO: 9
GENESIS MAITE SANCHEZ RODRIGUEZ 20151022416
KIMBERLYN ONEYDA VELASQUEZ CRUZ 20181007315
NOMBRE DEL INSTRUCTOR: CESIA ARRIOLA
SECCION: MARTES 15OO
CIUDAD UNIVERSITARIA, TEGUCIGALPA
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INFORME
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGIA
LABORATORIO DE GENETICA PARA MICROBIOLOGIA
(BI-640)
CULTIVO CELULAR
PRACTICA #8
NUMERO DE GRUPO: 9
GENESIS MAITE SANCHEZ RODRIGUEZ 20151022416
KIMBERLYN ONEYDA VELASQUEZ CRUZ 20181007315
NOMBRE DEL INSTRUCTOR: CESIA ARRIOLA
SECCION: MARTES 15OO
CIUDAD UNIVERSITARIA, TEGUCIGALPA
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INTRODUCCION
Morfología y citoquímica de cultivos celulares de Aedes aegypti (Diptera:

Culicidae) y susceptibilidad a Leishmania panamensis (Kinetoplastida:
Trypanosomatidae)
Abstract: Morphology and cytochemistry of Aedes aegypti’s cell cultures

(Diptera: Culicidae) and susceptibility to Leishmania panamensis
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae). The first cellular line of Aedes aegypti was
developed by Grace in 1966; afterwards, other cellular lines of this species have
been generated. These have been used for the study of pathogenic organisms like
viruses, bacteria and parasites, which demonstrates their importance in biomedical
applications. This research describes, for the first time, some cytochemical
characteristics of A. aegypti cell cultures, that were infected with
(MHOM/CO/87CL412) strain of Leishmania panamensis. A morphological study of
the cell culture was also carried out. Maintenance of the cell culture, parasites and
infection in vitro were carried out in the Laboratory of Entomology, Cell Biology and
Genetics of the Universidad de La Salle. The cell cultures infected with the parasite
were maintained in a mixture of mediums Grace/L15, supplemented with 10 % fetal
bovine serum (FBS) at pH 6.8 and a temperature of 26 ºC, during 3, 6 and 9 post-
infection days. After this, these cell cultures were processed through High Resolution
Light Microscopy (HRLM) and Transmission Electron Microscopy (TEM) based on
standard protocols defined by the Group of Microscopy and Image Analyses of the
Instituto Nacional de Salud. Semi-fine slices of 1 µm colored with toluidine blue were
used for the morphological analysis of the culture, and ultra fine cuts of 60 to 90 nm
stained with uranyl acetate and lead citrate where used for the ultrastructural study.
In addition, PAS and peroxidase staining was carried out in cells fixed with methanol.
The morphometric study was analyzed with software ImageJ (NIH). In the semi-fine
slices, small cells were observed showing fibroblastic appearance 10.84±2.54 µm in
length and 5.31±1.26 µm wide; other cells had epithelial appearance with a great
peripheral nucleus, voluminous and vacuolated cytoplasm, 23.04±4,00 µm in length
and 13.96±3.70 µm wide. These last ones predominated over the ones with
fibroblastic appearance. Regarding the PAS coloration, 7.08 % of the cells presented
abundant PAS positive cytoplasmatic granules which indicated polysaccharides
presence. The peroxidase test gave a negative result. The greatest percentage of
infection (18.90 %) of one total of 101 cells, turned up by day 6. Some cells analyzed
by TEM presented a vacuolated aspect cytoplasm; some contained parasites, other
fibrillar material and others were empty. The results indicate that A. aegypti cell
culture can support the internalization and transformation of the parasite, which
demonstrates the capacity that these cell cultures have to be infected with L.
panamensis and to maintain the infection for approximately one week. Rev. Biol.
Trop. 56 (2): 447-458. Epub 2008 June 30.
Key words: periodic acid-schiff, cell cultures, Aedes aegypti, Leishmania

panamensis, transmission electron microscopy.
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Desde comienzos del siglo XX los entomólogos han tratado de mantener in vitro
células de insecto como una herramienta en diferentes campos de estudio (Lynn
2002). Pero solo hasta 1962 Grace obtuvo la primera línea celular de insecto
correspondiente a la polilla Antheraea eucalypti. Actualmente, existen más de 500
líneas celulares establecidas a partir de diversos tejidos de insectos, siendo mayor
el número de éstas en dípteros y lepidópteros (Lynn 2001).
La primera línea celular de Aedes aegypti fue establecida por Grace en 1966;
posteriormente, se generaron otras líneas celulares de esta misma especie (Bhat y
Singh 1969, Varma y Pudney 1969). Desde entonces, diferentes cultivos celulares
de mosquitos se han utilizado como sustratos para el aislamiento e identificación de
arbovirus. Sin embargo, existe en la actualidad una amplia gama de aplicaciones
biotecnológicas (Singh 1972, Sudeep et al. 2005), así como también biomédicas,
principalmente en investigaciones con algunas bacterias y parásitos (Syafruddin et
al. 1992, Dobson et al. 2002). En esta última línea de acción, es importante resaltar
el estudio realizado por Fampa et al. (2003), en el cual se muestra la interacción de
ciertas especies de tripanosomátidos monoxenos con líneas celulares de A.
albopictus, Anopheles gambiae y Lutzomyia longipalpis. De igual manera, se han
realizado infecciones con Trypanosoma brucei en cultivos celulares del mosquito A.
gambiae, en donde al parecer, no se disminuye la infectividad del parásito al utilizar
estas células como sustrato (Kaminsky et al. 1987).
Con lo descrito en los anteriores antecedentes, se pretende resaltar la importancia

que tienen los cultivos celulares de mosquitos, en el mantenimiento y estudio del
ciclo biológico de tripanosomátidos, importantes en salud publica. Existen algunos
trabajos en donde se reporta la infección de Leishmania en diferentes líneas
celulares de macrófagos y células dendríticas (Berens y Marr 1979, Zuluaga y
Robledo 2004, Sarmiento et al. 2006), pero son pocas las investigaciones
relacionadas con la interacción y maduración del parásito en cultivos celulares de
insectos. Recientemente, se ha podido demostrar que los cultivos celulares de L.
longipalpis y L. spinicrassa son susceptibles a la infección con L. chagasi y L.
braziliensis respectivamente (Miranda et al. 2005, Bello et al. 2005, Zapata et al.
2005).
Existe un primer trabajo de infección con L. donovani en cultivos celulares de A.

albopictus, mosquito no vector de este patógeno, en el cual se obtuvieron formas
amastigotas del parásito y se logró su mantenimiento en estos sustratos celulares
(Dedet y Gaudin 1977). También se realizó un estudio de susceptibilidad a la
infección con L. chagasi y L. braziliensis en una línea celular de A. aegypti (Ardila et
al. 2005), establecida en Colombia a partir de tejidos embrionarios del mosquito.
Los registros de esta investigación mostraron relativamente altos porcentajes de
infección con ambas especies de parásitos, siendo mayor los resultados de
infección con la especie L. braziliensis (29.8%), obtenidos durante el día 6 post-
infección; razón por la cual los autores concluyeron que estos cultivos celulares son
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un modelo alternativo in vitro para el estudio de los parásitos mencionados

(Muñoz et al. 2005).
En el presente trabajo se describe, por primera vez, algunas características

citoquímicas de los cultivos celulares de A. aegypti, infectados con L. panamensis;
también se realizó un estudio morfológico de las células en cultivos y se reporta el
porcentaje de infección de L. panamensis en estos sustratos celulares.
Materiales y métodos
Cultivos celulares e infección: El mantenimiento de los cultivos celulares,

parásitos y la infección in vitro, fueron realizados en el Laboratorio de Entomología,
Biología Celular y Genética de la Universidad de La Salle. Los cultivos celulares
de A. aegypti fueron sembrados en seis placas de petri de 35x10 mm e infectados
con la cepa (MHOM/CO/87CL412) de L. panamensis, suministrada por el
laboratorio de parasitología del Instituto Nacional de Salud (INS). Los cultivos
celulares, infectados con el parásito, fueron mantenidos en una mezcla de medios
Grace/L15 suplementados con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10%, a un pH 6.8 y una
temperatura de 26 ºC. En los días 3, 6 y 9 post-infección se retiraron dos placas de
petri, se lavaron con solución salina y se les realizó el proceso de fijación. De igual
forma, se mantuvieron cultivos celulares del mosquito sin infectar.
Procesamiento de muestras para microscopía electrónica: Se recibieron

cultivos celulares con y sin infección. Las muestras fueron procesadas según
protocolos estandarizados en el Grupo de Microscopía y Análisis de Imágenes del
Instituto Nacional de Salud de la siguiente forma: se fijaron con glutaraldehído al 3%
en buffer fosfato 0.1M pH 7.2, luego, fueron lavadas tres veces con buffer fosfato
0.1M pH 7.2. Posteriormente, a los cultivos se le realizó una post-fijación con
tetróxido de osmio (OsO4) al 1% y fueron lavados con el mismo buffer fosfato
mencionado anteriormente. Se realizó el proceso de deshidratación con etanol al
50, 70, 80, 95% y finalmente dos cambios de etanol al 100%. La infiltración fue
realizada con cambios en mezclas de alcohol y resina epóxica Epón-Araldita en
proporciones de 2:1 durante 1 h, 1:1 durante una hora y dos cambios de resina pura
durante 24 h. Para la inclusión de las muestras se utilizó la mezcla de resina Epón-
Araldita y se dejó polimerizando a 68 ºC por 48 h.
Posterior al procesamiento de las muestras, se obtuvieron cortes semifinos de 1 µm

los cuales, fueron coloreados con azul de toluidina para su estudio morfológico. La
observación de las muestras fueron realizadas en un microscopio de luz Zeiss
Axiophot.
Finalmente, se realizaron cortes ultrafinos de 60 a 90 nm, coloreados con acetato

de uranilo y citrato de plomo. Para el estudio ultraestructural, se utilizó un
microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 109.
Morfometría celular: La captura de imágenes de las células en los días 3, 6 y 9

postinfección y de las células no infectadas, se realizó por medio de una cámara
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Sony Hyper HAD CCD-IRIS/RGB adaptada a un microscopio de luz Zeiss Axiophot.

Las imágenes digitales de las células no infectadas se analizaron por medio del
software de acceso libre ImageJ versión v1.38 (NIH; http://rsb.info.nih.gov/ij)
(Rasband 1997-2006). Se realizó un estudio morfométrico en el cual se tuvieron en
cuenta los parámetros de largo y ancho de las células derivadas de los cultivos de A.
aegypti, sin infección.
Citoquímica: La detección de carbohidratos, se realizó mediante la coloración de

PAS (García del Moral 1993). Para esto las laminillas redondas de 12 mm infectadas
con L. panamensis fueron fijadas con metanol y oxidadas con ácido periódico al
0.5%. Finalmente se evidenció la presencia de carbohidratos con el reactivo de
schiff y se realizó el contraste con hematoxilina de Harris. Las laminillas fueron
deshidratadas, pasadas por Xilol y adheridas a una lámina con citoresina. La
reacción fue observada en el microscopio de luz Zeiss Axiophot.
Se realizó la detección de peroxidasa por medio de la técnica de Diaminobencidina

(García del Moral 1993). Las células de A. aegypti cultivadas en laminillas redondas
de 12 mm e infectadas con L. panamensis fueron fijadas con metanol y tratadas con
una solución de 3.3´-diaminobenzidina a una concentración de 10 mg en 15 ml de
buffer TRIS y 12 µl de H2O2 al 30%. Después de lavar, deshidratar y pasar por Xilol,
la laminilla fue adherida a la lámina con citoresina. La observación fue hecha en un
microscopio de luz Zeiss Axiophot.
Análisis estadístico: Los datos fueron analizados en el software Statistix 1.0 para
Windows. Se les aplicó la prueba de Anova de una vía y el test de Tukey. Los
resultados de la morfología celular, porcentaje de células con gránulos PAS positivo
y porcentaje de células con vacuolas PAS positivo, fueron analizados en Microsoft
Excel 2002, en donde se obtuvo promedio, desviación estándar y error estándar.
Resultados
Morfología: En los cultivos celulares correspondientes a células no infectadas, se

observaron dos grupos de células morfológicamente diferentes: uno constituido por
células de apariencia fibroblastoide con unas dimensiones de 10.84±2.54 µm de
largo y 5.31±1.26 µm de ancho, cuyo citoplasma presentaba algunas vacuolas,
como se observa en la Fig. 1. El otro grupo estuvo conformado por células de
apariencia epitelioide, de unas dimensiones entre 23.04±4.00 µm de largo y
13.96±3.70 µm de ancho, con un núcleo prominente y citoplasma ocupado por
numerosas vacuolas (Fig. 1). Estas últimas predominaron sobre las de apariencia
fibroblastoide.
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El Cuadro 1 nos muestra el promedio del tamaño celular (longitud y amplitud) de las
dos morfologías celulares encontradas.
7
Citoquímica: Con relación a la reacción de PAS, se evidenció un 7.08% de células

con gránulos PAS positivo infectadas con L. panamensis (Cuadro 2). La Fig.
2A muestra una célula de A. aegypti, con gránulos color magenta en su citoplasma,
característico de la coloración de PAS positivo, evidenciando posiblemente la
presencia de carbohidratos, principalmente glucógeno y mucinas. Además, se
observó un 50.93% de células infectadas con vacuolas que contenían un material
que fue positivo a la coloración de PAS, en un ámbito de reacción de débil a fuerte
(Fig. 2B). La técnica de la DAB fue negativa para la detección de peroxidasas.
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En el Cuadro 2 se observa el porcentaje de células con gránulos PAS positivo, así,

como el porcentaje de células con vacuolas que contenían un material que fue
positivo a la coloración de PAS, infectadas con el parásito.
Infección celular: La observación de los cultivos celulares de A. aegypti infectados

con L. panamensis, evidenció la presencia de formas amastigotas al interior de
vacuolas parasitóforas durante los días 3, 6 y 9 post-infección (Fig. 3). En la Fig.
4 se observó que en el día 6 (18.90%), se presentó el mayor porcentaje de infección
con relación a los días 3 (14.06%) y 9 (15.59%), pero no se encontraron diferencias
significativas según la prueba de Anova (Tukey, p=0.5).
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En el Cuadro 3 se observan los datos obtenidos del proceso de infección de la línea

celular de A. aegypti con L. panamensis. Sólo el porcentaje de promastigotes por
células presentó diferencias significativas (Tukey, p<0.05) en el día 3 con relación a
los días 6 y 9 según la prueba de Anova.
Microscopia electrónica de transmisión: Ultraestructuralmente se identificó en

las células del cultivo, con y sin infección, la presencia de organelos característicos
tales como: núcleo, mitocondrias, vacuolas y lisosomas. Las células de cultivos
celulares sin infectar, presentaron un núcleo voluminoso, con poca cromatina
condensada que ocupaba la mitad del citoplasma, el cual tenía un aspecto de panal;
además se observó la presencia de vacuolas con y sin material fibrilar (Fig. 5A). En
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las células infectadas, se evidenció la presencia de formas promastigotas en el

interior del citoplasma. Igualmente, se logró observar vacuolas con y sin material
fibrilar. El núcleo se encontró más al extremo de las células y en la mayoría de
observaciones éste se identificó muy eucromático (Fig. 5B). Desde el punto de vista
ultraestructural y de citoquímica, se puede sugerir la presencia tanto de lisosomas
como de vacuolas con contenido enzimático asociado con carbohidratos.
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Discusión
La presencia de dos grupos diferentes de células en los cultivos celulares derivados

del mosquito A. aegypti se debe, posiblemente, a los diversos tipos de tejidos
disponibles, a partir de huevos embrionados utilizados durante la formación de los
cultivos primarios (Charpentier et al. 1995, Rey et al. 2000). Sin embargo,
predominaron las formas de apariencia epitelioides, como lo registró Ardila et al.
(2005), diferente a lo observado en las líneas celulares Mos. 20 y 29, derivadas de
tejidos larvarios de A. aegypti que presentaron una morfología en su mayoría
fibroblastoide (Varma y Pudney 1969, Ardila et al. 2005).
Las vacuolas que fueron apreciadas en las electromicrografías, son similares a las
observadas en el citoplasma de una línea celular de A. triseriatus (Charpentier et al.
1995). El resultado positivo a la coloración de PAS concuerda con lo descrito en una
línea celular de A. eucalypti, en donde se menciona la presencia de vesículas
densas, las cuales fueron PAS positivo. Estas vesículas fueron descritas como
semejantes a lisosomas, aclarando que su naturaleza y función precisa no se
habían determinado (Grace 1971). La evidencia ultraestructural obtenida en el
presente trabajo, indica que efectivamente corresponden a lisosomas y su reacción
positiva a la coloración de PAS, lo reafirma. En cuanto a la presencia del material
PAS positivo, con diferente grado de intensidad, dentro de la gran cantidad de
vacuolas citoplasmáticas y gránulos, creemos que puede deberse a acumulación
de productos derivados del metabolismo celular.
Es importante resaltar que A. aegypti no es vector de Leishmania, pero si de otras

infecciones que afectan a los animales y al hombre; entre estas tenemos: dengue,
fiebre amarilla y filariasis (Brito et al. 1999, Harrington et al. 2005). No obstante,
líneas celulares derivadas de mosquitos han sido utilizadas como posibles modelos
in vitro para el establecimiento y aislamiento de algunos patógenos, que no están
necesariamente relacionados con sus hospederos naturales. Son ilustrativos al
respecto, los ejemplos siguientes: en 1973 Buckley demostró la capacidad
del Toxoplasma gondii de sobrevivir en tres líneas celulares de Aedes (A.
albopictus, A. aegypti y A. w-albus). Mazzola et al. (1976, 1979), realizaron la
infección de células de A. albopictus con Anaplasma marginale, en donde se
observaron eritrocitos infectados con el parásito, fagocitados por las células de A.
albopictus, así como formas libres del parásito, en el citoplasma de éstas. En el
2006 Horta et al., reportaron el aislamiento y establecimiento de Rickettsia felis en
la línea celular C6/36 de A. albopictus. Estudios realizados por Dedet y Gaudin
(1977), reportan la capacidad de internalización y transformación del parásito L.
donovani en cultivos celulares derivados del mosquito A. albopictus, logrando así su
infección.
En el presente trabajo se demostró que las formas promastigotas de L.

panamensis tienen la capacidad de transformarse en amastigotes en células
derivadas de tejidos embrionarios del mosquito A. aegypti; lo anterior, fue también
observado con las especies L. chagasi y L. braziliensis en la misma línea celular de
mosquito (Muñoz et al. 2005). La adhesión e internalización del parásito en estos
13
cultivos celulares, son debidos probablemente, a la posible actividad endocítica o

fagocítica de algunas células del mismo cultivo. Lo cual coincide con los hallazgos
registrados en células de origen embrionario de Drosophila, que permitieron
detectar ciertos receptores parecidos al de los macrófagos en mamíferos que actúan
en la fagocitosis (Echalier 1997).
En el proceso infectivo del parásito en los sustrato celulares derivados de A. aegypti,

se debe tener en cuenta la presencia de ciertos carbohidratos en la superficie de
promastigotes, responsables de la adhesión del parásito con el intestino del
flebótomo (Sacks y kamhawi 2001). La forma promastigota de todas las especies
de Leishmania sintetizan LPG, considerado el mayor glicoconjugado de superficie
en el promastigote (Turco y Descoteaux 1992). Una de las funciones de esta
molécula es la adhesión del parásito al epitelio intestinal del vector (Muskus y Marin
2002). También, es posible que la afinidad del parásito con células derivadas de los
mosquitos, pueda estar relacionada con sistemas ligando- receptor conservados en
insectos (Muñoz et al. 2005).
Los porcentajes de infección hallados en los días 3, 6 y 9 postinfección, en este

estudio, fueron mayores a los observados en cultivos celulares de A.
aegypti infectados con L. chagasi, pero menores en comparación a los infectados
con L. braziliensis (Muñoz et al. 2005). Estas diferencias tal vez sean debidas, al
polimorfismo del LPG entre especies de Leishmania, lo cual ha demostrado que en
condiciones in vivo, estas moléculas intervienen en la capacidad de adhesión del
parásito con el intestino del vector (Pimenta et al. 1994). Por otro lado, el posible
éxito de la infección en las células de A. aegypti, se debe parcialmente a que la
temperatura (26 °C) es óptima para el mantenimiento de los cultivos y
simultáneamente para los promastigotes de Leishmania (Zilberstein y Shapira 1994,
Muñoz et al. 2005).
Con los hallazgos observados en este trabajo por microscopia de luz y electrónica
se confirmó la internalización y transformación del parásito, demostrando la
capacidad que tiene las células de este cultivo celular de ser infectadas por L.
panamensis, lo cual permitiría proponer a este cultivo celular como un posible
modelo in vitro para el estudio de la interacción parásito-vector.
Agradecimientos
A Manuel Guillermo Forero por sus conocimientos y capacitaciones para el manejo

del software ImageJ. A Cesar Augusto Díaz, por el apoyo brindado para el
procesamiento de los resultados. A Andrés Ramírez, por el manejo y mantenimiento
de los cultivos celulares y los parásitos. A Colciencias y al Instituto Nacional de
Salud por la financiación del joven investigador Alfonso Arturo Miranda H. A la
Universidad de La Salle, a la Universidad del Rosario y Colciencias por la
financiación del presente trabajo.
14
Resumen
La primera línea celular de Aedes aegypti fue establecida por Grace en 1966 y
desde entonces se han utilizado para el estudio de virus, bacterias y parásitos. En
el presente trabajo se describen, por primera vez, algunas características
citoquímicas de los cultivos celulares de A. aegypti, infectados con la cepa
(MHOM/CO/87CL412) de Leishmania panamensis. También se realizó un estudio
morfológico de las células del cultivo. Se observaron 30 células pequeñas con
apariencia fibrolastoide de 10.84±2.54 µm de largo y 5.31±1.26 µm de ancho; otras
30 presentaron apariencia epitelioide con 23.04±4.00 µm de largo y 13.96±3.70 µm
de ancho; éstas últimas predominaron sobre las de apariencia fibroblastoide. De
113 células, un 7.08%, presentaron abundantes gránulos citoplasmáticos positivos
con la coloración de PAS, indicando presencia de polisacáridos. La prueba de
peroxidasa dio un resultado negativo. El mayor porcentaje de infección (18.90%),
de un total de 101 células, se presentó el día 6. Ultraestructuralmente, las células
presentaron un citoplasma con aspecto vacuolado; algunas contenían parásitos,
otras material fibrilar y otras estaban vacías. Los resultados indican que los cultivos
celulares de A. aegypti pueden ser infectados por L. panamensis y mantener dicho
proceso por aproximadamente una semana.
Palabras clave: ácido periódico schiff, cultivos celulares, Aedes

aegypti, Leishmania panamensis, microscopia electrónica de transmisión.
15
MATERIALES
Cultivo de linfocitos
Tubo heparinizado
Se utilizan para producir plasma para pruebas bioquímicas. El gel es un material

especial diseñado para formar una barrera resistente entre los componentes
celulares de la sangre y el suero durante la centrifugación.
Cámara de flujo laminar
Estas cabinas están diseñadas para proporcionar un aire limpio y constante a una
velocidad de paso de aire de 0,3 a 0,5 metros por segundo para así barrer la
superficie de la zona de trabajo y evitar la suspensión de partículas así como una
posible contaminación de las muestras.
16
Tubo estéril
Son para uso de rutina en laboratorio. Disponibles de polipropileno translúcido y

poliestireno claro en varias presentaciones. Biológicamente inertes y libres de
agentes que causan moho Moldeados con precisión para asegurar una superficie y
tamaño uniforme. Disponibles en bolsas Zip-Lock o en charolas para fácil
manipulación.
Incubadora
Utilizado para cultivar y mantener cultivos microbiológicos o cultivos celulares.

La incubadora mantiene una temperatura y humedad optima garantizando también
otras condiciones tales como el dióxido de carbono (CO2) y contenido de oxigeno
presente en la incubadora
17
RPMI
El medio líquido definido químicamente se usa para proporcionar nutrientes para el

crecimiento del cultivo celular en aplicaciones de investigación, diagnóstico y
fabricación. RPMI es un medio de uso general con una amplia variedad de
aplicaciones para células de mamíferos (en especial, las células hematopoyéticas).
Suero fetal bovino
El suero es la fracción líquida de la sangre coagulada, sin células, fibrina o factores

de coagulación, pero que contiene un gran número de factores macromoleculares y
nutricionales esenciales para el crecimiento celular. La albúmina sérica bovina es el
componente más abundante del suero fetal bovino.
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Filohemaglutanina
Es un agente mitogénico que se ha utilizado en estudios sobre la permeabilidad de

las células.
Penicilina y estreptomicina
Se utilizan como suplementos de medios para reducir las tasas de infección
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Procedimiento de Drosophila Melanogaster
Agitador magnético
Es un instrumento magnético para mezclar soluciones o líquidos de poca

viscosidad.
Agar
Es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de

cultivo, los cuales deben estar exentos de todo microorganismo contaminante para
facilitar la identificación, crecimiento y desarrollo de otros microorganismos que
crecen en sustancias alimenticias artificiales preparadas
20
Gentamicina
Se utilizan como suplementos de medios para reducir las tasas de infección
Acido propiónico
El ácido propiónico inhibe el crecimiento de moho y de algunas bacterias.
Levadura
Son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de

carbono, produciendo distintas sustancias
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Frascos de vidrio estéril
Utilizados para el almacenaje de sustancias
22
ACTIVIDADES
b) Utilizando el mapa mórbido humano, identifique 10 loci cromosómicos de 10
enfermedades humanas relevantes.
Enfermedad Locus
Mucoviscidosis 7q31.2
Enfermedad de Gaucher 1q21
Cáncer familiar de colon 8q21
Diabetes mellitus 11p15.5
Fenilcetonuria 12q23.2
Retinoblastoma 13 q14.2
Amiloidosis 11p15.1
Enfermedad del Alzheimer 14q24.3
distrofia miotónica 3 q21.
Deficiencia de ADA 20q13.12
*Enlace 1 https://www.youtube.com/watch?v=AHeRD6HGbQU. MOOC

Biomateriales: 9.2.1 Introducción a los cultivos celulares sobre biomateriales.
Cuestionario-Enlace1
1.Desventaja del uso de suero fetal bovino como fuente de nutrientes
naturales
R// El suero tiene una composición que no es exacta y eso provoca que haya mucha
variabilidad entre un lote con otro lote de suero.
2. Cuál es el % de tensión de oxígeno y dióxido de carbono ideal, cual es la

importancia del control de estas dos variables.
R// La tensión de oxígeno es de 20% y 5- 10% de CO2 La importancia es que dentro
del organismo las células están sometidas a una presión parcial de oxígeno mucho
menor, por ejemplo, en la medula ósea hay una tensión del 1 al 7% de oxígeno. Al
presentar eso sucede que provoca un estrés oxidativo y hay normalmente cambios
en el comportamiento de la célula, por lo tanto, se recomienda trabajar con el 20%
de oxigeno
23
3.Defina
• Hipoxia: Si se trabaja con porcentajes menores de oxigeno a los que se
encuentran en el tejido
• Normoxia: Si se trabaja con un porcentaje equivalente de oxígeno a los que se
encuentran en el tejido
• Hiperoxia: Porque esta con un porcentaje de oxígeno por encima del normal en el
tejido
En cuál de estas condiciones se trabajan los medios de cultivo celulares In-vitro
R// Se trabajan en condiciones Normoxia
4. Cuál es el Ph ideal y la importancia del mantenimiento de este.

R// El pH ideal es alrededor de 7.4%, el anión de bicarbonato tiene que estar en
equilibrio con el CO2 del incubado para obtener el 7.4%
5. Que necesita el medio para tener una capacidad tamponante.

R// El anión de bicarbonato tiene que estar en equilibrio con el CO2 del incubador
para obtener la capacidad tamponante
6. Defina
• Isotónico: Las concentraciones de moléculas dentro de las células son iguales que
las concentraciones de moléculas en el medio, por lo tanto, hay equilibrio en el
sistema.
• Hipertónico: La concentración de moléculas en el exterior de la célula es mucho
mayor y por lo tanto el agua tiende a difundir desde la célula hacia el exterior
intentando equilibrar estas concentraciones, esto quiere decir que las células se
deshidratan.
• Hipotónico: La concentración de moléculas en el exterior de la célula es mucho
menor y por lo tanto la célula se hincha y al final puede acabar lisando
En cuál de estas condiciones se trabajan los medios de cultivo celulares In-vitro
R// Se trabajan en condiciones isotónicas
24
7. Investigue, los tipos de anticoagulantes que existen, su simbología, cuáles

de estos son los ideales para usar en Biología molecular (específico en cultivo
celular), explicar el porqué.
R// *Inyectables, como la Heparina o Fondaparinux
*Orales, como la Warfarina (Coumadin), Rivaroxabán (Xarelto) y Dabigatrán
(Pradaxa)
Ideales para cultivo celular:
1.EDTA
2. HEPARINA
3. CITRATO
4. Otros anticoagulantes con CITRATO: ACD, CPD, CPDA
Porque:
--No alterar el tamaño de los hematíes
− No producir hemólisis
− No alterar la morfología de los leucocitos

− Conservar la muestra (2)
8. Investigar y representar en grafica las fases del crecimiento celular y en

cuál de estas es la apropiada para realizar un sub- cultivo.
(16)
25
9. Investigación de la utilidad científica del cultivo de Drosophila

melanogaster.
Expertos mundiales presentan los últimos avances sobre enfermedades estudiadas

con el modelo de Drosophila.
Cáncer, drogadicción, enfermedades neurodegenerativas, epilepsia, deficiencias

del sistema inmunológico, patologías del sistema visual, cardiopatías. Es posible
avanzar en el conocimiento de éstas y otras muchas enfermedades gracias al
estudio de un minúsculo insecto, la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster).
Hoy en día, hay cerca de 5.000 científicos en todo el mundo que trabajan con este
organismo con resultados prometedores para la salud, y España se sitúa entre los
países líderes en la investigación con este modelo animal.
Por primera vez, veintiséis investigadores internacionales seleccionados por su
experiencia en el estudio de enfermedades humanas y que trabajan con Drosophila,
se reunirán para presentar y discutir sus avances. La reunión tendrá lugar en el Parc
Científic de Barcelona los próximos 5, 6 y 7 de octubre y se centrará en el uso y
explotación de Drosophila como herramienta para estudiar enfermedades humanas.
La conferencia está organizada por el IRB Barcelona (Instituto de Investigación
Biomédica) e ICREA (Institución Catalana de Investigación y Estudios Avanzados)
por iniciativa de Cayetano González y Marco Milán, Profesores de Investigación
ICREA en el IRB Barcelona y expertos en el campo de la biología celular y del
desarrollo.
Drosophila ha emergido como uno de los sistemas modelo más eficaces para
analizar la función de los genes cuyos homólogos humanos tienen un papel crucial
en muchas enfermedades, incluidos desórdenes neurológicos, metabólicos, y del
desarrollo, cáncer, patologías cardiovasculares y patologías de los sistemas visual,
auditivo e inmunológico.
Drosophila es un modelo único para estudiar determinados aspectos del cáncer. La
investigación sobre los procesos tumorales tendrá una presencia destacada en la
conferencia. Hablarán Ross Cagan, de la universidad de Washington, cuyos
recientes experimentos apuntan a un fármaco que tiene un efecto directo sobre la
progresión tumoral; Cayetano González, del IRB Barcelona (Instituto de
Investigación Biomédica) de Barcelona, que abordará la relación entre células
madre y cáncer; y Ginés Morata, de la Universidad Autónoma de Madrid, sobre la
apoptosis y la transformación tumoral.
Las cardiopatías se han incorporado recientemente a la lista de enfermedades
estudiadas con modelos de Drosophila. Rolf Bodmer, del Instituto Burnham, en
Estados Unidos, ha iniciado estudios sobre las arritmias y los fallos cardíacos. Su
conferencia “Arritmias y fallo cardíaco: el modelo de Drosophila en enfermedades
congénitas del corazón” aportará la aproximación más innovadora sobre el trabajo
con Drosophila. (15)
26
Mapa conceptual de la clasificación de los cultivos celulares
27
DISCUSION
CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES Y VEGETALES

Carlota Cobos Jiménez Alfonso Travieso López Laura Ruiz-Matas Mínguez
INGENIERIA DE PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS
INTRODUCCIÓN:
Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener

poblaciones celulares homogéneas, que luego pueden ser incluso mantenidas
y multiplicadas in Vitro (“en vidrio” = en recipientes especiales, en el laboratorio).
Los cultivos celulares son esenciales en la investigación científica, ya que
permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y en diversas
aplicaciones de la biotecnología, como la producción de moléculas de interés
[1]
industrial, ingeniería de tejidos, etc.
Obtención de células:
El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido

(generalmente formado por células de diversos tipos) consiste en separar la
matriz extracelular que las mantiene unidas. Para lograrlo, la muestra de tejido
es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que
degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes que
secuestran al ion calcio, del cual depende la adherencia celular, y mediante una
suave agitación, se obtiene una suspensión celular que contiene a todas las
células presentes en ese tejido, para separar los diferentes tipos celulares.
Cultivo de células:
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir,

multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las
cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células
pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas
28
bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de

moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se
pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa
más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos
celulares, se los denomina ensayos “in vitro”, para diferenciarlos de aquellos
que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo” (“en
organismo viviente”).
Recipientes se cultivan las células: existen numerosos contenedores y

recipientes para cultivar células y tejidos, dependiendo de las características de
las células a cultivar y de la escala deseada. Normalmente se hacen cultivos a
pequeña escala, pero cuando se necesita aumentar la escala del cultivo se
deben tener en cuenta numerosos parámetros, es necesario asegurar el
correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes y considerar
también problemas asociados como la aparición de metabolitos tóxicos como el
amonio y el ácido láctico.
Medio de cultivo:
Se utilizan placas con medios líquidos que contienen pequeñas cantidades de

una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación celular:
sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Además, la mayoría de los medios
incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma
de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos
medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, y por lo
tanto es difícil saber qué macromoléculas requiere un determinado tipo celular
para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos
medios químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen,
además de las pequeñas moléculas mencionadas, varias proteínas específicas
necesarias para la supervivencia y proliferación, como los factores de
crecimiento.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH
29
alrededor de 7,4 y tienen, además, indicadores de pH, como el rojo fenol, que
cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos como resultado del
metabolismo celular. Suelen agregarse también antibióticos y antimicóticos para
[2]
impedir la contaminación con microorganismos.
Tipos de cultivo celular:
Cultivos en monocapa: Las células permiten la formación de una monocapa que

cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace
que su multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí
(quiescencia).
Cultivos primarios: aquellos cultivos preparados directamente a partir de un

tejido u órgano, Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar
los distintos tipos celulares. En estos cultivos las células están vivas, conservan
sus características la morfología de las células del órgano del que fueron
aisladas, su proliferación es limitada y hay inhibición por contacto. El estar más
cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad
y funcionalidad similar a su ambiente natural.
Los cultivos primarios pueden ser removidos del recipiente de cultivo para
formar cultivos secundarios y en estas condiciones las células suelen
multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una
monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del contacto
entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las
subcultiva a un recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante
semanas o meses. En este estado, las células frecuentemente mostrarán
distintas propiedades según su origen.
Líneas celulares continuas: formadas por células con diferencian genética y

morfológica de las células de las cuales se originaron. Este tipo de cultivo tiene
la característica de no tener inhibición
por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a
30
línea se denomina transformación.
Cultivos en suspensión: se refiere al cultivo de células tomadas del tejido

original, de cultivos primarios de células o de una línea o cadena celular por
disgregación enzimática, mecánica o química, este cultivo necesita de una
monocapa adherente o un sustrato sólido que provea a las células un medio
adecuado para crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un
período de adaptación.
El cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o

cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado
tipo de célula.
Cultivos tridimensionales: Son aquellos que buscan mantener la característica

o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar
la proliferación y morfología epitelial y su interacción con otras células como son
las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de
sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.
[3]
Ventajas y desventajas del cultivo celular:
Las células cultivadas poseen distintas ventajas sobre organismos intactos

para la investigación de la biología celular:
- Las condiciones experimentales: por ejemplo, la composición del

medioambiente extracelular, pueden controlarse mejor en un cultivo que en un
organismo intacto. Se pueden controlar todos los factores del medio: físico-
químicos y fisiológicos.
- Caracterización y homogeneidad de la mezcla: la mayoría de los tejidos

animales y vegetales se componen de diversos tipos de células, mientras que
pueden ser cultivadas células de un único tipo específico con propiedades
31
homogéneas. En muchos casos una célula única puede ser cultivada más
rápidamente hasta formar una colonia de muchas células idénticas, proceso
denominado clonación celular. La cepa de células resultante es homogénea,
con morfología y composición uniformes, y se denomina clon. Esta técnica,
utilizada con muchas bacterias, levaduras y tipos de celulares mamíferos,
facilita el aislamiento de clones de células genéticamente distintas y permite
obtener un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave
problema de heterogeneidad de las muestras, asociado al uso de animales de
experimentación.
- Los cultivos de células permiten utilizar una concentración de reactivos

concretos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo
requerido para la inyección del reactivo in vivo, su excreción y su posterior
distribución a los tejidos en estudio.
- Motivaciones éticas: Aunque los estudios in vivo resulten más económicos que
los in Vitro son descartados porque el uso de la experimentación en animales
[3]
resulta cuestionado en aspectos legales, morales y éticos.
En cuanto a las desventajas del cultivo celular:
Una desventaja principal en el cultivo de células es que no se encuentra en su

ambiente normal y por lo tanto sus actividades no están reguladas por otras
[1]
células y tejidos, como ocurre con un organismo intacto.
- Técnica sensible: El crecimiento de las células animales supone la necesidad

de mantener las condiciones de asepsia (ausencia de microbios o de infección)
en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido
como del personal calificado para su manipulación.
- Cantidad y costo: El costo de producción de 1 g de tejido en cultivo es más de

10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo, existe una limitación de
producción, que es del orden de 10 g de células en un laboratorio normal, y que
para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial.
32
- Inestabilidad: Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como

consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide (cambio en el número
cromosómico).
-Validez del modelo 'in Vitro': El cultivo celular aporta unas respuestas cuya
validez se pueden cuestionar puesto que carecen de los componentes
sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis “in
vivo”, es decir, la célula se puede comportar de un modo diferente al no
encontrarse en su entorno, ha perdido la organización espacial tridimensional
propia del tejido y se han perdido las interacciones heterotópicas,
[1]
especialmente los sistemas nervioso y endocrino.
1. CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES:

En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un
conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de
que un explanto (es decir, una parte separada del vegetal, tales como
protoplastos, células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio
artificial de composición química definida y se incuba en condiciones
ambientales controladas, involucra a diferentes técnicas de cultivo de material
vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared
celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras
técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio
nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se
lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio
[3]
(hoy también de otros materiales).
Esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se recogen a
continuación:
• Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil

propagación por otros métodos, o en vías de extinción
• Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables
durante todo el año.
33
• Obtención de plantas libres de virus.

• Producción de semillas sintéticas.
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan
la variabilidad genética de una población vegetal)
• Obtención de metabolitos secundarios
• Producción de nuevos híbridos
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)
• Germinación de semillas.
• Producción de haploides.
Totipotencialidad:
La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente

modificadas o transgénicas. La reproducción asexual de plantas por cultivo de
tejidos es posible gracias a que, en general, varias células de un individuo
vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el
desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión
de células sexuales o gametas. Esta capacidad es característica de un grupo
de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en los
distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una
célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y
eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de
diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o
[4]
completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta.
El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se

denominará explano, como por ej. El ápice, una hoja o segmento de ella,
segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla
en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se
regenerarán una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des
34
diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para

producir semillas artificiales.
▪ Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados
En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las

siguientes etapas:
1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.

2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos
(generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al
medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático
según se desee.
3) Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la
regeneración del número de plantas necesarias.
4) Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de
convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.
5) Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a
las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte).
▪ Cultivo in vitro y la biotecnología:

• La micropropagación vegetal:
A partir de una planta madre se obtienen

numerosos explantos que, sujetos a
condiciones y medios de cultivo adecuados,
darán lugar a nuevas plantas iguales a la
planta original, permitiendo su multiplicación.
(figura 1)
Figura 1 micropropagación vegetal.
• El cultivo de meristemas:
A partir de un meristema aislado se puede obtener una planta completa. (figura

2)
35
Figura 2 cultivo de meristemas.
• Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores:
A partir de un explanto se pueden

establecer cultivos de células para
producir compuestos de interés, o para
obtener embriones somáticos y semillas
[5]
artificiales, entre otras aplicaciones.
(figura 3)
Figura 3 cultivo de células y órganos vétales en biorreactores.
2. CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES:
3.1 ¿Qué son las células animales y para qué sirven?
Las células animales tienen varias características que las diferencian de otras
células u organismos utilizados en la biotecnología. Son células de eucariotas
superiores, por lo que poseen núcleo y diversos organelos, tales como retículo
endoplásmico y aparato de Golgi [7]. Además, carecen de pared celular y son
más grandes que las levaduras o bacterias, con un diámetro aproximado de
entre 10 y 20 µm. Las diversas líneas celulares utilizadas en biotecnología
poseen distintas características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas. Las
células animales se pueden derivar de tejido epitelial, conectivo, muscular o
nervioso. A diferencia de eucariotas inferiores (hongos, levaduras) y bacterias,
el cultivo de células animales representa retos enormes, ya que, entre otras
36
características, las células animales son muy sensibles a estreses comúnmente

encontrados en biorreactores, presentan requerimientos nutricionales
complejos, crecen lentamente y sólo dentro de intervalos estrechos de variables
como pH, temperatura y osmolaridad. Como resultado, los equipos,
instalaciones y bioprocesos necesarios para cultivar células animales son
sofisticados y costosos, ya que, entre otras cosas, requieren garantizar
esterilidad absoluta a lo largo de la operación [8]. Asimismo, las concentraciones
máximas de células y de productos son muy bajas (en general varios órdenes
de magnitud por debajo de aquellos obtenidos con bacterias y eucariotas
inferiores) y, por ende, las productividades también son bajas. Todo esto explica
el alto costo de los productos fabricados a través de esta tecnología.
¿Por qué entonces emplear células animales? Existen varias razones, entre las
cuales la más importante es que son capaces de producir proteínas altamente
parecidas a las que sintetiza el cuerpo humano, pues están más cerca
evolutivamente que las bacterias o levaduras.
En términos económicos, los productos derivados de células animales tienen

actualmente un mercado de más de diez mil millones de dólares anuales,
mientras que su impacto en el incremento de la calidad de vida y salud humana
es incalculable.
3.2 CÉLULAS MADRE
3.2.1 DEFINICIÓN DE CELULA MADRE
Las células madre, su nombre en inglés “stem cells” significa “células tronco”,
ilustrando de otra manera la función vital que éstas cumplen en todos los
organismos multicelulares son las células originarias, no especializadas ni
formadas para una determinada función, que antes de formarse el embrión, se
están multiplicando en el zigoto. El zigoto se forma después de la fecundación
del óvulo por el espermatozoide y es en el mismo instante de la fecundación
cuando se forman las
células madre y empiezan a reproducirse hasta que, al tercer mes de embarazo
37
aproximadamente comienzan a especializarse para formar los diferentes

órganos del feto [9].
Las células madre son células que se encuentran en todos los organismos
multicelulares y que tienen la capacidad de dividirse (a través de la mitosis) y
diferenciarse en diversos tipos de células especializadas y de auto-renovarse
para producir más células madre. En los mamíferos, existen diversos tipos de
células madre que se pueden clasificar teniendo en cuenta su potencia, a saber,
el número de diferentes tipos celulares en los que puede diferenciarse.
3.2.2 IMPORTANCIA DE LAS CÉLULAS MADRE
En la actualidad, se ha descubierto que las células madre pueden regenerar

cualquier tejido insertándolas en alguna fisura de éstos. Esto se explica a partir
de que las células madre tienen la capacidad de dividirse asimétricamente
dando lugar a dos células hijas, una de las cuales tiene las mismas propiedades
que la célula madre original (autorrenovación) y la otra adquiere la capacidad
de poder diferenciarse si las condiciones ambientales son adecuadas. La
mayoría de los tejidos de un organismo poseen una población residente de
células madre que permiten su renovación periódica o su regeneración cuando
se produce un daño tisular.
La regeneración tisular consiste en producir nuevas células que reparen el tejido

dañado y también remplacen a las células que van muriendo naturalmente a lo
largo de la vida de un organismo.
3.2.3 TIPOS DE CÉLULAS MADRE
Se distinguen principalmente dos tipos de células madres: embrionarias y

adultas. Las primeras provienen de las etapas tempranas del embrión en
desarrollo, y tienen la valiosa capacidad de producir absolutamente todos los
tipos de célula que conformarán al cuerpo adulto completamente desarrollado.
Las células madre adultas derivan de las embrionarias y cumplen funciones
específicas del órgano que conforman (por ejemplo, las células de la médula
ósea pueden producir cualquier componente de la sangre y del sistema
38
inmunitario). Sin embargo, recientes estudios indican que las células madre
adultas de todo el cuerpo tendrían la capacidad latente de tomar cualquiera de
las demás funciones celulares.
Existen diferentes técnicas para la obtención directa de células madre

embrionarias pero la técnica más utilizada es la crioperservación o
crioconservación. Es un método que utiliza nitrógeno líquido (-196ºC) para
detener todas las funciones celulares y así poderlas conservar durante años.
3.2.4 TRATAMIENTOS CON CÉLULAS MADRE
Las propiedades especiales de las células madre han despertado el entusiasmo

de los biólogos y los médicos en todo el mundo, ya que tienen un potencial
enorme para curar o tratar enfermedades graves, difíciles o incurables, como el
cáncer, el mal de Alzheimer, el mal de Parkinson, la diabetes,
la artritis, la depresión, la esquizofrenia y los padecimientos cardíacos. Los
avances más recientes en el entendimiento del genoma humano prometen la
aparición de nuevas curas para estas y otras enfermedades durante las
próximas décadas, y hasta la posible erradicación de todas las enfermedades
de origen genético durante el siglo XXI [10].
3. APLICACIONES EN MEDICINA:
La llegada de la ingeniería genética ha supuesto que numerosas proteínas
potencialmente terapéuticas, que antes se producían sólo en pequeñas
cantidades, puedan elaborarse en grandes cantidades. Hoy en día existen
cientos de genes de proteínas terapéuticas que se han expresado a nivel de
laboratorio, y que están intentando demostrar su adecuación clínica. Ya existen
más de 30 proteínas aprobadas para su uso clínico.
El porcentaje de proteínas terapéuticas que se fabricarán por métodos

recombinantes irá creciendo con el tiempo.
Algunos ejemplos son:
39
• Insulina: el primer caso de proteína por ingeniería genética aprobada para

uso en humanos.
• Hormona del crecimiento.
• DNasa-I.
• Activador tisular del plasminógeno (tPA).
Una mención especial merece las vacunas recombinantes:
Las vacunas tradicionales suelen ser de dos tipos: microorganismos inactivados

(muertos) o microorganismos vivos pero atenuados, y normalmente requieren
cultivar el microorganismo responsable de la enfermedad frente a la que se
pretende inmunizar. Pero hay varios inconvenientes con este tipo de enfoque:
• No todos los microorganismos se pueden cultivar.

• La producción a menudo es cara en el caso de las vacunas frente a virus.
• Se requieren medidas de seguridad en los laboratorios productores que
manejan el patógeno.
• Se requieren medidas muy estrictas para asegurar la completa
inactivación o la atenuación adecuada de la cepa. De vez en cuando, la
cepa atenuada puede recuperar la virulencia.
• Hay enfermedades, como el sida, que no parecen doblegarse al
diseño tradicional de vacunas.
La tecnología del ADN recombinante permite nuevos enfoques para el

diseño y producción de vacunas:
• Vacunas a base de subunidades del agente patógeno.

• Nuevas vacunas atenuadas: la estrategia básica estriba en manipular un
agente patógeno para eliminarle genes de virulencia mientras que retiene
su capacidad de estimular el sistema inmunitario. De esta forma, el
microbio manipulado se podría emplear como vacuna viva atenuada
segura, sin miedo a que revierta al tipo virulento, como pasa hoy.
Ejemplos: cólera o salmonella.
• Vacunas vectores: uso de microorganismos no patógenos
40
que incorporan genes determinantes de antígenos

protectores para ciertas enfermedades.
Otro punto fuerte de actuación de la ingeniería genética en medicina es la

producción de
antibióticos:
o Mejoras en procesos tradicionales: p. ej., ampliando los "cuellos de botella"

metabólicos con ingeniería metabólica.
o Síntesis de nuevos antibióticos:
▪ Fusionando rutas de dos antibióticos diferentes.
▪ Manipulando racionalmente rutas de antibióticos.
4. PAPEL DE LOS CULTIVOS EN UN MEDIO AMBIENTE SOSTENIBLE:
5.1 Posible papel de la Biotecnología vegetal en una agricultura más

sostenible
Independientemente de que aún se pueda exprimir más el potencial de la

revolución verde, o de que se pueda ayudar con ella a las zonas -especialmente
del África subsahariana- donde no llegó, está claro que el paradigma actual no
es sostenible ecológicamente ni garantiza la seguridad alimentaria para el futuro
de la humanidad. Y junto con adecuadas políticas fiscales, habrá que ir
mentalizando a las poblaciones de los países ricos para que cambien algunos
hábitos de consumo: renunciar a productos y prácticas que requieran uso
excesivo de energía y de materiales, con objeto de ayudar a salir del
escandaloso pozo de miseria en que vive una masa enorme de la humanidad.
Los principales retos de la biotecnología en una agricultura más sostenible son:
• Aumentar la producción por unidad de superficie cultivada, lo que en

principio podría desincentivar la roturación de más tierras marginales y
áreas de gran valor ecológico.
• Lograr una menor dependencia de los insumos intensivos en energía y
materiales que hasta ahora ha caracterizado a la Revolución Verde
41
(combustibles fósiles, pesticidas, fertilizantes).

• Permitir prácticas agrícolas menos dañinas, mediante un mejor
aprovechamiento del agua, menores necesidades de laboreo,
agricultura de precisión, etc.
• Disminuir las pérdidas pos-cosecha.
42
Mejorar la calidad del producto fresco o procesado.
En muchos de estos ámbitos la Ingeniería Genética está llamada a desarrollar

un importante papel. Veamos algunos ejemplos:
• Caracterización y censo de genomas:

• Bioindicadores:
• Mejores técnicas de diagnóstico de enfermedades
• Apomixis:
• Plantas de cultivo perennes de alto rendimiento:
Mención aparte merecen las cuestionadas (por algunos grupos ecologistas,

sobre todo) plantas transgénicas. Los transgénicos son organismos a los
cuales se han introducido uno o más genes provenientes de otra especie. Las
plantas transgénicas poseen genes de todas las procedencias: de otras plantas,
de animales, de bacterias, de virus y de hongos, y muchas veces poseen
combinaciones de ellos para conferirles características puntuales como
resistencia a químicos, a condiciones ambientales adversas, a insectos, etc.
Desventajas de las
Beneficios de las plantas transgénicas plantas
transgénicas
1. Resistencia a insectos 1. Los insecticidas Bt y similares
2. Resistencia a herbicidas 2. Producción de súper plagas
3. Mejora de la productividad y producción 3. Resistencia a antibióticos

4. Mejora de la calidad nutritiva 4. Inestabilidad genética
5. Control de enfermedades virales 5. Interacción ecológica negativa
6. Tolerancia al estrés ambiental 6. Riesgo a la biodiversidad
7. Producción de frutos más resistentes 7. Transferencia horizontal de
genes
8. Producción de plantas birreactoras 8. Aparición de alergias
9. Fijación de nitrógeno 9. Medio ambiente
43
10. Mejora con fines ornamentales

11. Producción de fármacos y vacunas
En un futuro se cree poder desarrollar plantas transgénicas capaces de resistir

frío, sequías, salinidad o estrés hídrico, de crecer en suelos ácidos o con alto
rendimiento de metales, capaces de producir frutas más grandes o, incluso,
cambiar el sabor de algunos vegetales. [9]
5.2 Procesos industriales “verdes”.
La mejor opción para reducir la contaminación es actuar en el origen y no

esperar a que se produzca para luego mitigarla. Para intentar acercarnos a
estas tecnologías se requieren una serie de cambios en las prácticas
industriales:
• Cambios en los procedimientos industriales

• Cambios tecnológicos: cambios de procesos, de operación y de
automatización
• Cambios en las materias primas.
En estos dos últimos es donde la biotecnología puede suponer un gran avance,

debido a su potencialidad de emplear materiales biodegradables y de recurrir a
procesos de base enzimática que requieren menos aporte de energía que los
métodos tradicionales, con sustitución de sustancias químicas por otras
biológicas menos o nada contaminantes. [10]
5. BIBLIOGRAFÍA
• [1] “Biología celular y molecular”. Autores: Lodish. Berk. Matsudaira.

Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. Editorial Panamericana.
• [2] “Los cultivos celulares y sus aplicaciones”.Autor: María Eugenia

Segretín.
• [3]
http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20E
uge.pdf
44
• [4] http://myprofeciencias.wordpress.com/tag/celulas-totipotenciales/
• [5] Pierik, R.L.M. (1987) In vitro culture of higher plants. Editorial Martinus
Nijhoff Publishers.
• [6]http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libr
os/celular/cultivo s.htm
• [7]http://biotecnologia-robles.blogspot.com.es/2011/11/cultivos-de-celulas-
animales.html
• [8]http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/agbt/teoricos/2011_21%20Culti
vos%20de%20celu las%20animales.pdf
• [9[http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/nov_art104a.pdf
• [10]http://www.ecojoven.com/uno/05/celulasm.html
• [11] http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/ambio.htm#_ftn11
• [12] Un ensayo breve sobre las promesas y riesgos de la biotecnología
ambiental, incluyendo la no basada en ADN recombinante, en Amils
2000.
45
Haga una breve comparación sobre el cultivo de células animales y cultivo de

células vegetales.
CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES

Son células de eucariotas superiores, por lo que El cultivo de tejidos vegetales se define como un
poseen núcleo y diversos organelos, tales como conjunto muy heterogéneo de técnicas que
retículo endoplásmico y aparato de Golgi [7]. presentan en común el hecho de que un explanto
Además, carecen de pared celular y son más (es decir, una parte separada del vegetal, tales
grandes que las levaduras o bacterias, con un como protoplastos, células, tejidos u órganos)
diámetro aproximado de entre 10 y 20 µm.
El cultivo de células animales representa retos Se cultiva asépticamente en un medio artificial de
enormes, ya que, entre otras características, las composición química definida y se incuba en
células animales son muy sensibles a estreses condiciones ambientales controladas, involucra a
comúnmente encontrados en biorreactores, diferentes técnicas de cultivo de material vegetal
presentan requerimientos nutricionales diverso, incluyendo a los protoplastos (células
complejos, crecen lentamente y sólo dentro de desprovistas de su pared celular), células,
intervalos estrechos de variables como pH, tejidos, órganos y plantas completas.
temperatura y osmolaridad.
En términos económicos, los productos El cultivo in vitro consiste en tomar una porción
derivados de células animales tienen de una planta (a la que se denominará explanto,
actualmente un mercado de más de diez mil como por ej. El ápice, una hoja o segmento de
millones de dólares anuales, mientras que su ella, segmento de tallo, meristema, embrión,
impacto en el incremento de la calidad de vida nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un
y salud humana es incalculable. medio nutritivo estéril (usualmente gelificado,
semisólido) donde se regenerarán una o muchas
plantas.
La más importante es que son capaces de Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es
producir proteínas altamente parecidas a las posible obtener plantas libres de microbios en un
que sintetiza el cuerpo humano, pues están medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones
más cerca evolutivamente que las bacterias o ambientales controladas.
levaduras.
Las diversas líneas celulares utilizadas en A partir de un explanto se pueden establecer
biotecnología poseen distintas características cultivos de células para producir compuestos de
morfológicas, bioquímicas y fisiológicas. Las interés, o para obtener embriones somáticos y
células animales se pueden derivar de tejido semillas artificiales, entre otras aplicaciones
epitelial, conectivo, muscular o nervioso.
46
CONCLUSIONES
1. En cuanto a lo abordado con anterioridad se presentan problemas de

inestabilidad genética al realizar pases de cultivos de células no
transformadas.
2. En este sentido la importancia del control del ambiente artificial presenta

una serie de desventajas y una de las más importantes es que La
diversidad genética es muy baja
3. Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de células en general

es el de las contaminaciones. Las células eucariotas en cultivo crecen
lentamente, con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a
las 24 h.
47
CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las células totipotenciales?
R// Estas células del embrión en sus fases iniciales (1)
2. ¿Qué son las células pluripotenciales?
R// Estas células que tienen capacidad para dar lugar a cualquier estirpe celular,
pero no a un embrión completo (3)
3. ¿Qué órganos humanos poseen células madres?
R// Las células madre vienen en muchas formas diferentes. Los científicos creen
que cada órgano de nuestro cuerpo tiene su propio tipo específico de células madre.
Por ejemplo, nuestra sangre viene de células madre de la sangre (también
conocidas como hematopoyéticas). Las células madre también están presentes
durante las etapas tempranas del desarrollo humano, y cuando los científicos
cultivan estas, se denominan “células madre embrionarias”. La razón por la que los
científicos están entusiasmados con las células madre embrionarias es que el
trabajo natural de las estas células es el de construir todos los órganos y tejidos en
el cuerpo durante el desarrollo humano. Lo que esto significa es que las células
madre embrionarias, a diferencia de las células madre adultas, pueden ser dirigidas
potencialmente a la formación de casi cualquier otro tipo de los cientos que existen
de células humanas. Por ejemplo, mientras que la célula madre sanguínea sólo
puede formar sangre, una célula madre embrionaria puede formar sangre, hueso,
piel, cerebro, y así sucesivamente. Además, las células madre de embriones son
programadas por la naturaleza para formar tejidos e incluso órganos, mientras que
las células madre adultas no lo son. Esto significa que las células madre
embrionarias tienen una mayor capacidad natural para reparar los órganos
enfermos. Las células madre embrionarias se producen a partir de embriones de
unos pocos días de edad, sobrantes de tratamientos de fertilización in vitro, material
que si no es utilizado es desechado. (4)
48
4. ¿Qué es la senescencia celular?
R// La senescencia celular se refiere a la respuesta de las células, mitóticamente

competentes (células no diferenciadas terminalmente y que por lo tanto tienen la
capacidad de dividirse) frente a estímulos que tienen la potencialidad de causar
transformaciones neoplásicas y está dada entre otros aspectos, en un arresto de su
crecimiento. (5)
5. ¿Qué son las líneas celulares continuas?
R// Cultivo que se establece a partir de un órgano o tejido, en muchos casos un

tumor, y que mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células inmortales
(6)
6. ¿Qué son los cultivos isotópicos?
R// Cuando las células son reagrupadas para recrear una estructura tridimensional
parecida al tejido original (7)
7. ¿Qué son los cultivos organotípicos?
R// Implica los mismos procedimientos anteriores, pero combinando células de

diferentes linajes que constituyen un órgano (8)
8. ¿Qué es la morfogénesis celular?
R// Es el proceso por el cual un grupo de embriones determinan el desarrollo de los

órganos, tejidos o células individuales del organismo de los seres vivos, como
también las características y funciones particulares de cada uno de esos
componentes. (9)
9. ¿Qué es la ecología celular?
R// Tiene sus raíces en el siglo XIX, cuando los estudiosos de la época plantearon
la hipótesis de que las células de los tejidos podrían comportarse de manera similar
a un organismo en busca de supervivencia en el medio ambiente. La teoría fue
reforzada por Ramón y Cajal, un neurobiólogo español, que llegó a la conclusión de
49
que cuando se formaban las células nerviosas, había una "lucha" para obtener
espacio y nutrirlas para seguir creciendo. Y de estas dos investigaciones nació Cell
Ecology, que propone que el desarrollo celular tiene una influencia directa en el
medio ambiente, que sería ecológico y defiende ciertos genes. (11)
10. Explique la micropropagación vegetal
R// A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que, sujetos a
condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales a
la planta original, permitiendo su multiplicación (12)
11. ¿Qué es la crio preservación celular?
R//La crio preservación tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y

funcionabilidad celular a temperaturas bajas. El entender y aplicar adecuadamente
la crio preservación de material biológico es fundamental para los bancos de células
de humanos y de células animales, los laboratorios de cultivo celular (mantener una
línea celular en cultivo continuo por largos periodos de tiempo es costosa, hay un
gran riesgo de contaminación así como la posibilidad de una alteración genética) y
los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una especial atención a la conservación
de tejidos, órganos y embriones humanos para ser utilizados en investigación y su
posterior aplicación terapéutica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos
biológicos.3 (13)
12. Explique el mecanismo de clonación exvivo
R//El cultivo del embrión ex vivo permitiría inducir la diferenciación de un cultivo de

células útiles para el trasplante de médula, el tratamiento de la enfermedad de
Parkinson, trasplantes de piel o de tejidos cardiovasculares. (14)
50
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Introducción
1. Miranda H A, Sarmiento L, Caldas M M, Zapata C, Bello G F. Morfología y citoquímica de cultivos

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77442008000200004&script=sci_arttext
Discusion
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Cuestionario
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51
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https://www.studocu.com/es/document/universidad-pablo-de-olavide/cultivos-
celulares/apuntes/tema-8-lineas-celulares-continuas/5877950/view
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http://www.scielo.org.co/pdf/rcog/v57n4/v57n4a08.pdf
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15. Ecologia Celular: Saiba O Que É | Meio Ambiente - Cultura Mix

[Internet]. Meioambiente.culturamix.com. 2020 [consultado el 2 de abril de 2020]. Disponible en:
https://meioambiente.culturamix.com/ecologia/ecologia-celular-saiba-o-que-e
16. uemor. Micropropagación vegetal [Internet]. Es.slideshare.net. 2020 [consultado el 2 de abril de

2020]. Disponible en: https://es.slideshare.net/uemor/micropropagacin-vegetal
52

Informe: Laboratorio de Genética para Microbiología, Martes-1500

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Laboratorio de Genética para Microbiología, martes-1500

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS

LABORATORIO DE GENETICA PARA MICROBIOLOGIA

GENESIS MAITE SANCHEZ RODRIGUEZ 20151022416

KIMBERLYN ONEYDA VELASQUEZ CRUZ 20181007315

NOMBRE DEL INSTRUCTOR: CESIA ARRIOLA

SECCION: MARTES 15OO

CIUDAD UNIVERSITARIA, TEGUCIGALPA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS

LABORATORIO DE GENETICA PARA MICROBIOLOGIA

GENESIS MAITE SANCHEZ RODRIGUEZ 20151022416

KIMBERLYN ONEYDA VELASQUEZ CRUZ 20181007315

NOMBRE DEL INSTRUCTOR: CESIA ARRIOLA

SECCION: MARTES 15OO

CIUDAD UNIVERSITARIA, TEGUCIGALPA

Morfología y citoquímica de cultivos celulares de Aedes aegypti (Diptera:

Abstract: Morphology and cytochemistry of Aedes aegypti’s cell cultures

Key words: periodic acid-schiff, cell cultures, Aedes aegypti, Leishmania

Con lo descrito en los anteriores antecedentes, se pretende resaltar la importancia

Existe un primer trabajo de infección con L. donovani en cultivos celulares de A.

un modelo alternativo in vitro para el estudio de los parásitos mencionados

En el presente trabajo se describe, por primera vez, algunas características

Cultivos celulares e infección: El mantenimiento de los cultivos celulares,

Procesamiento de muestras para microscopía electrónica: Se recibieron

Posterior al procesamiento de las muestras, se obtuvieron cortes semifinos de 1 µm

Finalmente, se realizaron cortes ultrafinos de 60 a 90 nm, coloreados con acetato

Morfometría celular: La captura de imágenes de las células en los días 3, 6 y 9

Sony Hyper HAD CCD-IRIS/RGB adaptada a un microscopio de luz Zeiss Axiophot.

Citoquímica: La detección de carbohidratos, se realizó mediante la coloración de

Se realizó la detección de peroxidasa por medio de la técnica de Diaminobencidina

Morfología: En los cultivos celulares correspondientes a células no infectadas, se

Citoquímica: Con relación a la reacción de PAS, se evidenció un 7.08% de células

En el Cuadro 2 se observa el porcentaje de células con gránulos PAS positivo, así,

Infección celular: La observación de los cultivos celulares de A. aegypti infectados

En el Cuadro 3 se observan los datos obtenidos del proceso de infección de la línea

Microscopia electrónica de transmisión: Ultraestructuralmente se identificó en

las células infectadas, se evidenció la presencia de formas promastigotas en el

La presencia de dos grupos diferentes de células en los cultivos celulares derivados

Es importante resaltar que A. aegypti no es vector de Leishmania, pero si de otras

En el presente trabajo se demostró que las formas promastigotas de L.

cultivos celulares, son debidos probablemente, a la posible actividad endocítica o

En el proceso infectivo del parásito en los sustrato celulares derivados de A. aegypti,

Los porcentajes de infección hallados en los días 3, 6 y 9 postinfección, en este

A Manuel Guillermo Forero por sus conocimientos y capacitaciones para el manejo

Palabras clave: ácido periódico schiff, cultivos celulares, Aedes

Se utilizan para producir plasma para pruebas bioquímicas. El gel es un material

Cámara de flujo laminar

Son para uso de rutina en laboratorio. Disponibles de polipropileno translúcido y

Utilizado para cultivar y mantener cultivos microbiológicos o cultivos celulares.

El medio líquido definido químicamente se usa para proporcionar nutrientes para el

Suero fetal bovino

El suero es la fracción líquida de la sangre coagulada, sin células, fibrina o factores

Es un agente mitogénico que se ha utilizado en estudios sobre la permeabilidad de

Se utilizan como suplementos de medios para reducir las tasas de infección

Procedimiento de Drosophila Melanogaster

Es un instrumento magnético para mezclar soluciones o líquidos de poca

Es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de

Se utilizan como suplementos de medios para reducir las tasas de infección

El ácido propiónico inhibe el crecimiento de moho y de algunas bacterias.

Son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de

Frascos de vidrio estéril

Utilizados para el almacenaje de sustancias