Bi

otechnol
ogical
Products

I
nsti
tut
eofBiol
ogi
calProduct
s
Depart
mentofMedic
a l
Sc i
ences
บทนํา
บทที่ 1 Drug development
1. Preparation of gene interest
2. Expression construct
3. Cell system
4. Cell transformation method
5. Selection and screening method
6. Seed lot system
7. การวิเคราะหคุณภาพ DNA และ RNA
บทที่ 2 Production of Biotechnological Products
1. Upstream processing
2. Downstream Processing
2.1 การแยกสกัด recombinant protein
2.1.1 Cell harvesting
2.1.2 Cell disruption
2.1.3 Cell debris removal
2.2 Refolding of the solubilized proteins :
2.3 Further Purification
บทที่ 3 Quality Control and Protein Characterization
3.1 วัตถุประสงคของการตรวจวิเคราะหคณ ุ ภาพ
3.2 หัวขอการตรวจวิเคราะหคุณภาพ
3.3 ตัวอยางรายการและวิธีตรวจวิเคราะห Drug substance
3.4 ตัวอยางรายการและวิธีตรวจวิเคราะห Drug product
3.5 วิธีวิเคราะห (Test methods)
3.6 ขอกําหนดเฉพาะ (Product specific requirements)
3.7 การศึกษาความคงตัว
3.8 สูตรตํารับ (Formulation)
3.9 Container / closure system
 2

บทที่ 1 Drug development

สิ่งที่ตองมีเมื่อตองการผลผลิตจาก recombinant DNA คือ

1. Preparation of gene interest
2. Expression construct
3. Cell system
4. Cell transformation method
5. Selection and screening method
6. Seed lot system
7. การวิเคราะหคุณภาพ DNA และ RNA
 3

1. การเตรียมยีนที่สนใจ (Preparation of gene interest)

ชิ้นสวน DNA คือ DNA ที่สนใจจะนํามาใชในการผลิตผลิตภัณฑที่ตองการ โดยเตรียมมาจากเซลล

ที่มีความบริสุทธิ์เพียงพอ หรือสังเคราะหขึ้นจาก gene machine หรือ DNA synthesizer ซึ่งตองทราบลําดับ
ของยีน วิธีการเตรียมยีนที่สนใจ เปนการแยกยีนซึ่งสามารถผลิตโปรตีนที่ตองการ มี 2 วิธีคือ

1. การเตรียมยีนจาก DNA
วิธีการคือ เริ่มจากสกัด DNA จากเซลลที่มียีนที่สนใจซึ่งมีหลายวิธีเชน การใช SDS หรือเอนไซม
lysozyme เพื่อทําลายผนังเซลล ปนตะกอนที่เปนเศษเซลลทิ้ง นําสวนใส ( มีDNA)มากําจัดโปรตีนดวยการ
เติม phenol/chloroform แลวทําให DNA บริสุทธิ์ดวย Absolute ethanol ดีเอ็นเอที่สกัดไดจัดเปนสาร
พันธุกรรมทั้งหมดของเซลล (Whole genome) ดังนั้นเพื่อจะหาเฉพาะยีนที่สนใจสามารถใชวิธีการจับคูเบส
อยางจําเพาะของ ดี เอ็น เอ (Southern blotting) หรือหาลําดับนิวคลีโอไทด โดยวิธี DNA sequencing ใน
การหาลําดับนิวคลีโอไทดของยีนจาก Whole genome ทําไดโดยการตัด whole DNA เปนสายสั้นๆ (2-15kb)
หรือสายยาว ( มากกวา 150 kb ) แลวเชื่อมตอใสในเวคเตอร (Vector) แลวนําไปหาลําดับนิวคลีโอไทด ดี
เอ็นเอที่มีลําดับนิวคลีโอไทดตรงกับยีนที่สนใจจะถูกนําไปใชในกระบวนการผลิต Recombinant DNA
ตอไป

2. การเตรียมยีนจาก mRNA
หลักการเตรียม เริ่มจากสกัด mRNA จากเซลลที่มียีนที่สนใจ ได mRNA ที่มีนิวคลีโอไทด A
หลายๆ ตัว (Poly-A tail) อยูที่ปลาย 3’ เริ่มการสังเคราะห cDNA โดยนํา mRNA ที่สกัดไดเปนแมแบบ
(template) และออกแบบ primer ที่ประกอบดวยนิวคลีโอไทด T หลายๆ ตัว (poly-T oligonucleotide
primer) ตอกับนิวคลีโอไทด 18-20 ตัวแรกของยีนที่สนใจ ใชเอนไซม Reverse transcriptase ในการ
สังเคราะห ใน step แรกนี้จะได single stand DNA ที่ complementary กับ mRNA จากนั้นจะตัด mRNA ทิ้ง
โดยเอนไซม RNase A. สวนของ single stand DNA ที่เหลืออยูมีคุณสมบัติเปน hydrophobic จึงมวนเกิด
โครงสรางเปนตะขอเรียกวา hairpin loop ซึ่งตําแหนงนี้เองที่จะทําหนาที่เปน primer ใหเอนไซม DNA
polymerase เพื่อสังเคราะห Double strand DNA ขั้นตอนสุดทายใชเอนไซม S1 nuclease ตัดสวน hairpin
loop ไดเปน DNA สายคูสําหรับนําไปใชผลิต Recombinant DNA
 4

2. การเตรียม Expression construct

เวคเตอร (Vector) หมายถึง สิ่งที่นําชิ้นสวน DNA เขาสูเซลลและสามารถเพิ่มจํานวนใหเกิดการ

แสดงออกของยีนได (Expression Vector) เวคเตอรแตละชนิดมีคุณสมบัติแตกตางกัน ปจจุบันมีใหเลือกซื้อ
มากมายหลายชนิดตามความเหมาะสมโดยคํานึงถึงตําแหนงการตัดของ restriction enzyme หรืออาจสราง
ขึ้นมาเองเพื่อการคนควาวิจัย สิ่งที่นํามาใชเปนเวคเตอรไดแก
- พลาสมิด ซึ่งสามารถรับเอายีนที่ตัดตอเขามาไดถึง 20,000 base pairs
- ไวรัสของแบคทีเรีย (phage) ซึ่งสามารถนํามาใชประโยชนในการ clone ยีนไดเชน ข - Lambda
phage ของ E.coli ซึ่งเปน double stranded DNA มีขนาด 40,000 base pairs และสามารถรับยีนไดถึง 20,000
base pairs
- Cosmids เปนสวนผสมของ phage และ plasmid สามารถรับยีนขนาดใหญไดถึง 45,000 base pairs
- โครโมโซมที่สังเคราะหขึ้น เชน YAC (Yeast Artificial Chromosomes) สามารถรับยีนขนาด
1,000,000 base pairs และ BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) รับได 100,000 -300,000 base pairs

พลาสมิด (Plasmid) หมายถึง extrachromosomal double stranded DNA พบในแบคทีเรียมี

ลักษณะเปนวงกลมสามารถเพิ่มจํานวนไดเอง (self replication) โดยปกติมี origin of replication เพียงหนึ่ง
ตําแหนง มีขนาดประมาณ 2,000-100,000 basepairs เล็กกวาโครโมโซมของเซลล จํานวนที่มีอยูในแตละ
เซลลแตกตางกันตามชนิดของเซลลและพลาสมิด มีหนาที่อื่นซึ่งไมเกี่ยวของกับการทํางานของโครโมโซม
ของเซลล บนพลาสมิดมียีนมีเพียงหนึ่งหรือสองยีน ซึ่งมีประโยชนมีตอการอยูรอดของเซลล เชน สวนใหญ
จะเปนยีนที่ตอตานยาปฏิชีวนะหรือโลหะหนัก ยีนสําหรับการสรางยาปฏิชีวนะ เชนการสราง bacteriocin
หรือยีนที่ชวยใหพลาสมิดเขาสูเซลลได
พลาสมิดที่เหมาะตอการเปนเวคเตอรตองมีบริเวณที่สามารถใสยีนที่ตองการเขาไปได (cloning site)
พลาสมิ ด จะเพิ่ม จํ า นวนโดยอาศัย เอ็ น ไซมข องเซลล เ จ าบ า นแต ดว ยวิ ธี ก ารที่ แ ตกต า งกั น ตามชนิ ด ของ
พลาสมิด ซึ่งกลไกการควบคุมคอนขางซับซอนโดยเกี่ยวของกับความเขมขนของตัวกระตุน (Activator)
หรือตัวยับยั้ง (Inhibitor) ตอโปรโมเตอรยีน (Promoter) ที่ควบคุมการทํางาน หากมีจํานวนพลาสมิดมากจะมี
ความเขมขนของตัวยับยั้งสูงจะทําใหการสรางพลาสมิดจะลดลง นอกจากนี้เมื่อเซลลถูกเลี้ยงมาเปนเวลา
ระยะหนึ่งแลว จํานวนพลาสมิดในเซลลอาจลดลงเนื่องมาจากเกิดการรวมหรือแลกเปลี่ยนยีนระหวาง
โครโมโซมของเซลลกับพลาสมิด ทําใหพลาสมิดสูญเสียเอกลักษณและความเปนเนื้อเดียว มีเซลลลูกที่ไม
มีพลาสมิดหลังการแบงเซลล อัตราการเจริญเติบโตของเซลลที่ไมมีพลาสมิดสูงกวาปกติเพราะเมื่อไมมีการ
เพิ่มจํานวนของพลาสมิดหรือไมมีการสรางผลิตผลจากยีนทําใหมีการใชพลังงานนอยลง จึงมีเหลือเพียงพอ
สําหรับใชในการเจริญของเซลล
 5

3. Cell System

คือ การเลือกชนิดของเซลลเพื่อผลิต recombinant protein โดยจําเปนตองเลือกใหเหมาะสมกับ

เวคเตอร (Host-vector system) และคุณสมบัติของโปรตีนที่ตองการ หัวขอที่จําเปนตองพิจารณาคือ

A. ชนิดของเซลล
B. การเติมหมูฟอสเฟตและน้ําตาล (Phosphorylation and glycosylation in Post – Translational
Protein Processing)
 6

A. ชนิดของเซลล

ชนิดของเซลลที่นํามาใช ไดแก
1. E. coli เปนเซลลที่นิยมนํามาใชมากที่สุดในการผลิตโปรตีนที่ไมตองการขบวนการ
postranslational modification ของโปรตีนภายหลัง เซลลนี้มีขอดีหลายอยาง คือ เปนเซลลที่ไดรับการ
ศึกษาวิจัยมาเปนอยางดีจึงมีขอมูลดานพันธุกรรมและสรีรวิทยามากเพียงพอที่จะนํามาใชทาง genetic
manipulationsงายตอการเพาะเลี้ยงใหไดผลผลิตมากเนื่องจากมีอัตราการเจริญสูง สามารถกระตุนใหยีนมี
การแสดงออกในอัตราที่สูงเมื่อเลือกเวคเตอรและ promoter ใหเหมาะสมตนทุนการผลิตต่ําเนื่องจาก E. coli
เจริญไดในอาหารเลี้ยงเซลลแบบธรรมดาราคาถูก รวมทั้งตนทุนของ fermentation process ที่ต่ํา
อยางไรก็ตามมีขอเสียที่ตองพิจารณาคือ ไดปริมาณ recombinant protein นอยอาจเนื่องจากถูกสลาย
ดวยเอ็นไซมหรือเกิดการรวมตัวเปน inclusion bodies ทําใหสูญเสียไปจํานวนหนึ่งจากความยุงยากในการ
แยกสกัดและการทําใหบริสุทธิ์ภายหลัง แตปจจุบันมีการแกไขดวยการใช fusion partner

2. Gram-positive Bacteria เชน Bacillus subtilis เปนเซลลที่นํามาใชมากนอกเหนือจาก E. coli

เนื่องจากมีขอดีกวา E. coli คือ สามารถผลิตโปรตีนออกมามากแตขณะเดียวกันมีขอเสียคือมีการผลิต
เอนไซม protease มาก ซึ่งจะทําลายโปรตีนอยางรวดเร็ว ทั้งเวคเตอรและโปรโมเตอรที่จะนํามาใชกับเซลล
ชนิดนี้มีจํากัดและพลาสมิดในเซลลไมเสถียรเทากับใน E. coli

3. Lower Eukaryotic Cells เชน ยีสต แตมีขอจํากัดดาน protein processing เชนกระบวนการ

glycosylation ดังนั้นหากตองการผลผลิตเปนโปรตีนชนิดที่ไมซับซอนมากนักสามารถเลือกใชยีสตได การ
แยกเก็บออกมาจาก bioreactor ทําไดงายเนื่องจากเซลลมีขนาดใหญกวาเซลล ขอจํากัดของยีสตคือมีระดับ
การแสดงออกของยีนต่ํา มี glycosylation สูง และมีความจํากัดในการเลือกใช genetic system อื่นๆ
ยีสตตัวแรกที่นํามาใชคือ S. cerevisiae นํามาผลิต interferon, hepatitis B suface antigen เปนตน แต
มีขอเสียคือ มี high glycosylation จึงมีการคัดเลือกตัวใหม คือ Pichia gastoris , Hausenula polymorlha ,
Yarrowoa lipolytica etc.

4. Mammalian Cells เซลลที่นํามาใชมากคือ Chinese hamster ovary (CHO) การเลือกใช

mammalian cells มั ก ให โปรตีน ที่ มีองคประกอบสมบูรณ ถูก ตองทั้งชนิดของกรดอะมิโนและ
postranslational processing ขอดีของเซลลชนิดนี้ในแงของ host-vector system มีความเหมาะสม เนื่องจาก
โปรตีนที่ไดสวนใหญจะอยูนอกเซลลและมีคุณภาพใกลเคียงกับที่ผลิตจากธรรมชาติ แตขอเสียคือมีตนทุน
การผลิตสูงเนื่องจาก เซลลมีการเจริญเติบโตชา ตายงาย อาหารเลี้ยงเซลลมีราคารเ แพง และมีระดับการ
 7

แสดงออกของยีนต่ํา มีการแบงตัวไมบอยมากนอกจาก transformed cells ที่เปน continuous cell lines ซึ่ง

แบงตัวไดไมจํากัดเชน เซลลมะเร็ง หากนํามาใชตองระมัดระวังเปนพิเศษโดยเฉพาะในขั้นตอนการทําให
บริสุทธิ์ซึ่งไมควรใหมีการปนเปอนของ nucleic acid ของเซลลเขามาในผลิตภัณฑ นอกจากนี้เวคเตอรที่จะ
ใชกับ mammalian cells อาจมี primate viruses ซึ่งเปนอันตรายหากเวคเตอรเหลานั้นสามารถกลับมากอโรค
ในคนได โดยปกติยีนในเวคเตอรเหลานี้ไมสามารถแสดงออกไดมากในเซลลปกติ แตทําไดโดยเลือกใช
เวคเตอรชนิด high copy number การเลี้ยงเซลลตองใชเวลานาน อาจมากถึง 6 เดือนเพื่อใหยีนทํางานอยาง
เต็มที่ แตถาหากใชเซลลที่เปน hybridoma จะใหผลดีกวา
เหตุผลสําคัญในการเลือกใชเซลลสัตวเนื่องจากคุณภาพของโปรตีนที่ผลิตไดเหมือนกับโปรตีนจาก
ธรรมชาติมากที่สุด แตภายหลังพบวาคุณภาพของโปรตีนเปลี่ยนแปลงไปเนื่องจากสภาวะการเพาะเลี้ยง
เซลลที่เปลี่ยนแปลงเมื่อเพิ่มกําลังการผลิต และคุณภาพของโปรตีนอาจเปลี่ยนแปลงตามชวงเวลาที่เก็บเซลล
รวมทั้งการผลิตโปรตีนปริมาณมากๆ อาจทําใหเกิดภาวะอิ่มตัวภายในเซลล มีผลใหการปรับแตงโครงสราง
ของโปรตีนไมสมบูรณ

วิธีที่นํามาแกไขและลดปญหาเหลานี้ไดแก
- การใชเลือกเซลลหรือ genetic materials ตางๆ จากเซลลที่ชวยลดการผลิตเอนไซม sialidase
- เพิ่มความสามารถดาน protein processing
- การปรับเปลี่ยนองคประกอบของอาหารหรือการเติมสารเคมีบางอยางที่จะชวยลดการผลิตสารที่
ไมตองการ เชน เอนไซมบางชนิด

5. Insect Cells-Baculovirus system : โดยปกติแลวจะไมนําเซลลแมลงมาใชในงานดานการตัดตอ

ยีน แต Baculovirus ซึ่งเปนไวรัสของเซลลแมลงกลับเปนที่สนใจเนื่องจากไมกอใหเกิดโรคทั้งในคนและ
แมลง และมี strong promoter สําหรับควบคุมการสรางโปรตีน ดังนั้นนักวิจัยจึงสนใจที่จะนํา insect cells-
baculovirus system มาทดลองผลิตโปรตีนเพื่อการศึกษา host-vector system นี้มีความปลอดภัยมากกวา
mammal-retrovirus system มีระดับการแสดงออกของยีนสูงสามารถใหผลิตผลภายในเวลาไมถึงหนึ่งเดือน
และมี protein processing ใกลเคียงกับ mammalian cells แมจะมีความแตกตางกันอยูบางกับขั้นตอน
ธรรมชาติ
 8

B. การเติมหมูฟอสเฟตและน้ําตาล (Phosphorylation and glycosylation in Post –

Translational Protein Processing)

หมายถึงการเติมหมูฟอสเฟตและน้ําตาลเขาในสายโปรตีนที่เซลลผลิตออกมาใหเหมาะกับการทํา
หนาที่ของโปรตีนนั้น หากแตกตางไปจากธรรมชาติจะมีผลตอคุณภาพของ recombinant protein
บทบาทของ glycosylation ตอขบวนการเหลานี้
การจัดเรียงตัวของโปรตีน (protein folding)
ความเสถียรภาพของโครงสรางโปรตีน (structure stability)
ตัวแปลงสัญญาณเฉพาะ (specific signal transduction)
ความสามารถในการสรางและคัดหลั่งสารตางๆ (secretion)
บทบาทของ glycolipid/proteoglycans/glycoprotein มีผลตอ
สวนประกอบของผนังเซลล (cell wall component)
การขนสงและการสื่อสารภายในเซลล (intracellular transport and communication)
บทบาทของ phosphorylation มีผลตอ
กระบวนการควบคุมเซลล (cellular regulation process)
การปรับเปลี่ยนปฏิกิริยาของเอนไซม (modulation of enzyme activity)
การเจริญของเซลล (cell growth)
การควบคุมการแสดงออกของยีนและการสังเคราะหโปรตีน (control of gene expression and
protein synthesis)
การควบคุมเมตาบอลิซึม (metabolic regulation)
การควบคุมตัวแปลสัญญาณ (signal regulation)
การเกิดเนื้องอก (tumor formation)

จะเห็นไดวา phosphorylation และ glycosylation มีความสําคัญมากตอหนาที่และ activity ของ

recombinant protein เนื่องจากขบวนการทั้งสองเกิดใน eukaryotic cells ไมพบในแบคทีเรียจึงตองมีการ
ศึกษาวิจัยและวางแผนใหเหมาะสมเพื่อใหไดผลิตภัณฑที่มีคุณภาพตามตองการ ซึ่งในการควบคุมการเกิด
ระดับ phosphorylation และ glycosylation ของ recombinant protein จําเปนตองเลือกชนิดของ expression
system ที่เหมาะสม
 9

4. Cell Transformation

Transformation เปนการนํา DNA เขาสูเซลลที่พรอมจะรับ DNA ภายนอก (competent cell) วิธี

ที่นิยมใชมี 3 วิธี ดังนี้

วิธีทางเคมี โดยใชสารเคมีประเภทไออนบวกเพื่อใหผนังเซลลเปด เชน แคลเซียมคลอไรด

ตัวอยางการเตรียม competent cells เซลลดวย Calcium chloride method : เตรียมเซลลระยะ Early log phase
แลวปนใหเซลลตกตะกอนที่ความเย็น 4 ºC ความเร็ว 3000-6000 rpm 4-8 นาที นําตะกอนมาละลายในน้ํายา
แคลเซียมคลอไรดซึ่งจะเพิ่ม peameability ของเซลลไดเซลลที่พรอมสําหรับ transformation เก็บที่ 4 ºC ได
หลายวันกอนนํามาใช หากตองการเก็บไวนานตองเก็บที่ -70 ºC ใน กลีเซอรอล เมื่อจะ transform เซลล
ใหนํามาแชในน้ําแข็ง เติมพลาสมิดเวคเตอร แลวทํา heat shock ที่ 42 ºC นาน 2 นาที เติมอาหารเลี้ยงเซลล
และอุนที่ 37 ºC 1 ชั่วโมงกอน spread บนอาหารเลี้ยงเชื้อ selective medium

วิธีการใชกระแสไฟฟา เปนวิธีที่ทําใหผนังเซลลเปดโดยใชกระแสไฟฟา หรือ DNA จะถูกนําเขา

ในนิวเคลียสของเซลลโดยการยิง DNA ซึ่งหอหุมดวยโมเลกุลทอง(gold) หรือทังสเตนดวยความเร็วสูง
เรียกวา microinjection หรือ ใชกระแสไฟฟาแรงสูง
ตัวอยางการเตรียม competent cells ดวย Electroporation method ปนเก็บตะกอนเซลลระยะ
Early log phase เมื่อจะ transform เซลล เติมสวนผสมของเวคเตอร นําเขาเครื่องมือที่ใหกระแส
ไฟฟาแรงสูง (1200 volt) ซึ่งจะทําใหผนังเซลลมี permeability เพิ่มขึ้น นําไป resuspend ในอาหารเลี้ยงเซลล
ปนเก็บ และ resuspend อีกครั้ง spread บนอาหารเลี้ยงเชื้อ selective medium
ในการผลิตตองการที่จะใหเซลลรับ expression construct หนึ่งอันตอหนึ่งเซลล(เนื่องจากหาก
เซลลรับพลาสมิดเขาไปหลายอันอาจเกิดการแลกเปลี่ยนชิ้นสวน DNA ทําใหไดสารที่มีคุณสมบัติตางไป
จากที่ตองการ) แตเปนการยากที่จะควบคุม

วิธีทางกายภาพ เปนวิธีที่ DNA ถูกนําเขาในนิวเคลียสของเซลลโดยการยิง DNA ที่เคลือบอยูบน

ผิวของลูกปนเล็กๆ ซึ่งทําดวยโมเลกุลทองหรือทังสเตน ดวยความเร็วสูงเรียกวา microinjection หรือกระแส
ไฟฟาแรงสูง
 10

5. Selection and screening method

หลังจากเลี้ยงเซลลไประยะหนึ่งแลว ตองทําการคัดเลือกหาเซลลที่มี expression construct และ

ตรวจสอบวา expression construct นั้นมีชิ้นสวน DNA ที่ตองการหรือไม พรอมทั้งตรวจยืนยันวาเปน
sequence ที่ถูกตองเพื่อจะไดนําไปผลิตตอไป
วิธีการคัดเลือกเซลลที่มีเวคเตอรที่ตองการ ไดแก
Antibiotic sensitivity or resistance อาศัยยีนซึ่งมีคุณสมบัติไวหรือดื้อตอยาปฏิชีวนะบนเวคเตอร
เชน มียีนที่ผลิตเอนไซม beta-lactamase ซึ่งจะ hydrolyse ยาปฏิชีวนะกลุม penicillin ได เซลลที่มีเวคเตอรนี้
จะสามารถเจริญไดในอาหารที่มียาปฏิชีวนะนี้ เซลลอื่นที่ไมมีเวคเตอรดังกลาวจะไมสามารถเจริญได หรือ
อีก วิธีหนึ่ งที่นิ ยมใชเ ชน กั น คือ ตัดตอยีนเขาไปในตําแหนงของยี น ที่ มีคุณสมบัติดื้อต อยาปฏิ ชีว นะใน
ขั้นตอนการสราง recombinant DNA ซึ่งเปนการทําลายยีนนั้นเปนผลใหเซลลที่มีเวคเตอรนั้นไมสามารถ
เจริญไดในอาหารที่มียาปฏิชีวนะชนิดนั้น เปนตน
Nutrient requirements เปนการคัดเลือกเซลลหรือโคโลนีที่ตองการโดยใชความตองการ
สารอาหารเปน marker เชน การมียีนที่สามารถสรางกรดอะมิโน leucine บนเวคเตอรทําให transformed
cells เจริญไดในอาหารที่ไมมีกรดอะมิโนชนิดนี้แต non-transformed cells จะตายหมด
Blue-white selection พลาสมิดหลายชนิดมียีน lac z ที่สรางเอ็นไซม B-galactosidase วิธีนี้
เวคเตอรที่เปน wild type จะมียีน ซึ่งเปลี่ยน substrate คือ X-gal ไดเม็ดสีฟาจึงมองเห็นโคโลนีเปนสีฟา
ขณะที่เวคเตอรที่สรางมาถูกทําลายยีนนี้ไปแลวจากการตัดตอชิ้นสวน DNA จึงไมปรากฏเม็ดสี จะเห็น
โคโลนีเปนสีขาว
Pigment formation กรณีนี้ transformed cell มีพลาสมิดที่มียีนสราง green fluorescent protein
(gfp) เปนโคโลนีเปนสีเขียวและเมื่อดูดวยแสง UV จะเรืองแสง
เมื่อคัดเลือกไดเซลลที่ตองการแลวตองทําการตรวจสอบเซลลที่คัดเลือกมาแลวเพื่อยืนยันวามี
ชิ้นสวน DNA ที่ตองการอยูจริง ดวยการแยก DNA ออกมาและวิเคราะหทั้ง phenotype และ genotype เพื่อดู
การเปลี่ยนแปลงของ sequence ที่อาจเกิดขึ้นดวย
การตรวจสอบ phenotype ทําไดหลายวิธีเชนอาศัย specific enzyme activity หรือ immunological
activity หรือจากการตรวจสอบดูผลผลิตจากยีนนั้น
การตรวจสอบ genotype ของเซลลใชวิธีทาง nucleic acid techniques ตรวจสอบโครงสรางหรือ
ลําดับนิวคลีโอไทดโดยวิธีที่เหมาะ สม เชน DNA sequencing หรือใช restriction enzymes และใช
electrophoresis วิเคราะหขนาดชิ้นสวนที่ถูกตัดและดูความบริสุทธิ์
 11

6. Seed lot system

หลังจากเลือกไดเซลลที่มีเวคเตอรที่ถูกตอง คือ มีชิ้นสวน DNA ที่ตองการแลวจากการตรวจสอบทั้ง

genotype และ phenotype แลว ในการเตรียมนําไปผลิตเปนอุตสาหกรรมจะมีการศึกษาวิธีการเก็บเซลลให
เหมาะสมเพื่อใหมีเสถียรภาพคงไวซึ่งเวคเตอรนั้น เปน stock หรือ seed lot ของเซลล โดยปกติจะแบงเก็บ
ปริมาตรนอยๆที่ -70 ˚C เรียกเปน Master Cell Bank (MCB) เมื่อจะนํามาผลิตแตละครั้งจะนํา MCB มา
เริ่มตนเลี้ยงเซลลใหมเรียกเปน Working Cell Bank (WCB) ซึ่งตองมีการตรวจสอบคุณลักษณะของ MCB
กอนนํามาใชทุกครั้งวายังคงความสามารถที่จะผลิตให recombinant protein เชนเดิม
 12

7. การวิเคราะหคุณภาพ DNA และ RNA และ เซลล

ปจจุบันสามารถวิเคราะหคุณภาพโปรตีนไดหลายวิธี และดวยเทคโนโลยีที่พัฒนาอยางรวดเร็ว จึงอาจมี

เทคนิคใหมๆมาพรอมกับยาชนิดใหมที่พัฒนาเพื่อการรักษาโรคที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น

1. Gel electrophoresis
หลักการ เปนการแยกสารโดยอาศัยกระแสไฟฟาพาโมเลกุลซึ่งมีประจุไฟฟาลบวิ่งไปยังขั้วบวกบน
แผนเจลที่เปน agarose ความแตกตางของขนาดและปริมาณประจุของโมเลกุลจะทําใหการเคลื่อนที่แตกตาง
กัน โมเลกุลที่มีขนาดใหญวิ่งชากวาขนาดเล็ก หรือที่มีประจุนอยจะวิ่งชากวา หรืออาจทําใหประจุของทุก
โมเลกุลเปนลบโดยการเติม detergent SDS แลวติดตามผลโดยแชแผนเจลในสารละลายของ ethidium
bromide (EtBr) ซึ่งจะแทรกเขาไปตามชองของสาย DNA ถายิ่งมี DNA มากก็ยิ่งมีชองวางสําหรับ EtBr มาก
EtBr จะเรืองแสงเมื่อสองดวยแสง UV และเมื่อเทียบกับ control sample ก็จะทราบขนาดของตัวอยางดีเอนเอ

2. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

หลักการ อาศัยคุณสมบัติของ restriction enzyme ใดๆที่สามารถตัดสาย DNA สายนั้นที่ restriction
site เสมอทําใหได restriction fragments ที่มีความยาวเทาเดิม ดังนั้นหากสาย DNA มีความยาวแตกตางกัน
สามารถใช RFLP analysis ตรวจสอบยืนยันความยาวและ sequence ได ปจจุบันวิธีนี้เปนประโยชนมากใน
การตรวจสอบบุคคลคลายการตรวจลายนิ้วมือ เนื่องจาก DNA ของแตละคนจะมีความแตกตางกันจัดเปน
restriction marker และยังเปนประโยชนดานการวินิจฉัยโรคดวย

3. Southern blotting
หลักการ แยก DNA โดย Gel electrophoresis แลวทําการถายซับ DNA จากเจล
ลงบนกระดาษ nitrocellulose (ซึ่งทําหนาที่เปน solid support) และตรวจ sequence ดวย probe ซึ่งเปน
single-strandedDNA fragment ที่มีความจําเพาะซึ่ง DNA fragment นี้ติดฉลากเปน radioactive tag ทําให
มองเห็นตําแหนงที่เขาจับกับตัวอยาง DNA ที่เปน single-stranded DNA

4. Northern blotting
หลักการ เปนเทคนิคที่ใชหลักการเดียวกับ Southern Blotting โดยแยกชิ้นสวน RNA บนเจล ถาย
ซับลงบนแผนกระดาษแลวใหเกิด hybridization ดวย probe ที่ติดฉลากแลวตรวจสอบผล
 13

5. In situ hybridization
หลักการ อาศัยความจําเพาะของ base paring ทําการติดตามหา sequence ที่ตองการทราบบน parent
chromosome ดวย probe ที่ติดฉลากดวย radioactive nucleotides เมื่อถายภาพดวยฟลมที่ไวตอรังสี X-ray จะ
เห็นเปนจุดสีดําบนแผนฟลม หรืออาจเชื่อมตอนิวคลีโอไทดกับสารที่สามารถเรืองแสงไดเมื่อไดรับสารเคมี
บางอยาง ดังรูปที่ 11
 14

บทที่ 2 Production of Biotechnological Products

หลังจากการเตรียม expression construct หรือเวคเตอรตลอดจนเซลลใหเหมาะสมแลวสิ่งที่ตองการ

ตอไปคือใหมีการเพิ่มจํานวนเซลลภายใตสภาวะที่เหมาะสมและมีการผลิตโปรตีนที่ตองการขบวนการ
เพาะเลี้ยงเพิ่มจํานวนเซลลเรียกวา Fermentation เริ่มตนจากการพัฒนาการผลิตในหองปฏิบัติการจนไดวิธีที่
เหมาะสมแลว จึงนําไปสูการเพิ่มขนาดการผลิต (scaled up) เปนระดับอุตสาหกรรมเพื่อการคา (Industrial
Fermentation) ขั้นตอนการผลิตประกอบดวยขั้นตอน

1. Upstream processing
2. Downstream processing
 15

1. Upstream processing

เปนขั้นตอนเกี่ยวกับการเตรียมวัตถุดิบ เชน อากาศ น้ํา อาหารเลี้ยงเซลล growth factor ตลอดจน

การเตรียม clean room และ sterilization ตลอดจนการเพิ่มจํานวนเซลลและการผลิตสารที่ตองการ ซึ่ง
ขบวนการนี้เกิดในถังหมักหรือถัง fermenter หรือ bioreactor ซึ่งทําจาก stainless steel สามารถทําให
ปราศจากเชื้อดวยวิธี stertilization อาจมีขนาดความจุไดถึง 400,000 liters ขบวนการที่เกิดเปนไดทั้ง aerobic
หรือ anaerobic แตโดยปกติวิธี aerobic จะยุงยากกวาเนื่องจากตองมีระบบกระจายอากาศที่เหมาะสม

ปจจัยที่เกี่ยวของและตองคํานึงถึง
- Microbial growth kinetics
- Maximizing fermentation efficiency
- Bioreactor
 16

Microbial growth kinetics

เมื่อเลี้ยงเซลลเจริญในถังหมักจะมีลักษณะการเจริญแสดงเปนกราฟดังรูป

Lag phase เปนขั้นตอนแรกที่เซลลเริ่มการเจริญอยางชาๆในสภาวะทีก่ ําหนดให

Log หรือ Exponential phase เซลลมีอัตราการเจริญขึ้นสูงสุด
Stationary phase เซลลที่เพิ่มจํานวนเทากับเซลลที่ตาย
Death phase เซลลมีการเจริญลดลงหรือเริ่มหยุดและอัตราการตายของเซลลเพิ่มขึ้น

Microbial growth kinetics

คือการที่จะใหเซลลมีการเจริญเต็มที่ตองมีวิธีการเลี้ยงอยางเหมาะสมซึ่งแตกตางจากการเลี้ยงในหลอด
ทดลอง ตองศึกษาชวงเวลาหรือขั้นตอนที่จะสามารถ harvest cells หลังจากเซลลมีการเจริญเติบโตไป
ระยะเวลาหนึ่งซึ่งขึ้นอยูกับชนิดของผลิตผลที่ตองการ เชนถาเปนโปรตีนจะเก็บเซลลที่ปลาย log (2) ถาเปน
ยาปฏิชีวนะมักเก็บเซลลในขั้น stationary
 17

Maximizing fermentation efficiency

ปจจัยที่มีผลตอประสิทธิภาพสูงสุดของ fermentation คือ

- อุณหภูมิ
- pH
- อัตราการผสม
- ลักษณะการผสม
- ปริมาณกาซออกซิเจนที่ตอ งการ

จึงตองมีการศึกษาและควบคุมเปนอยางดีเพราะเซลลแตละชนิดตองการสภาวะแตกตางกัน
 18

Bioreactor

เปนหัวใจสําคัญของขบวนการ fermentation เพราะเปนอุปกรณสําหรับเพาะเลี้ยงเพิ่มจํานวนเซลล

ตองมีการออกแบบใหเหมาะสมตอการกวนผสมสาร การปรับpHและอุณหภูมิ ตลอดจนการเติมอากาศ

1. Batch fermentation : เปนขบวนการเพิ่มจํานวนเซลลและผลิตสารเพียงหนึ่งรอบตอการผลิต

หนึ่งครั้งโดยในถังจะมีอาหารเลี้ยงเซลลอยูเต็มและเมื่อเสร็จสิ้นขบวนการจึงถายเก็บสารตางๆออกมา แลว
จึงทําความสะอาดถังโดยทําใหปราศจากเชื้อพรอมที่จะเริ่มขบวนการรอบใหมตอไป

2. Continuous fermentation : มีระบบการเติมอาหารเขาในถังตลอดเวลาขณะเดียวกันจะมีการ

แยกเก็บสารออกมาอยางตอเนื่องเชนเดียวกัน ซึ่งอาจใชวิธีการตรึงเซลล(immobilization)ไวภาย ในเพื่อ
ไมใหจํานวนเซลลลดลงเนื่อง จากเซลลอาจหลุดออกไปเมื่อมีการถายเก็บสาร และมีขอดีคือสามารถลด
ขนาดของถัง ลดคาใชจายและพลังงานและไดสารที่มีความเหมือนกันมากกวาแตขอเสียก็มีเชน มีโอกาส
สูญเสียพลาสมิดเนื่องจากดําเนินการผลิตเปนระยะเวลาติดตอกันยาวนาน การรักษาสภาพความปราศจาก
เชื้อทําไดยากกวา และองคประกอบของอาหารเลี้ยงเซลลอาจแตกตางกันในแตละbatch ซึ่งอาจมีผล
เปลี่ยนแปลงการเจริญของเซลลและมีผลเสียหายตอปริมาณของโปรตีนที่จะได

3. Fed-batch fermentation : เปนวิธีที่นิยมใชมากที่สุดในการผลิตสารชีวภาพตางๆ หลักการคือมี

การเติมอาหารเข าไปในถังอยางตอเนื่ องโดยไมมีการแยกเก็บสิ่งใดออกมาระหวางขบวนการเมื่ อถั งมี
ปริมาตรสารเพิ่มมากขึ้นจนเต็มจึงมีการถายเทสารออกบางสวนหรือทั้งหมดแลวจึงเริ่มขบวนการใหม วิธีนี้
จึงเหมาะตอการผลิตสารที่เกิดขึ้นขณะที่เซลลมีอัตราการเจริญต่ําหรือเปนศูนย (secondary metabolite) ซึ่ง
ไมตองการอาหารมาก วิธีนี้จึงเหมาะกับการผลิตระดับอุตสาหกรรม
 19

2. Downstream Processing

เปนขั้นตอนที่เริ่มตนหลังจากการเพิ่มจํานวนเซลลใน Bioreactor จนไดปริมาณตามที่ตองการ

ประกอบไปดวยขั้นตอนการเก็บเกี่ยวผลผลิต นําผานกระบวนการที่ทําใหบริสุทธิ์จนไดเปน Drug substance

2.1 การแยกสกัด recombinant protein

2.2 Refolding of the solubilized proteins :
2.3 Further Purification
 20

การแยกสกัด recombinant protein ที่ไดจากขบวนการผลิต (Extraction and Isolation of

Recombinant Protein)

การแยกสารออกจากเซลล (Intracellular Protein Purification)โดยทั่วไปประกอบดวยขั้นตอน Cell

harvesting, cell disruption, cell debris removal, solubilization of inclusion bodies, refolding of
recombinant protein

โปรตีนที่ไดจากการผลิตมี 2 ชนิด คือ soluble protein หรือ insoluble protein แตละชนิดมี 2

รูปแบบ คือ
extracellular protein ซึ่งหลังจากเกิดการสรางโปรตีนในเซลลแลวโปรตีนที่ผลิตไดจะถูกขับ
ออกมาจากเซลลทําใหการแยกสกัดทําไดงาย เนื่องจากโปรตีนอยูในอาหารเลี้ยงเซลล สําหรับโปรตีนชนิดนี้
จุดสําคัญอยูที่การลดปริมาตรและการกําจัดเซลลออกอยางรวดเร็ว โดยวิธี ultrafiltration, bulk adsorption
หรือการตกตะกอน ดวยวิธีการเหลานี้จะชวยใหลดสิ่งปนเปอนไดมาก

Iintracellular protein โดยจะพบโปรตีนอยูที่ periplasm ซึ่งเปนชองวางระหวาง cell wall และ

cell membrane หรืออยูใน cytoplasm
การเลือกใช gene fusion system ชวยใหนักวิทยาศาสตรแยกโปรตีนออกมาไดโดยวิธีที่งายและ
สะดวก เชน affinity chromatography หรือหากยังไมมีวิธีทาง affinity ที่เหมาะสม ก็ยังมีเทคนิคทาง
chromatography อีกหลายชนิดใหเลือกใช โปรตีนที่ใชในการรักษาโรคตองการความบริสุทธิ์สูง

ขบวนการนีแ้ บงออกเปน 3 ขั้นตอนคือ

2.1.1 Cell harvesting
2.1.2 Cell disruption
2.1.3 Cell debris removal
 21

2.1.1 Cell harvesting

เทคนิคที่นิยมใชในการ harvest เซลลไดแก การปนแยก (centrifugation) และวิธีการกรอง

(filtration) การปนแยกความเร็วสูง (High speed semicontinuous centrifugation) เหมาะกับการผลิตระดับ
หองปฏิบัติการหากเปนการผลิตที่มีปริมาตรมากวิธีนี้มีความยุงยาก
การกรองอาศัยความแตกตางของขนาดของโมเลกุลมีใหเลือกหลายแบบ ที่นิยมใชคือ Dead end
หรือ Cross flow แตหากความหนาแนนของสารไมแตกตางกันมากอาจใหผลไมดีเทาที่ควร การเลือกใชการ
ปนจะใหผลดีกวา อยางไรก็ตามมีปจจัยหลายอยางที่มีผลตอการเลือกวิธี ไดแก ชนิดของอาหารเลี้ยงเซลล
ขนาดของเซลล ระดับขนาดของการผลิต ตลอดจนเงินทุน
 22

2.1.2 Cell disruption

มีหลายวิธีสําหรับการสกัดเอาโปรตีนชนิด intracellular protein ออกมาจากเซลลขึ้นอยูกับวา

โปรตีนอยูตําแหนงและชนิดของเซลล โดยเฉพาะลักษณะของผนังเซลล แตไมวาจะใชวิธีใดก็ควรเปนวิธีที่
มีประสิทธิภาพและไมเปนการกระทําที่รุนแรงตอเซลลมากเกินไปเพื่อใหโปรตีนยังคงสภาพได

แบงเปน 3 วิธี ดังนี้

Chemical methods : ไดแกการใช alkali, organic solvents หรือ detergents
Biological method : เปนการใชเอ็นไซมที่เหมาะสมกับชนิดขององคประกอบของผนังเซลล การ
แตกเซลลดวยวิธี enzymatic lysis เหมาะกับการผลิตระดับ laboratoty scale แตการเติมเอ็นไซมลงไปยัง
เปนการเพิ่มสารปนเปอนและทําใหตองกําจัดออกในขบวนการทําใหบริสุทธิ์อีกดวย
Physical methods แบงออกเปน 2 แบบไดแก แบบ
- non-mechanical methods เชน osmotic shock, freeze thaw cycles หรือการใช organic solvent
เชน acetone, alcohol
แบบ mechanical methods เชน-sonication, wet-milling, high-pressure homoginization

สิ่งที่ควรพิจารณาในขั้นตอนการแตกเซลลคือ การเพิ่ม protease activity และ การกลับคืนการ

ละลายของโปรตีน (resolubilization of inclusion body protein) เพราะปจจัยทั้งสองจะทําใหปริมาณของสาร
ที่ตองการ (yield) ลดลง ดังนั้นควรเลือกใชบัฟเฟอรที่เหมาะสมเพื่อรักษา pH และ ionic strength ของอาหาร
เลี้ยงเซล การแตกเซลลตองทําอยางรวดเร็วในอุณหภูมิที่เหมาะสม อาจมีก ารเติมสารอื่นเชน protease
inhibitor, sucrose หรือ maltose เพื่อเปนstabilizer ของ lysosomal membrane และเพื่อลดการปลอยเอ็นไซม
protease ทั้งนี้ตองคํานึงถึงปริมาณที่เติมลงไปดวยเนื่องจากตองมีการกําจัดออกภายหลังจึงควรเติมปริมาณ
นอย หากมีปริมาณมากอาจทําใหใชเวลาในการทําใหบริสุทธิ์นานเกิน
นอกจากนี้วิธีการสกัดโปรตีนจะได mixture ที่มีสวนประกอบตางๆ ของเซลลปนอยูเชน nucleic
acid ทําใหเกิดความหนืด ซึ่งสามารถกําจัดออกไดโดยการตกตะกอน (เชน polyethyleneimine, magnesium
chloride, streptomycin sulphate), การเติมเอนไซม nucleases หรือการใช anion exchange chromatography
การแตกเซลลยังตองคํานึงถึง ionic strength, pH ที่เหมาะสมเพื่อใหโปรตีน ของ host cell ละลายน้ําได
 23

2.1.3 Cell debris removal

หลังจากการแตกเซลลแลวตองกําจัดเศษชิ้นสวนของเซลลออกจากโปรตีนที่ตองการอาจโดยการ
ปนแยกหรือการกรอง ความยุงยากที่มักเกิดขึ้นคือการที่มีเศษชิ้นสวนขนาดเล็ก และการอัดตัวกันแนนหรือ
ความหนืดขนของสารที่กรองไดการเลือกใช aqueous polymer liquid-liquid two phase ซึ่งมี polyethylene
glycol (PEG) เปนสวนหนึ่งและมีโพลีเมอรเชน dextran หรือเกลือเชน potassium phosphate อีกสวนหนึ่ง
ซึ่งจะไดโปรตีนอยูในสวนบนซึ่งเปน PEG phase และเศษของเซลลจะอยูในสวนลางสามารถแยกออกได
โดยการปน หากติดฉลาก PEG ดวย lignd ที่เหมาะสมก็จะเปนวิธีการแยกแบบ affinity partitioning

Solubilization of inclusion body มีวิธีดังนี้

Isolation of inclusion bodies : เนื่องจาก IBs มีความหนาแนนสูงดังนั้นจึงสามารถปนดวย
ความเร็วต่ําเชน 5,000-12,000 g แยกออกมาได หลังจากแตกเซลลดวยวิธีที่เหมาะสมซึ่งตองพยายามใหเซลล
แตกใหมากที่สุดเนื่องจากหากเซลลแตกไมสมบูรณจะทําใหตกตะกอนรวมกับ IBs หลังจากปนแลวลาง
ตะกอนดวยบัฟเฟอรที่มีสวนผสมของ chaotropic agents เชน 0.5-1 M quanidine-HCl หรือ urea หรือใชสาร
จําพวก detergents เชน 1% Triton X 100 หรือ 1 mg/ml sodium deoxycholate เปนตน ซึ่งเปนขั้นตอนที่
สําคัญที่จะชวยกําจัดสิ่งปนเปอนโดยเฉพาะเอ็นไซม protease และโปรตีนปนเปอนสวนที่ละลายน้ําได
ออกมา

Solubilization of aggregated protein : เมื่อแยกโปรตีนออกจาก IBsแลวตองทําใหอยูในสภาพ

ที่ละลายน้ําไดโดยใชสารเคมีทําลายสภาพธรรมชาติและใหกลับคืนสภาพเดิม (denaturation and re-folding)
นําโปรตีนที่ลางแลวมา resuspend และincubate ในบัฟเฟอรที่มี strong denaturant (ตารางที่ 7) และ
reducing agent(เชน 20 mM หรือ DTT beta-mercaptoethanol) ซึ่ง reducing agent จะชวยรักษาสภาพ
cysteine ใหอยูในสภาพ reduced form และทําลาย disulfide bonds ที่เกิดจากการตกตะกอน อุณหภูมิที่มักใช
ในขั้นตอนนี้คือ 30 C ซึ่งชวยใหเกิดการละลายดีขึ้น หลังการละลายแลวนําไปปนเพื่อกําจัดตะกอนอื่นๆที่ยัง
เหลืออยูซึ่งจะมีผลรบกวน refolding ภายหลัง
 24

2.2 Refolding of the solubilized proteins

ปญหาที่ตองแกไขภายหลังคือ ตองพยายามปรับเปลี่ยนโครงรางของโปรตีนใหกลับ มาอยูใน

สภาพ active (refolding) และ/หรือ สภาพที่ละลายน้ํา (solubilization) ใหไดปริมาณมากที่สุด ขั้นตอนนี้
เริ่มตนดวยการกําจัด denaturant ประสิทธิภาพของ refolding ขึ้นอยูกับการเกิดการแขงขันที่จะเกิด refolding
และ aggregation จึงตองพยายามลดการเกิด aggregation โดยควบคุมความเขมขนของโปรตีนไมใหสูง
เกินไปใหอยูในชวง 10-100 mcg/ml และโปรตีนแตละชนิดมีสภาวะที่เหมาะสมตอการเกิด refolding
ตางกัน จึงตองศึกษาปจจัยที่แตกตางกันซึ่งไดแก องคประกอบของบัฟเฟอร (pH, ionic strength), อุณหภูมิ,
additives อื่นๆ

หากโปรตีนมี disulfide bonds ตองเติม thiol reagent เชน reduced และ oxidized glutathione หรือ
cysteine และ cysteamine เพื่อใหไดแรงยึดเหนี่ยวนี้กลับคืนมา

วิธีการอื่นที่ใช refolding โปรตีน

- Dialysis เปนวิธีที่ใชมากวิธหี นึ่ง
- Slow dilution เปนการทําให solubilizing agent เจือจางลงทําใหโปรตีนกลับ คืนสภาพ

สิ่งที่ตองระวังคือการเกิด rapid dilution ขณะทํา dialysis และ slow dilution เมื่อโปรตีนเริ่มกลับคืน

สภาพเดิมจะมีโอกาสเกิด aggregate ไดงายตองปองกันโดยการเติม mild solubilizing agent ลงใน refolding
agent

- Pulse renaturation : เพื่อควบคุมโปรตีนที่จะคืนสภาพใหมีความเขมขนต่ําซึ่งจะชวยไมให

- aggregate มีวิธีปฏิบัติคือ เติมโปรตีนลงไปในระบบเปนระยะๆใหไดความเขมขนที่เหมาะสม
จนเกิด refolding จนหมด
- Chromatography : เปนการกําจัด solubilizing agent วิธีหนึ่งโดยเลือกชนิด ของ column ให
เหมาะสม เชน size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography
เปนตน ซึ่ง denaturant จะถูกกําจัดไปขณะที่โปรตีนเคลื่อนตัวผาน column อยางชาๆหรือจับกับ matrix
ภายใน column วิธีนี้ชวยใหไดโปรตีนปริมาณมากแมความเขมขนของโปรตีนจะสูงระดับ mg/ml ดังนั้นจึง
สามารถใชวิธี chromatography หลังการ solubilized โปรตีน กอนที่จะทํา refolding ไดเนื่องจากปจจุบันเร
ซินที่บรรจุใน column สามารถทนทานตอสารและสภาวะ solubilization
 25

2.3 Further Purification:

เปนการทําใหสารบริสุทธิ์ เพื่อนําไปใชโดยเทคนิค Chromatography ชนิดตางๆ รวมกัน วิธีการ

แยกเก็บ recombinant protein ที่ผลิตออกมานอกเซลลจะทําไดงายขึ้นเนื่องจากโปรตีนอยูในอาหารเลี้ยง
เซลล สําหรับโปรตีนชนิดนี้จุดสําคัญอยูที่การลดปริมาตรและการกําจัดเซลลออกอยางรวดเร็ว โดยวิธี
ultrafiltration, bulk adsorption หรือการตกตะกอน ดวยวิธีการเหลานี้จะชวยใหลดสิ่งปนเปอนไดมาก

Ultrafiltration membranes มีใหเลือกหลายขนาด และหลายแบบ เปนการกําจัดเกลือและ

โมเลกุลเล็กๆออกจากโปรตีนไดอยางมีประสิทธิภาพ และเปนการทําโปรตีนใหเขมขนขึ้น
Bulk adsorption techniques ตัวอยางของวิธีนี้ เชน ion exchange chromatography ซึ่งมีใหเลือก
หลายแบบ ในสภาพ pH ที่เหมาะสม วิธีนี้สามารถกําจัด proteases และเปนการทําสารใหเขมขนขึ้นในเวลา
เดียวกัน
Fractional precipitation วิธีนี้เปนการทําสารใหเขมขนขึ้น และเปนการเริ่มตนของขบวนการทํา
สารใหบริสุทธิ์ สารที่ใชตกตะกอน ไดแก เกลือชนิดตางๆ (ammonium sulphate,sodiem sulphate), ethanol,
aceton และ polyethylene glycol ขั้นแรก โปรตีนขนาดใหญจะถูกตกตะกอนออกมากอน โปรตีนที่ตองการ
จะตกตะกอนในขั้นตอนตอไป และกําจัดเกลือหรือ alcohol ออกโดย gel filtration หรือ diafiltration

เทคนิคที่ใชในการแยกสกัดและทําใหบริสุทธิ์

Dialysis เปนวิธีใชกําจัดสารโมเลกุลเล็กเชนเกลือชนิดตางๆ หรือโปรตีนอื่นๆโดยอาศัยการซึมผาน

ถุงซึ่งเปน semi-permeable membrane ของโมเลกุลเล็ก (< 50 daltons) ออกคงเหลือสารที่มีขนาดใหญกวาอยู
ภายใน
Centrifugation ดวยความแตกตางของน้ําหนัก รูปราง ความหนาแนนของโปรตีน และความ
หนาแนนของสารละลายทําใหสารตางๆแยกออกจากกันเมื่อปนที่ความเร็วที่เหมาะสมทําใหไดสารละลายที่
ใสขึ้นเหมาะสําหรับการทําใหบริสุทธิ์ตอไป
- Zone centrifugation เปนการปนแยกในสารละลายที่เปน gradient
- Sedimentation equilibrium เปนการแยกโดยอาศัยcontinuous gradient
Filtration ตองเลือกใหเหมาะสมทั้งการกรองธรรมดา และกรองเพื่อกําจัดไวรัส
Chromatographic techniques ใชสําหรับการเตรียมสารเพื่อนําเขาสูขั้นตอนอื่นตอไป และใช
แยกสกัดสารรวมถึงการทําสารให บริ สุทธิ์โดยเลื อกวัสดุอุปกรณใ หเหมาะสมโดยพิจารณาถึ งลัก ษณะ
ทางการภาพ ทางเคมี และทางชีวเคมีของโปรตีนที่ตองการ
 26

แบงเปนหลายวิธี คือ
- Affinity Chromatography
- Ion Exchange Chromatography
- Hydrophobic Interaction Chromatography
- Gel Filtration
- Reverse Phase Chromatography

เทคนิคที่ใชในการวิเคราะหคุณลักษณะของโปรตีน
I. Electrophoresis
SDS – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE)
2 – dimentional (2D) gel electrophoresis
Isoelectric Focusing (IEF)
II. Determination of amino acid sequence
III. Immunological techniques
Other methods
Circular Dichroism
X - ray Crystalography
Mass spectrometry
 27

บทที่ 3 Quality Control and Protein Characterization

3.1 วัตถุประสงคของการตรวจสอบคุณภาพ

Biotechnological products ผลิตจากสิ่งมีชีวิต เชน เชื้อจุลินทรีย E. coli, ยีสต หรือ mammalian cells
ซึ่งมีความซับซอน การกําหนดแนวทางการควบคุมคุณภาพตองมีความรูความเขาใจเกี่ยวกับขบวนการผลิต
เชน การผลิตที่ใช Eukaryotic cells จะมีความซับซอนมากกวาการใช Prokaryotic cells รูถึงแหลงที่มาของ
สารตั้งตนและองคประกอบอื่นๆ เพื่อพิจารณาความปลอดภัยจากการปนเปอนเชื้อจุลินทรีย จากสารตั้งตน
และที่ปนเปอนเขามาระหวางการผลิต รวมถึงเขาใจคุณลักษณะของผลิตภัณฑซึ่งเปนโปรตีน การที่จะผลิต
ใหไดโปรตีนที่ตองการและที่มีคุณภาพดีสม่ําเสมอตองประกอบดวยการทํา manufacturing process
validation รวมกับ batch analysis และ protein characterization
การตรวจสอบและควบคุมคุณภาพสิ่งที่เกี่ยวของในขบวนการผลิตจนถึงผลผลิต ดังนี้
• Raw material testing and exipient testing
• Cell banking manufacturing (characterization and bio-safety testing)
• Process validation/viral clearance studies
• Bulk harvest testing
• Protein characterization
เมื่อไดโปรตีนที่ตองการแลวตองตรวจสอบคุณลักษณะดานตางๆ ดวยเทคนิคการตรวจวิเคราะห
หลายวิธี โมเลกุลโปรตีนที่ไดมีความซับซอนตองอาศัยเทคนิคหลายดานรวมกันที่มีความจําเพาะเพื่อใหรู
โครงสรางและองคประกอบและความคงตัวของโปรตีน ใหไดขอมูลที่ถูก ตอง ซึ่งยากกวาการวิเคราะหยา
ประเภทโมเลกุลเล็ก (small molecules) ผลการตรวจวิเคราะหโปรตีนจากการผลิตซ้ําหลายๆรอบ (batch
analysis) จะแสดงถึงคุณลักษณะตางๆ ของโปรตีนที่เตรียมได และควรทําการเปรียบเทียบกันการผลิตหลาย
รูปแบบ เชน รุนทดลองหรือใชกําลังการผลิตขนาดเล็กที่เรียกวา pilot batch และรุนที่ผลิตตามขนาดกําลัง
ผลิตเพื่อการคา (commercial batch) ในการเตรียมเปนผลิตภัณฑยา โปรตีนที่เตรียมไดและผานการทําให
บริสุทธิ์แลวเปน active ingredient ที่เรียกเปน drug substance (DS) ซึ่งจะถูกนําไปจัดเตรียมเพื่อเปนยา
สําเร็จรูป (finished product หรือ drug product: DP) หากโปรตีนหลายๆรุนการผลิตมีคุณภาพไมแตกตางกัน
แสดงถึงความสม่ําเสมอของคุณภาพที่ไดและแสดงถึงสามารถในการควบคุมกระบวนการผลิตไดเปนอยาง
ดี
จุดประสงคของการตรวจ DS และ DP จะแตกตางกันแมจะมีบางหัวขอที่เหมือนกัน ใน DSจะเนน
การพิสูจนโครงสรางของโปรตีนทั้ง primary, secondary และ tertiary structure รวมทั้งชนิดของกรดอะมิโน
ที่อยูปลายสายโปรตีนทั้งสองดาน (N-, C terminal) เพื่อยืนยันชนิดของโปรตีนที่ได และตรวจสอบ
 28

impurities profile ทั้ง product-related impurities, process-related impurities รวมถึง characterization เพื่อดู
physical properties ตางๆ ขณะที่ DP จะเนนการตรวจสอบ drug performance
ดังไดกลาวไวในบทที่ 2 หากผลิตจาก mammalian cells จะมีขบวนการ post-translational ของ
โมเลกุลโปรตีน หากไมสามารถควบคุมกระบวนการผลิตใหมีความสม่ําเสมอและเหมาะสมจะทําใหได
โมเลกุลโปรตีนที่ความแตกตางกันได โดยเฉพาะอยางยิ่งขบวนการ glycosylation ซึ่งเปนการเติมโมเลกุล
น้ําตาลอยางถาวรบนสายโปรตีน มีทั้งแบบ N-linked glycosylation โดยมีการเติมน้ําตาลเชิงเดี่ยว N-
Acetylglucosamine ที่ตําแหนง N ของ NH2 ของกรดอะมิโน asparagine ดวย covalent bond ที่อยูใกล
กรดอะมิโน threonine หรือ serine และสวนชนิด O-linked มีการเติมน้ําตาลเชิงเดี่ยว N-
Acetylgalactosamine (GalNAc) ที่ตําแหนง OH ของกรดอะมิโน serine หรือ threonine เซลลอาจผลิตสวนที่
เปนคารโบไฮเดรทซึ่งเรียกวา glycan มาหลายรูปแบบ (variants) แตกตางกันที่ตําแหนงการจับกับกรดอะมิ
โน หรือลําดับและจํานวนโมเลกุลน้ําตาลที่ตอเปนสายเรียกเปน glycoforms การตรวจสอบองคประกอบคาร
โบไฮเดรทวามีโมเลกุลน้ําตาลเชื่อมตอจากสายโปรตีนใด และมีโมเลกุลน้ําตาลชนิดใดประกอบอยูเปน
คุณลักษณะที่นํามาเปรียบเทียบผลิตภัณฑอางอิง biosimilar เนื่องจาก glycosylation มีผลตอคุณภาพทั้งดาน
ประสิทธิภาพ drug performance และความปลอดภัย
นอกจากนี้โมเลกุลโปรตีนอาจเกิดจับตัวกันเปน dimers, จัดเปน product-related variants เชนกัน
โดยอาจออกฤทธิ์ไดเหมือนหรือใกลเคียงกับโปรตีนที่เปนโมเลกุลแบบ monomer สวนการจับตัวกันเปน
oligomers หรือ aggregates จัดเปนสารปนเปอนชนิด product-related impurities ซึ่งควรมีประมาณเล็กนอย
หรือไมมีเลย จึงตองตรวจหาวามีชนิดใดหรือรูปแบบใด และมีปริมาณเทาใด และจําเปนตองวิเคราะหใหรูวา
โมเลกุลเหลานี้มีผลกระทบตอประสิทธิภาพและความปลอดภัยหรือไม นอกจากนี้ตองตรวจหาสารปนเปอน
ชนิด process-related impurities ที่สําคัญคือโปรตีนและ DNA ของ host cells ใน DS เนื่องจากอาจมีผล
กระตุนภูมิคุมกันของผูที่ไดรับยาที่ผลิตจากโปรตีนนี้เปนผลใหรางกายสรางแอนติบอดีตอตานเกิดการดื้อยา
หรือทําใหเกิดโรคอื่นภายหลัง
ดั ง นั้ น การควบคุ ม คุ ณ ภาพจึ ง เป น ขั้ น ตอนที่ สํ า คั ญ อย า งยิ่ ง ต อ ความสํ า เร็ จ ของการผลิ ต
biotechnological products วิธีการวิเคราะหที่นํามาใชตองเหมาะสมซึ่งขึ้นอยูกับเทคโนโลยีการวิเคราะหใน
ขณะนั้น เชน มีความไวเพียงพอที่จะแสดงโครงสรางและความบริสุทธิ์ ตลอดจนระบุชนิดและปริมาณสาร
ปนเปอนได วิธีตรวจวิเคราะหที่ใชตองไดรับการตรวจสอบความใชไดหรือความถูกตองของวิธีแลว (test
method validation) ผลการตรวจวิเคราะหโปรตีนที่เตรียมไดจากขั้นตอน drug development, in-process
control, batch analysis จะนํามาเปนขอกําหนดเฉพาะ (specification) ของผลิตภัณฑยา biotechnological
products ที่ไดซึ่งตองกําหนดอยางมีหลักเกณฑและมีเหตุผลสนับสนุน
 29

3.2 หัวขอการตรวจวิเคราะหคุณภาพ

โดยทั่วไปหัวขอการตรวจวิเคราะหคุณภาพอาศัยวิธีทาง in vitro และ in vivo รวมกัน ซึ่งมีอยาง

นอยดังนี้
ประสิทธิภาพ (efficacy)
เปนการตรวจวัดความสามารถในการออกฤทธิ์ของยาตามที่กําหนดไว ซึ่งสวนใหญเปนวิธี bioassay
ทั้งการใชเซลลเพาะเลี้ยงหรือสัตวทดลอง

ความปลอดภัย (safety) ตรวจวิเคราะหเพือ่ ใหเกิดความมั่นใจวาโปรตีนที่ไดมีความปลิดภัยตอการ

นําไปใชจากการตรวจสอบหลายวิธี ทั้งความปลอดเชื้อ (sterility) จากรา แบคทีเรียโดยวิธี direct
inoculation หรือ membrane filtration ตรวจหาสารกอไขในกระตาย (pyrogen test) และเอ็นโดท็อก
ซิน (endotoxin) จาการปนเปอนแบคทีเรียแกรมลบดวยวิธี LAL testing ตรวจหาความเปนพิษ
(abnormal toxicity) ในหนูตะเภาและหนูถบี จักร

การตรวจเอกลักษณ (identity) และการวิเคราะหคุณลักษณะอื่นๆ (protein characterizations) เปน

การตรวจยืนยันวาโปรตีนทีไ่ ดมีคุณลักษณะตามที่ตองการ และเปรียบเทียบไดกับสารมาตรฐาน
รวมทั้งเทียบกับสารเดียวกันนี้ที่เปนสารในธรรมชาติที่รางกายสรางขึ้นและศึกษา physicochemical
properties เชน ตรวจสอบชนิดของกรดอะมิโนที่ประกอบเปนโปรตีนและโครงสรางระดับตางๆ
ของโปรตีนเชื่อมโยงกับคุณสมบัติเฉพาะเพื่อแสดงถึงความเหมาะสมตอการนําไปใชในการรักษา
โรค โดยปกติมักมีหวั ขอและราย ละเอียดแตกตางกันแลวแตชนิดของยาจึงตองพิจารณาเปนรายๆ
ไป วิธีการตรวจควรมีความจําเพาะกับชนิดของโปรตีนซึ่งมีหลายวิธี และอาจวิเคราะหทางชีววิทยา
รวมดวย เชน ดูกลไกการออกฤทธิ์

การวิเคราะหความบริสุทธิ์ (purity) และสารปนเปอน (impurities) แมวาปจจุบนั มีวิธีการและ

ขั้นตอนการทําใหโปรตีนบริสุทธิ์ที่มปี ระสิทธิภาพ แตมคี วามเสี่ยงจากการปน เปอนเชื้อโรคและ
สารประกอบจากวิธีการผลิตและสารตั้งตน จึงจําเปนตองตรวจวิเคราะหความบริสุทธิ์ของโปรตีนที่
เตรียมได รวมทั้งตรวจหา product-related variants, product-related impurities และ process-related
impurities เพือ่ นํามากําหนด impurities profile
นอกจากนี้อาจตองศึกษาคุณสมบัติทางภูมคิ ุมกันวิทยา (Immunological properties) หากจําเปน เชน
มีขอมูลจาก drug development

3.3 ตัวอยางรายการและวิธีตรวจวิเคราะห Drug substance
Drug substance Testing
1. Appearance
2. Identity (ตองมีมากกวา 1 วิธี)
™ structural characterization and
confirmation
- amino acid sequence
- amino acid composition
- terminal amino acids
- peptide mapping
- carbohydrate structure
™ physicochemical properties
- molecular weight
- molecular size distribution
- Isoform pattern
- Extinction coefficient
- Electrophoretic pattern
- Spectroscopic profile
- pH
- osmolarity etc.
30
Methods
ตรวจลักษณะทางกายภาพดวย visual inspection หรืออาจมีอุปกรณ
เครื่องมือประกอบ
Chemistry methods และ- Biochemical and Physicochemical
methods ไดแก
• Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel
electrophoresis
(SDS-PAGE)
• High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
หลานชนิด เชน
o size exclusion chromatography (SEC-HPLC)
o Reverse phase chromatography (RP-HPLC)
o Ion exchange chromatography (IEC-HPLC)
ทั้ง cation และ anion chromatography
o และอาจรวมกับ Mass spectrophotometer เปน
LC-MS
• Isoelectric focusing (IEF)
• Capillary electrophoresis (CE)
• Nuclear magnetic resonance (NMR)
วิธีที่ใช ไดแก isoelectric focusing (IEF), Extinction coefficient
(UV) และ spectroscopic profile จาก spectrophotometry, SDS-
PAGE, HPLC และวิธีทางเคมีอื่นๆ
 31

Drug substance Testing Methods

biological property เพื่อดู biological activity ทั้งใน in vivo และ in vitro เชน ในเซลล
เพาะเลี้ยง ในสัตวทดลองหรือโดยวิธีทางภูมิคุมกันวิทยา เชน
enzyme-linked immunoassay (ELISA)
3. Purity and impurities (ตองมีมากกวา 1 วิธี) วิธีที่ใช ไดแกSDS-PAGE, HPLC, ELISA หรือ immunochemistry
™ Process-related impurities methods เชน western-blot
• host cell protein
• host cell DNA
• chromatographic resins
• cell culture media etc.
™ Product-related impurities และ SDS-PAGE และ HPLC
product-related variants
- truncated forms
- other modified forms
- aggregates
4. Potency/efficacy ทั้งใน in vivo และ in vitro เชน ในเซลลเพาะเลี้ยง ในสัตวทดลอง
หรือโดยวิธีทางภูมิคุมกันวิทยา เชน enzyme-linked immunoassay
(ELISA)
5. Quantity (Protein content) UV method หรือ วิธีทางเคมี เชน Lowry method

6. safety tests ทั้งวิธีทาง bioassay ใน in vivo เชน pyrogen test ในกระตายหรือ in

- pyrogenicity (rabbit test,) vitro โดย LAL testing ซึ่งเปนวิธีชีวเคมี และการตรวจความปลอด
- endotoxin (Limulus Amebocyte Lysate: เชื้อทางจุลชีววิทยา
LAL)
- sterility หรือ bioburden
- abnormal toxicity
- mycoplasma
 32

3.4 ตัวอยางรายการและวิธีตรวจวิเคราะห Drug product

Drug product testing methods

1. Appearance ตรวจลักษณะทางกายภาพดวย visual inspection หรืออาจมีอุปกรณ
เครื่องมือประกอบ เพื่อดูลักษณะของผง หรือสารละลาย สี และสาร
ปนเปอนอื่นๆ

2. Identity (ตองมีมากกวา 1 วิธี) โดยเนน
การเปรียบเทียบ DP กับสารมาตรฐาน
3. Product characterization เชน
monomer และ dimers aggregates, pH,
osmolarity
4. Potency
peptide mapping, SDS-PAGE, capillary electrophoresis หรือ
immunoblot techniques
HPLC และวิธที างเคมี
ELISA ในเซลลเพาะเลี้ยงหรือเทคนิคทางชีวเคมีอื่น เชน HPLC

5. biological activity Bioassay ในเซลลเพาะเลี้ยงหรือสัตวทดลอง

6. Quantity or strength (Protein content) UV, HPLC

7. Purity and impurities เชน ปริมาณ
aggregates
8. Safety
- pyrogenicity (rabbit test, LAL)
- endotoxin
- sterility หรือ bioburden
- abnormal toxicity
9. Exipient เชน polysorbate 80
HPLC ทั้ง SEC-HPLC และ ion exchange HPLC
ทั้งวิธีทาง bioassay ใน in vivo เชน pyrogen test ในกระตายหรือ
in vitro โดย LAL testing ซึ่งเปนวิธีชีวเคมี และการตรวจความ
ปลอดเชื้อทางจุลชีว วิทยา
Spectrophotometry, HPLC หรือวิธีทางเคมี

10. อื่นๆ เชน วิเคราะหปริมาณความชื้นดวย Karl Fischer methods

 33

3.5 วิธีวิเคราะห (Test methods)

การเลือกใชวิธีวิเคราะหที่เหมาะสมจะทําใหรูถึงโครงสรางและคุณลักษณะตางๆของยาที่เตรียมได
วิธีวิเคราะหที่เลือกใชอาจเปนวิธีจากตํารายา (Compendial methods) หรือเปน in-house method หากเปน in-
house method ตองเปนวิธีที่ไดรับการตรวจสอบความถูกตองแลว (method validation) การคัดเลือกวิธี
วิเคราะหมีความสําคัญเนื่องจากผลจากการวิเคราะหจะถูกนํามากําหนดขอกําหนดเฉพาะของยานั้นๆ หากมี
ความไวตางกันก็จะไดคาที่ตางกัน ดังนั้นจึงตองเลือกวิธีใหเหมาะสมโดยพิจารณาหลักการของวิธี เครื่องมือ
หลัก การเตรียมตัวอยาง สารมาตรฐานและวิธีวิเคราะหตลอดจนการคํานวณและแปลผล ดังนั้นจึงตอง
สามารถเหตุผลไดวาวิธีที่เลือกใชนั้นเปนวิธีที่เหมาะสมสามารถแสดงคุณลักษณะดานนั้นๆของยาไดตาม
จุดประสงค

หลักการของวิธีการวิเคราะหที่สําคัญมีดังนี้
HPLC เปนวิธีการแยกสารออกจากกันโดยอาศัยคุณสมบัติทางเคมีของสารเหลานั้น เชน ขนาดและรูปราง
ของโมเลกุลโปรตีน (size exclusion chromatography: SEC-HPLC) ซึ่งโมเลกุลที่มีขนาดใหญจะผาน
column ออกมากอนโมเลกุลเล็ก หรือการแยกโดยอาศัยคุณสมบัติที่มีประจุบวก และลบบนโมเลกุลของสาร
(cation or anion chromatography) หรือแยกโดยใชการจับกันอยางจําเพาะของโมเลกุล (affinity
chromatography) เปนตน
Electrophoresis มีหลายวิธี เชน SDS-PAGE IEF capillary electrophoresis เปนตน SDS-PAGE เปนเทคนิค
การแยกสารบนแผนเจลในสนามไฟฟาโดยอาศัยรูปรางและขนาดของสาร โมเลกุลโปรตีนที่มีขนาดแตกตาง
กันจะเคลื่อนที่ดวยความเร็วตางกันจากขั้วบวกไปขั้วลบ เปนผลใหสารแยกออกจากกัน เมื่อนําแผนเจลไป
ยอมสีจะปรากฏแถบสีของโปรตีนตามจํานวนชนิดที่อยูในสารประกอบนั้น
เนื่องจากโปรตีนเปนโมเลกุลที่มีประจุ จึงนํามาเปนประโยชนในการแยกสารบนเจลที่มีคา pH ตางๆ
เรียกวา Isoelectric Focusing (IEF) เมื่อโมเลกุลโปรตีนจะเคลื่อนที่ไปบนแผนเจลและจะหยุดในตําแหนงที่
ผลรวมบนประจุเทากับคา pI เมื่อนําไปยอมสีจะไดแถบสีของโปรตีนที่ประกอบในสารละลายนั้น
Capillary electrophoresis ปจจุบันไดมีการพัฒนารวมเทคนิค HPLC เขากับ SDS-PAGE เปน capillary
electrophoresis (CE) และนิยมใชกันมากในการวิเคราะหโปรตีนเนื่องจากเปนวิธีที่งาย ใชเวลานอยกวาเดิม
แตใหผลที่แมนยําและคงที่กวา SDS-PAGE แบบเดิม
Peptide mapping เปนการตรวจคุณลักษณะโครงสรางระดับ primary structure ของโปรตีน โดยใชเอ็นไซม
protease เชน trypsin หรือใชสารเคมีตัดสายโปรตีนใหเปน peptides สายสั้นๆและตรวจสอบดวย SDS-
PAGE ไดเปน peptide fingerprint และจะทราบน้ําหนักโมเลกุลของสาย peptides
 34

Terminal amino acids sequencing เปนการตรวจพิสูจนเอกลักษณของโครงสรางโปรตีนวิธีหนึ่ง โดยการ

ตรวจลําดับกรดอะมิโนที่อยูปลายสายทั้งสองขางของสายโปรตีน (N-terminal and C-terminal sequencing)
ดวย Edman reagent ปจจุบันมีเครื่องมืออัตโนมัติทําใหวิเคราะหไดงาย
Amino Acid sequencing เปนการศึกษากรดอะมิโนที่ประกอบเปนโปรตีน สามารถตรวจสอบหากเกิด
variation มีชนิดที่แตกตางไปจากสารธรรมชาติหรือจากที่ควรจะเปน ประกอบดวยขั้น ตอนการยอยโปรตีน
ที่รูปริมาณดวยกรดแลววิเคราะหหาชนิดของกรดอะมิโนที่แยกไดดวย ion-exchange HPLC หรือ reverse
phase HPLC และใหกรดอะมิโนทําปฏิกิริยากับสารมีสี เชน ninhydrin หรือ fluorescamine ซึ่งจะไดสี
ตางๆกันตามชนิดของกรดอะมิโน ปริมาณของกรดแตละชนิดเปนสัดสวนกับคาการดูดกลืนแสง
Glycosylation Analysis การตรวจองคประกอบของคารโบไฮเดทรทบนสายโปรตีนที่เรียกวา glycan ใช
เทคนิค HPLC รวมกับ mass spectrometry (LC/MS) ที่ใชในปจจุบันโดยการยอยโปรตีนเปนเปปไทดและ
แยกตอดวย lectin affinity chromatography เพื่อจับสายเปปไทดที่จําเพาะกับเลคตินแลวนํามาทําใหบริสุทธิ์
ดวย hydrophilic interaction chromatography (HIC) และจับ glycoform ที่ตําแหนง N-linked ดวยเอ็นไซมที่
เชื่อมตอกับ tag 180 แลวตรวจสอบเอกลักษณสายเปปไทดดวยเทคนิค LC/MS ซึ่งสามารถวิเคราะหดวย
เลคตินชนิดตางกันเพื่อใหไดขอมูลหลายแบบและนํามาประกอบกันเพื่อพิจารณาลําดับน้ําตาลที่ตอใน
glycoforms อีกวิธีหนึ่งคือให glycan จับบน solid support แทนการจับดวยเลคติน แลวยอยดวยเอ็นไซม เชน
peptide-N-glycanase ที่จําเพาะกับ N-linked และนํามาวิเคราะหดวย LC/MS หรือ LC/MS/MS
ELISA เปนเทคนิควิธีที่นิยมใชหาแอนติเจนหรือแอนติบอดีโดยอาศัยการจับกันอยางจําเพาะระหวาง
แอนติเจนและแอนติบอดีบน solid phase
Mass spectrometry เปนเครื่องมือที่ทันสมัยและนิยมใชกันมากขึ้นชนิดหนึ่งในการวิเคราะหขนาดและ
ลําดับกรดอะมิโนของสายเปปไทด โดยการยอยโปรตีนดวยเอนไซมแลวใหสารละลายที่ไดผานเขาไปใน
เครื่อง HPLC เมื่อสารผานถึงปลาย column จะถูกพนเปนละอองดวยหลักการ electrospray ionization เขาไป
ในเครื่อง mass spectrometer ประจุบนละอองจะทําใหโมเลกุลสารแตกเหลือเปนอิออนเดี่ยว วิเคราะห
spectrum ที่ไดดวยโปรแกรมคอมพิวเตอรและเทียบกับขอมูลใน data base และคํานวณ mass-charged ratio
ของสาร เมื่อทําซ้ําดวยเอ็นไซมชนิดอื่นที่ตัดสายโปรตีนในตําแหนงตางๆกัน และนําผลมารวมกันในการ
พิจารณาจะทําใหรูลําดับกรดอะมิโนของโปรตีนนั้น
Protein content การวิเคราะหปริมาณโปรตีนทําไดหลายวิธี และเนื่องจากโปรตีนที่เตรียมไดจะมีความ
บริสุทธิ์สูง ปริมาณนอย จึงตองเลือกใหเหมาะสม วิธีที่มักใชจึงเปน
UV-visible spectroscopy ไดแก
การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 280nm tryptophan และ tyrosine เปนกรดอะมิโนชนิดที่พบมากในโปรตีน
ชนิดตางๆ และสามารถดูดกลืนแสงที่ความยาวกลื่น 280 nm ไดดี จึงนํามาคํานวณเปนความเขมขนของ
โปรตีนของสารละลายนั้นได เหมาะกับสารที่มีความบริสุทธิ์มาก แตตองระวังการปนเปอนจาก nucleic acid
ซึ่งสามารถดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นนี้เชนกัน
 35

Lowry Method เปนการวิเคราะหโดยใช Folin-Ciocalteau phenol reagent ทําปฏิกิริยากับกรดอะมิโนชนิด

tyrosine และ tryptophan บนสายโปรตีนเกิดสีน้ําเงินฟาและอานคาการดูดกลืนแสงของโปรตีนที่ความยาว
คลื่น 500 - 750 nm และระบุเปนปริมาณโปรตีนโดยเทียบกับกราฟของสารมาตรฐาน ซึ่งเปนวิธีที่เหมาะสม
กวา biuret test ในการตรวจหาปริมาณโปรตีนจํานวนนอย
วิเคราะหปริมาณความชื้น ตรวจสอบปริมาณน้ําในโปรตีนเปนคารอยละดวยวิธี Karl Fischer methods ซึ่ง
โมเลกุลของน้ําในโปรตีนตัวอยางจะถูกสกัดออกมาและทําปฏิกิริยากับน้ํายา Karl Fischer reagent ซึ่งคาประ
แสไฟฟาจะเปลี่ยนแปลงไปตามประมาณน้ําที่ทําปฏิกิริยา
Sterility มีการตรวจสอบความสะอาดปราศจากเชื้อรา แบคทีเรีย ไดสองวิธีคือ direct inoculation โดยการ
เติมโปรตีนตัวอยางลงในอาหารเลี้ยงเชื้อและสังเกตการเจริญของเชื้อภายใน 14 วัน และวิธีที่ 2 คือ
membrane filtration โดยการกรองตัวอยางโปรตีนผาน membrane และ นํา membrane ใสในอาหารเลี้ยงเชื่อ
สังเกตวามีการเจริญของเชื้อภายใน 14 วันหรือไมเชนกัน
Abnormal toxicity เปนการทดสอบความเปนพิษของโปรตีนหรือในสัตวทดลองหนูตะเภาและหนูถีบจักร
สังเกตอาการปวยและน้ําหนักตัวของสัตวที่เปลี่ยนแปลงเทียบกับกลุม ควบคุมภายใน 7 วัน
Pyrogenicity มีสองวิธีคือ rabbit pyrogen test เปนการทดสอบในกระตาย หากกระตายมีอุณหภูมสิ ูงขึ้นเกิน
กวาที่มาตรฐานกําหนดแสดงวามีสารกอไข สวนวิธี LAL เปนการวิเคราะหหาปริมาณเอ็นโดท็อกซินของ
แบคทีเรียแกรมลบที่อาจบนเปอนในโปรตีนที่เตรียมไดโดยอาศัยคุณสมบัติของเอ็นโดท็อกซินที่สามารถทํา
ใหเลือดของแมงดาทะเลกลายสภาพเปนเจล ซึ่งสามารถคํานวณกลับเปนปริมาณเอ็นโดท็อกซินได
 36

3.6 ขอกําหนดเฉพาะ (Product specific requirements)

ข อ กํ า หนดเฉพาะเป น การกํ า หนดคุ ณ ภาพมาตรฐานของยาว า มีคุ ณ ลั ก ษณะตา งๆอย า งไร เช น

ลักษณะทางกายภาพ ความบริสุทธิ์ ปริมาณสารสําคัญ ประสิทธิภาพความแรง ปริมาณสารปนเปอน เปนตน
ซึ่งผูผลิตตองจัดทําขึ้นอยางมีหลักเกณฑและมีเหตุผลสนับสนุน ซึ่งขอกําหนดอาจมาจากตํารายาหากมี
กําหนดไวแลว หรือจากผูผลิตกรณีเมื่อตองการกําหนดขึ้นใหมแตตองมีเหตุผลชัดเจน โดยเฉพาะกรณีที่เปน
ยาใหมซึ่งยังไมมีขอกําหนดในตํารายาใดๆ ผูผลิตตองแสดงที่มาและเหตุผลการกําหนดคาตางๆซึ่งมักเปน
ขอมูลตั้ง แตการวิจัย พัฒนายา ขอกําหนดของยามีทั้งขอกําหนดในการปลอยผานเพื่อจําหนาย (release
specification) และขอกําหนดในการ ศึกษาความคงตัว (stability specification) ซึ่งควรสอดคลองไมขัดแยง
กัน
การกําหนดรายการขอกําหนดเฉพาะของยาเปนสวนหนึ่งของการควบคุมซึ่งรวมการควบคุมสารตั้ง
ตน วัตถุดิบ และ exipients, in-process testing, process validation, GMP, stability testing และการ
ตรวจสอบความสม่ําเสมอของการผลิตแตละรุน โดยปกติการกําหนดขอกําหนดเฉพาะของยาอาศัยขอมูล
จากขั้นตอนการพัฒนายา ขอมูลการศึกษาวิจัยทางพรีคลินิกและหรือทางคลินิก ขอมูลจากยาหลายๆรุนที่
ผลิตมาเพื่อตรวจสอบความสม่ําเสมอของการผลิต (Process validation)และขอมูลจากการศึกษาความคงตัว
หากเปนการแสดงขอมูลเพื่อขึ้นทะเบียนยา หนวยงานที่เกี่ยวของภาครัฐเปนจะผูตรวจ สอบและรับรอง
ขอกําหนดเฉพาะ เมื่อภาครัฐทําการตรวจรับรองคุณภาพของยาทางหองปฏิบัติ การจะตรวจวิเคราะหตาม
ขอกําหนดเฉพาะของยาแตละชนิดดวยวิธีมาตรฐานในตํารายาหรือที่กําหนดโดยผูผลิต ซึ่งเปนการตรวจเพื่อ
ยืนยันวายามีคุณลักษณะตางๆตามที่ผูผลิตระบุไว
 37

3.7 การศึกษาความคงตัว

เนื่องจาก biotechnological product เปนโปรตีนและเปบไทดโมเลกุลที่ไมคอยเสถียร หากเปนไป

ไดมักผลิตใหอยูในรูป lyophilized form เพื่อใหสามารถเก็บไดนานมากขึ้น แตปจ จุบนั ผลิตมีทั้งแบบน้ําและ
แบบผง ในระหวางการผลิตหรือการเก็บโปรตีนอาจเกิด deamination aggregation หรือ oxidation
proteolysis จากเอ็นไซม proteases ของ host cell และมักมีการเติม stabilizer ในยาสําเร็จรูป ใหไดยาคง
สภาพไดดีขึ้น ซึ่งไดแกสารกลุม protein, alcohol, amino acids, carbohydrates, bulking agents inorganic salt
หรือ nonionic surfactants และปจจัยอืน่ ทีต่ องพิจารณา เชน ปริมาณความชื้น เปนตน ดังนั้นตอง
ทําการศึกษาความคงตัวของโปรตีนเพื่อกําหนดสภาวะและระยะเวลาการเก็บที่เหมาะสม ซึ่งจะเปนขอมูล
สําคัญที่จะใชพัฒนาสูตรตํารับและการเลือกภาชนะบรรจุเมื่อนําไปผลิตเปน DS และ DP ตอไป
การศึกษาความคงตัวของ DS และ DPยาตองกําหนดเปนแผนการศึกษา และอาศัยหลาย
เทคนิควิธีเพื่อใหไดขอมูลความคงตัวและการสลายตัวของสาร แนวทางการศึกษามีดังนี้
Study protocol: จัดทําแผนการศึกษาทีก่ ําหนดรายละเอียดวิธกี ารศึกษาความคงตัวโปรตีนซึ่งควรมี
ขอมูลเหลานี้เปนอยางนอย
1. แสดงรายละเอียดของตัวอยางที่นํามาศึกษา เชนเปนโปรตีนที่ผลิตจาก pilot scale หรือ commercial
scale หรือเปนรุนที่ผลิตใชเพื่อตรวจสอบขบวนการผลิต (process validation lots)และระบุจํานวนรุน
ของตัวอยางทีน่ ํามาศึกษา ขนาดบรรจุ หมายเลขรุน มีรายละเอียดวันผลิต เปนตน
2. ระบุอุณหภูมิที่ตองการศึกษาความคงตัวของโปรตีน ซึ่งมักเปนอุณหภูมิที่คาดวาจะเปนสภาวะที่
เหมาะสมตอการรักษาสภาพโปรตีนนั้น เชน –20 ˚C หรือ 2-8˚C รวมทั้งอุณหภูมิที่เปนสภาวะที่รุนแรง
ตอโปรตีน เชนที่ 25 ˚C, 45 ˚C หรืออาจเพิ่มเติมการศึกษาที่เปน stress condition อื่นๆเพื่อเปนขอมูล
สนับสนุน เชน ศึกษาที่ความชื้นสัมพัทธสูง 75 % การใชแสง หรือที่อุณหภูมิต่ําหรือสูงมาก เปนตน ซึ่ง
จะแสดงความไวของการสลายตัวของตัวยาในสภาพตางๆ
เพื่อใหไดขอมูลลักษณะการสลายตัวของโปรตีน
3. กําหนดชวงเวลาที่จะทําการศึกษาเชน 6 เดือน 12 เดือน หรือ 24 เดือน เปนตน ชวงเวลา (Interval) ที่
จะนําตัวอยางมาวิเคราะหคุณลักษณะ เชน วิเคราะหทกุ 3 เดือนปแรก (0,3,6,9,12) ปที่สองวิเคราะหทุก
6 เดือน ตนไป จนครบกําหนดตามอายุของยาที่กําหนดไว
4. กําหนดรายการวิเคราะห (test items) ที่จะใชตรวจสอบคุณภาพโปรตีนตัวอยางและเกณฑยอมรับ
(acceptance criteria) วิธีวิเคราะหที่ใชตองเหมาะสมและผานการตรวจสอบความถูกตองแลว
5. กําหนดสถิติที่จะนํามาใชในการวิเคราะห และเกณฑการยอมรับ
 38

Study results: แสดงผลการศึกษาความคงตัวจากการวิเคราะหคุณภาพโปรตีนในชวงเวลาตางๆตามที่

กําหนดไวใน protocol โดยปกติมักแสดงเปนตารางและกราฟใหเห็นชัดเจน การตรวจสอบคุณภาพ ควร
ประกอบดวยหัวขอ ดังนี้
1. physicochemical characteristics เชน pH, ผลการศึกษาจาก chromatography, electrophoresis
เปนตน ซึ่งจะเห็นการเปลี่ยนแปลงขนาดของโมเลกุล และ ปริมาณสารปนเปอน
2. ความปลอดเชือ้ และความสามารถของสารกันเสีย (ถามี)
3. biological activity ของโปรตีนตามเวลาที่เปลี่ยนไป
4. ผลของ ภาชนะบรรจุเชน ขวด จุกยาง ตอคุณภาพของยา
Conclusion: เปนขอสรุปถึงการศึกษาความคงตัวของโปรตีนที่เตรียมไดนี้ สามารถระบุสภาวะการเก็บ
ที่เหมาะสมโดยมีเหตุผลสนับสนุน รวมทั้งสามารถอธิบายลักษณะการสลายตัวของโปรตีน
 39

3.8 สูตรตํารับ (Formulation)

เนื่องจากโมเลกุลของโปรตีนที่เปน biotechnological products ไมคอยเสถียรเนื่องมาจาก

กระบวนการผลิตและคุณลักษณะของยาที่ไวตอสิ่งแวดลอม เชนอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลง, แสง, ปฏิกิริยา
oxidation, ionic content ปฏิกิริยาทางเคมีหลายชนิด เชน deamination, proteolysis, disulfide exchange,
racemization ซึ่งเกิดขึ้นระหวางการทําใหบริสุทธิ์ อาจมีผลใหโมเลกุลโปรตีนไมเสถียร เมื่อจะนํามาผลิต
เปนยาสําเร็จรูป จึงตองทําการแกไขปรับปรุงใหมีสภาพที่เหมาะสม เชน ใหการเติมโมเลกุลชนิดอื่น เชน
polyethylene glycol เพื่อใหดูดซับไดดี นอกจากนี้ในการทําใหสะอาดปราศจากเชื้อไมสามารถฆาเชื้อ
โปรตีนไดดวยความรอนเพราะจะทําใหเสียสภาพ อาจตองใชการกรองแบบปราศจากเชื้อแตมีขอเสียคือทํา
ใหโมเลกุลจับตัวกันงายเปน dimer หรือ oligomers ดวยเหตุผลเหลานี้จึงทําพบโมเลกุลโปรตีนของยา
biotechnological products ไดหลายรูปแบบ ซึ่งเปนผลจากกระบวนการ post-translation ซึ่งโมเลกุลสวน
ใหญยังคงออกฤทธิ์เปนสารสําคัญได จึงตองศึกษาและระบุวามีโอกาสพบโมเลกุลแบบใดบาง ปริมาณเทาใด
และตองควบคุมการผลิตใหมีความสม่ําเสมอไมใหมีปริมาณเกินกวาที่กําหนด เนื่องจากโมเลกลุที่ตองการ
ผลิตใหไดเปนสารสําคัญนั้นคือโมเลกุลที่เปน monomer
อย า งไรก็ ต ามการตรวจสอบสภาพความคงตั ว ของโปรตี น ทํ า ได ย าก เนื่ อ งจากมีป จ จั ย ต า งๆที่
เกี่ยวของ ตองใชหลายวิธีรวมกันเพื่อวิเคราะห เชน การเสียสภาพ การเกาะบนผิว การจับตัวกันของโมเลกุล
โปรตีน การตกตะกอนหรือการจับกับ hydrophobic residues จึงตองปรับแกไขโดยกําหนด condition เชน
pH, ionic strength, temp, หรือเติมสารอื่น (additives) เพื่อชวยปรับสภาพใหมีความคงตัวดีขึ้นเหมาะสมตอ
การนําไปใช เชน เกลือ เพื่อชวยลดการเสียสภาพและการจับตัวกันที่เปนผลจากประจุบนโมเลกุลโปรตีน
หรือ polyalcohol ชวยตรึงโมเลกุลไวกับตัวทําละลาย หรือ surfactants ตางๆเพื่อปองกันการ เกาะติดบนผิว
อื่นที่ไมตองการรวมทั้งเติม preservative บางชนิด
 40

3.9 Container / closure system

ควรศึกษาและตรวจสอบชนิดของภาชนะสําหรับบรรจุโปรตีนที่เตรียมไดใหเหมาะสม ซึ่งไมควรมี
ผลกระทบตอหรือมีสวนเรงใหเกิดการเสื่อมสภาพสภาพของโปรตีน ทั้งภาชนะบรรจุที่เปนprimary packing
และ secondary packing ตลอดจนวิธีการปดผนึก โดยมีเหตุผลสนับสนุน