ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO DE TERBINAFINA CONTRA

HONGOS FILAMENTOSOS: Trichophyton rubrum, Trichophyton

mentagrophytes y Microsporum gypseum

Lucía L. Mantilla Ojeda, Asbleide K. Angarita

Maestría en investigación en enfermedades infecciosas.

Universidad de Santander, Bucaramanga, Colombia

ABSTRACT

Dermatophyte skin mycoses are the most common superficial infections in humans and animals. They
have become a problem of great interest in public health, as it not only generates high cost in
treatments, recurrent medical visits, but also can become a chronic disease of difficult management
despite having antifungal drugs with very good spectrum of action such as terbinafine. The aim of this
study was to evaluate the in vitro antifungal activity of terbinafine against three filamentous fungi
Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum gypseum, by means of
minimum inhibitory concentration (MIC 50), minimum fungicidal concentration (MIC 90), and percent
inhibition radial mycelium. After the experiments, terbinafine was determined to have a MIC 50
between 0.625 and 1.25μg / ml for Trichophyton mentagrophytes, which coincides with the minimum
fungicidal concentration of 0.625μg / ml. In addition, it was evidenced that there was a radial inhibition
of the mycelium in all concentrations of terbinafine tested in an experiment with Trichophyton rubrum
and decrease of the melanocytic pigment in greater proportion to a concentration of 300, 64.9, 11.1
μg / ml respectively. However, it is important to keep in mind for future experiments that the test
should be performed in triplicate, controlling for confounding variables such as incubation time and
conidia contamination of the same strain in petri dishes. We can conclude that these three methods
are complementary in the study of antifungal susceptibility for dermatophytes.

RESÚMEN
Las micosis cutáneas por dermatofitos son las infecciones superficiales más comunes en humanos y
animales. Se han convertido en un problema de gran interés en salud pública, ya que no solo genera
alto costo en tratamientos, visitas médicas recurrentes, sino que además pueden convertirse en una
enfermedad crónica de difícil manejo a pesar de contar con medicamentos antifúngicos con muy
buen espectro de acción como la terbinafina. En este estudio se pretendió evaluar la actividad
antifúngica in vitro de terbinafina contra tres hongos filamentosos Trichophyton rubrum, Trichophyton
mentagrophytes y Microsporum gypseum, por medio de la concentración mínima inhibitoria (MIC 50),
concentración fungicida mínima (MIC 90), y porcentaje de inhibición radial del micelio. Después de
los experimentos se determinó que la terbinafina presenta una MIC 50 entre 0.625 y 1.25 μg/ml para
Trichophyton mentagrophytes , lo cual coincide con la concentración fungicida mínima que fue de
0.625μg/ml. Además se evidenció que hubo una inhibición radial del micelio en todas las
concentraciones de terbinafina ensayadas en un experimento con Trichophyton rubrum y disminución
del pigmento melanótico en mayor proporción a una concentración de 300, 64.9, 11.1μg/ml
respectivamente. Sin embargo, es importante tener en cuenta para futuros experimentos que la
prueba debe realizarse por triplicado, controlando variables de confusión como el tiempo de
incubación y la contaminación por conidios de la misma cepa en las caja de petri. Podemos concluir
que estos tres métodos son complementarios en el estudio de susceptibilidad antifúngica para
dermatofitos.

Palabras claves: Terbinafina, Concentración mínima inhibitoria (CIM), fungicida, Inhibición

radial de micelio, hongos filamentosos.
INTRODUCCIÓN
Los dermatofitos son hongos hialinos que
tienen como característica principal la
colonización del tejido queratinizado, son
queratinolíticos, es decir que pueden
infectar piel, pelo y uñas en humanos y
animales. son una familia única a la cual
pertenecen 3 géneros principales que se
clasifican de acuerdo a sus
macroconidios:Trichophyton,
Microsporum y Epidermophyton(1). Los
Trichophyton desarrollan micro y MATERIALES Y MÉTODOS
macroconidios (escasas) de paredes
lisas, pueden ser de paredes gruesas o
delgadas, clavadas o fusiformes y de un
tamaño que oscila entre 4 a 50 µm, es la
causa principal de onicomicosis(1)(2). Los
Microsporum son causantes de micosis
superficiales y cutáneas tales como tiña
capitis y corporis, presenta al igual que los
Trichophyton micro y macroconidias, pero
difieren en la rugosidad de la pared
celular de sus macroconidias y que
además pueden presentar un tamaño
entre 7 a 160 µm(2)(3). Los
Epidermophyton son causantes de
infecciones mixtas, tanto de micosis
superficiales, cutáneas y de las uñas(2)
(3).
Las especies más frecuentemente
aisladas en las dermatofitosis son
Trichophyton rubrum y T. interdigitale,
Epidermophyton floccosum, Trichophyton
tonsurans, y en quinto y sexto lugar se
encuentran Trichophyton mentagrophytes
y Microsporum gypseum, los cuales
afectan a millones de personas
anualmente en el mundo reduciendo la
calidad de vida y llevando a altos costos
en tratamientos y múltiples consultas
médicas(5)(7)(8). Uno de los principales
tratamientos contra dichos agentes
etiológicos es la terbinafina de uso oral,
ya que por su acción fungicida y
fungistática, ocasiona la muerte celular de
los hongos al inhibir la enzima escualeno
monooxigenasa, que está encargada de
la síntesis de ergosterol, logrando de esta
manera el control de la infección(6). Por
ello, éste ensayo in vitro tiene como
objetivo conocer la actividad antifúngica,
la concentración mínima inhibitoria,
concentración fungicida mínima y la
inhibición radial del crecimiento del
micelio de la terbinafina como tratamiento
contra Trichophyton rubrum, Trichophyton
mentagrophytes y Microsporum gypseum.
Determinación de concentración
mínima inhibitoria (MIC 50):
Para la realización de este procedimiento
se seleccionó el protocolo de
microdilución en caldo M38A de la CLSI
donde se describe el método para la
realización de pruebas de sensibilidad
antifúngica a los hongos filamentosos
formadores de conidias.(5)
Para la concentración inhibitoria mínima
(MIC 50) se siguieron los pasos:
1. Preparar el inóculo: Un cultivo de
Trichophyton mentagrophytes (cepa
ATCC) se resuspendio 4 ml de solución
tween 20 al 1% para ayudar a desprender
las estructuras micóticas del agar, se dejó
durante unos segundos y posteriormente
se froto hasta desprender le hongo de la
superficie del agar con una cuchilla de
bisturí, luego el sobrenadante fue
envasado en un tubo de ensayo y se
ajustó a las escala 5 de Mcfarlan
agregando solución salina (figura 1a).
Se realizó una dilución 1/50 confirmando
la turbidez mediante recuento en la
cámara de Newbauer confirmando el
conteo de conidias entre un rango de
240.000 y 1.000.000, se realizon una
segunda dilución tomando 24 μl del inculo
más 1,176 μl de RPMI.

Figura 1a: Preparación del inóculo y del antifúngico.
2. Preparación del antifúngico: Se
requirió preparar 700μl de terbinafina
diluída, se partió de una concentración
inicial de 84.5μg/ml y se obtuvo una
concentración final de 10μg/ml, utilizando
la fórmula de V1C1=V2C2. Se necesitó
82.8 μl de la solución madre de terbinafina
más 617.2 μl de RPMI para completar el
volúmen total (figura 1a).
3. Inoculación de placas: En cada pozo
se sirvió con 80 µl de medio RPMI desde
el pozo 2 hasta el pozo 12, se sirvieron
160μL de terbinafina en el pozo 1 del cual
se tomó 80μL y se sirvió en el pozo 2 y
se continuaron diluciones seriadas hasta
llegar al pozo 11, en el pozo 12 no se
sirvió antifúngico (control negativo).
posteriormente se inocularon 80μL de la
suspensión de conidias a cada pozo
(Figura 1b).
4. Incubación: Las placas se incubaron a
30°C durante 48 horas.
5. Lectura de resultados:
Concentración mínima inhibitoria:
La MIC 50 de terbinafina fue la
concentración más baja que produjo una
inhibición total del crecimiento la cual se
evidencia por una turbidez visual
macroscópica.
Figura 1b: inoculación de Placas.
Concentración fungicida mínima (MIC
90):
La MIC 90 Se tomaron 10 μl de los pozos
con concentraciones de 5 μg/ml, 2,5μg/ml,
1,25 μg/ml, 0,25 μg/ml y se suspendieron
en cajas de petri con medio PDA y
después se realizó una siembra masiva
con asa de hocking después de 72 de
horas de incubación se realiza lectura de
crecimiento de colonias y se registra la
dilución en la cual no se observa
crecimiento que corresponde a la MIC 90.
Inhibición Radial del crecimiento del
micelio:
Para la realización de este procedimiento
se seleccionó el protocolo de inhibición
del crecimiento radial micelial en agar
PDA (9).

1. Preparación del inóculo: Se utilizó
una cepa de Microsporum gypseum de 7
días de crecimiento en cultivo agar papa
(PDA).
2. Preparación del compuesto
antifúngico: Se seleccionaron 60 ml de
PDA líquido a 37°C y 1000 μL de
terbinafina diluída con RPMI en una
relación 1/500, para obtener una
concentración de 84.5 μg/mL. Para ello se
tomaron 2μL de la solución madre de
terbinafina con una concentración inicial
de 42.250 μg/mL, más 998 μL de RPMI
(figura 2a).
de la solidificación del agar, se retiraron 5
mm de agar de la zona central de la caja
en cada concentración con una punta de
micropipeta, incluyendo el control
negativo. Se tomaron 10 muestras del
cultivo agar papa de Microsporum
gypseum, cada una de 5 mm eligiendo la
zona de proliferación del hongo y dicha
muestra se introdujo en el agar preparado
previamente ( figura 2b)

Figura 2b: Siembra del hongo.

4. Incubación: cada caja de petri se

incubó a 30°C durante 7 días.

Figura 2a: Preparación del agar

5. Lectura de la inhibición radial del
micelio: Medición de los diámetros de
crecimiento micelial.
3. Inoculación en cajas de petri (60
Para calcular los porcentajes de inhibición
mm): Se sirvieron 7.5 ml de PDA líquido
se empleó la fórmula utilizada por
más 170μL de la preparación de
Fakhrunnisa et al. (2006)(10).
terbinafina a una concentración inicial de
84.5 μg/mL en una caja de petri para
obtener una concentración final de 1
μg/mL y se calculó el volumen para el
resto de las cajas con el fin de obtener las
concentraciones finales de agar: 0.3, 0.1,
0.03 μg/mL y se seleccionó un control Donde I = Porcentaje de inhibición en el
negativo. todos los experimentos se crecimiento del micelio
realizaron por duplicado (Fig 2a). Luego
R1 = Crecimiento radial del patógeno
evaluado en la caja Petri.
R2 = Crecimiento radial del patógeno en
el control negativo.
Se realizó registro de la intensidad de la
producción de pigmento melanoide (11).
RESULTADOS:
Concentración mínima inhibitoria:
La MIC 50 de terbinafina fue la
concentración más baja que produce una
inhibición total del crecimiento en este
caso fue entre 1.25 μg/ml y 0.625 μg/ml
para T. mentagrophytes.
Concentración fungicida mínima(MIC
90):
La MIC 90 Después de realizar la
incubación de los pozos con MIC 50 se
realiza lectura de crecimiento de colonias
y se registra la ausencia de crecimiento
en la concentración de 0.625 que
corresponde a la MIC 90.
Inhibición radial del micelio: Para la
interpretación de resultados se utilizó un
experimento de Trichophyton rubrum el
cual fue realizado con las siguientes
concentraciones: 300 μg/ml, 150 μg/ml y
64,9 μg/ml y 11,1 μg/ml en las tres
últimas concentraciones el experimento
se realizó por duplicado, mientras en la
concentración de 300 μg/ml se trabajó un
solo experimento.
Se midieron los diámetros de crecimiento
micelial en cada caja encontrando que en
el control negativo (sin fungicida) la
medida fue de 4 cms presentando un
color vino tinto oscuro en ambas cajas.
Imagen 1: Hongos después de incubación para lectura de
la inhibición radial.
En el caso de la concentración de 300
μg/ml el diámetro de crecimiento micelial
fue de 3 cms y se observó una
disminución del pigmento, (para ésta
concentración solo se realizó una vez el
experimento), en la concentración 100
μg/ml, el diámetro de inhibición fué de 3.5
cms y la pigmentación fué igual a la del
control negativo. Para la concentración de
63.9 μg/ml se encontró un diámetro de
inhibición de 3 cms con disminución del
pigmento, en ambas cajas y en la última
concentración de 11.1 μg/ml se encontró
un diámetro de inhibición de 3 cms con
disminución del pigmento (Imagen 1,
Tabla 1)
Tabla1. Lecturas de porcentaje de inhibición versus
pigmento.
DISCUSIÓN
Ante el incremento de infecciones
fúngicas los avances en el estudio de
pruebas de susceptibilidad han sido
relevantes en las últimas décadas, las
levaduras han ocupado el primer lugar en
este tipo de pruebas y muchos de los
parámetros de estas han sido utilizados
para desarrollar los procedimientos in vitro
en hongos filamentosos.
Estudios como los desarrollados en los
experimentos que se presentan en este
artículo permiten contribuir a los avances
en esta área de estudio de la micología.
En el caso de T. mentagrophytes, la
Concentración inhibitoria mínima fue
0.625 μg/ml a 1.25 μg/ml (MIC 50) y la
concentración fungicida mínima (MIC 90)
fue 0.625 μg/ml.
T. rubrum mostró a una concentración de
150 μg/ml la menor inhibición radial del
micelio y la mayor producción de
pigmento. En este experimento las cajas
con concentraciones de 64,9 μg/ml y 11,1
μg/ml presentaron contaminación de halo
micelial con crecimiento de conidias de la
misma siembra.
El estudio de dermatofitos requiere de un
tiempo de 7 días de incubación a 30°C
por lo cual esta variable debe ser
controlada, también es importante tener
en cuenta que los experimentos deben
ser realizados por triplicado para mejorar
la sensibilidad de las pruebas.
CONCLUSIONES:
Los experimentos realizados en este
estudio, muestran las diferentes
concentraciones de terbinafina que inhibe
el crecimiento de cepas ATCC de los
dermatofitos T. mentagrophytes y T.
rubrum.
Las pruebas de susceptibilidad antifúngica
para hongos filamentosos MIC 50
siguiendo protocolo de la CLSI M38P, la
lectura de MIC 90 y la inhibición radial del
micelio son métodos que permiten la
evaluación de la actividad antifúngica in
vitro de forma efectiva para la terbinafina.
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