Assajos Biotecnologics

Informe n.13 TÍTOL Nom:

Iniciat: 18:15 - Oriol Marches
Acabat: 21:00 -Alicia Cano
Total hores: 2:45h Obtenció i determinació d’àcids -Arnau Ubach
nucleics
Curs: 2n d'anàlisi i control

OBJECTIU:

Aïllar el DNA de la saliva i d’un fetge de ternera.

MATERIAL I REACTIUS I LA SEVA CLASSIFICACIÓ:

MATERIAL DE VIDRE:

 Tubs d’assaig
 Vareta
 Vas de precipitat

MATERIAL ANALÍTIC I APARELLS:

 Centrifuga de taula
 Espectrofotòmetre UV-V
 Microscopi

MATERIAL DE PLÀSTIC

 Tubs falcon de 15ml

 Portaobjectes
 Cobreobjectes

REACTIUS:

 Tampó + detergent NaCl 0,14M

 Acetat magnèsic 1,5mM
 Clorur de potassi, KCL 5mM
 Dodecil suflfat sòdic (SDS al 1%
 Etanol absolut
 Tampó tris-EDT: Tris 10mM, EDTA 1mM pH 7,5
 Glicerina
 Aigua
 Sabó
 Alcohol

1
  Orceïna
 Sal

MOSTRA

 Teixit animal (fetge de ternera)

 Saliva

FONAMENT TEÒRIC:

Les cèl·lules eucariotes presenten un contingut en DNA molt major que les
cèl·lules procariotes. Les molècules de DNA en eucariotes es combinen amb proteïnes i
s'organitzen en fibres de cromatina en el nucli.
Les principals funcions del DNA són:

- Emmagatzemar la informació genètica completa, necessària per determinar l'estructura de totes

les proteïnes i RNAs de cada espècie.

- Programar en el temps i espai ordenadament la biosíntesis de les

cèl·lules i els components dels teixits.

- Determinar les activitats d'un organisme a través del seu cicle de vida.

- Determinar la individualitat d'un organisme donat.

Els RNAs, àdhuc sent molt més curts que els DNAs, són molt més
abundants en la majoria de les cèl·lules. Tant en cèl·lules eucariotes com a
procariotes les tres classes majoritàries de RNAs són: missatger (mRNA), ribosomal
(rRNA) i tranferasa (tRNA). Cadascun consta d'una cadena simple de
ribonucleòtids amb un determinat pes molecular, seqüència de nucleòtids i
funció biològica (veure bibliografia).
La quantitat i puresa dels àcids nucleics en una preparació pot
estimar-se mitjançant espectrofotometria. L'absorció a 260nm permet calcular
la seva concentració: 1 unitat d'absorbància (UA) correspon aproximadament a
50μg/ml per *DNA de cadena doble i 40μg/ml per DNA de cadena simple i
RNA. El quocient A260/A280 dóna una estimació de la puresa dels àcids nucleics:
una preparació pura de DNA i RNA té un valor de A260/A280 d'1,8 i 2,0
respectivament. Valors significativament menors indiquen contaminació amb
proteïnes o fenol, i, per tant, no serà possible quantificar amb precisió la
quantitat d'àcids nucleics.

2
PROCEDIMENT:

Mètode 1:

a) Obtenció d’àcids nucleics:

1. En un tub de vidre de fons rodó, prendre 0,1-0,2 g d'un fetge de vedella,

pesar-ho i anotar el seu pes humit.
2. Esmicolar-ho tant com sigui possible amb una vareta de vidre i afegir-li 10
vegades el pes humit (i ml) de tampó salí més detergent.
3. Transferir-ho a un tub Falcon de 15 ml (tub de plàstic amb tap vermell).
4. Afegir el mateix volum de fenol/cloroform/alcohol isoamílic que s'hagi
afegit de tampó salí amb detergent.
5. Agitar vigorosament.
6. Centrifugar a 3.500 rpm (en centrífuga de taula) durant 5 minuts i separar amb cura la
fase aquosa (fase superior).
7. . Afegir 1/10 del volum, de fase aquosa recuperada, d'acetat sòdic 3 M
pH 5,2, i barrejar bé.
8. Afegir, gota a gota, 2,5 volums, de fase aquosa recuperada, d'etanol absolut.
9. En afegir l'etanol el DNA precipita en forma d'un cabdell. Si no apareix el cabdell de
DNA de forma clara, incubar 5 minuts en gel (o en el congelador de la nevera).
Centrifugar a 3.500 rpm 5 minuts i resuspendre el precipitat d'àcids nucleics en 2 ml de
tampó Tris/EDTA pH 7,5. Si el cabdell es veu clarament, es pot "pescar" el DNA amb la
pipeta Pasteur, escórrer l'excés d'etanol i transferir-ho a un tub net que contingui 2 ml de
Tris/EDTA 1M pH 7,5.

Mètode 2:

1. S’agafen 500ml d’aigua i s’hi posa una cullerada de sal i es barreja.

2. De l’anterior dissolució se’n passen 3
cullerades a un altre vas.
3. Es golpeja durant un minut i s’aboca de nou al
vas evitant que es facin bombolles.
4. Es barreja amb una vareta que prèviament s’ha
sucat en sabó líquid transparent.
5. En un altre vas de precipitats s’hi posen 100ml
d’alcohol amb unes 3 gotes de colorant
alimentari.
6. S’aboca el contingut anterior, lentament i per
les parets del vas a sobre del vas on hi ha la barreja de saliva, fins que quedi un gruix de
2 cm.

3
 7. S’esperen uns 2,5 minuts i ies veu com s’ha format un núvol blanc amb filaments
(DNA).
8. Amb la vareta, suaument i fent-lagirar, s’intenta agafar un dels filaments que es disposa
sobre un portaobjectes.
9. Es tenyeix amb orceïna i abans de tapar-ho amb el cobreobjectes s’hi posa una petita gota
de glicerina.
10. Observar al microscopi els filaments de DNA.

CALCULS I RESULTATS:

Filaments de DNA al microscopi

260nm  0,9012

1u  50µg ADN

0,9012  x µg ADN x = 45,06 µg ADN

CONCLUSIONS:

Podem dir que el DNA s’obté de forma satisfactòria ja que l’hem pogut observar com es
separava les dues fases.