Immunologie 2 les 1

Herhaling immunologie 1

Tweede linie
Phagocytosis (H5)
• Type of endocytosis. Some leukocytes are capable (Neutrophils and macrophages)
Innate immunity (H5)
• Lysozyme (hydrolytic enzym in tears) cleaves bacterial cell wall
• Interferon induces an antiviral state
• Complement, inactive serum components that upon activation damage membranes of
pathogens
• Toll like receptors (TLR, a PRR). Membrane bound receptors that recognize structurally
conserved molecules derived from microbes (PAMP)

Derde linie
the adaptive immune system
• Specific defence
• Takes 5 to 6 days
• Memory effect (reacts faster to second infection by same pathogen) • Conducted by
lymfocytes and the antibodies that they produce
• The innate immune system and the adaptive immune system collaborate

Adaptive immunity
- Only present in jawed vertebrates (Gnathostomata)
- Four characteristics:
• Antigenic specificity
- Kleine verandering, soms 1 aminozuur
• Diversity
- Vele Ag op 1 organisme, versus PAMPs/PRRs
• Immunologic memory
• Self-nonself recognition

• Lymphocytes, antibodies and antigen presenting cells (APCs)

• Lymphocytes:
- B (Bursa/Beenmerg) lymphocytes, produces antibodies (plasma cell)
- T (Thymus) lymphocytes
• T helper cells (TH), CD4+
• T cytotoxic cells (TC) , CD8+

B cells and antibodies

• Antibodies are glycoproteins, two types:
- Membrane bound (surface, BCR)
- Soluble antibody (Ab)

B cells and antibodies

T-cellen kunnen herkend worden door expressie van CD4 of CD8

glycoproteinen
- The structure of TCR is very similar to immunoglobulin Fab
fragments (antibodies)
- Major difference: Antigens need to be bound to MHC for
activation

Major histocompatability complex (MHC)

- Two types:
• MHC class I are expressed on all nucleated cells
• MHC class II expressed only on antigen-presenting cells (APC)
• APC internalize pathogens/antigens
• B and T cells are antigenically committed
-MHC molecules recognize antigens but without specificity. Bind to a spectrum of antigenic
peptides derived from degradation of (foreign) proteins
• MHC class-I present cytosolic/intracellular peptides to the CD8+ cytotoxic T lymphocytes.
• MHC class II present processed extracellular antigenic peptides to the helper T lymphocytes
(CD4+).

[samenvatting dia 26&27]

Klonale selectie en geheugen cellen

Er “zwemmen” random B en T cellen rond
(=recirculation) die kunnen binden aan een nog
niet bestaand antigen! Zodra een B cel wordt
geactiveerd, zal deze gaan delen en
differentiëren tot plasma cel of memory cel.
• Cellen met “self-reactive receptors” worden
tijdens de ontwikkeling geëlimineerd.
• Clonal selection gevolgd door memory geeft
bescherming tegen een terugkomende infectie.

[oefening dia 31]

les 2

ligand: Signaal molecuul dat kan binden aan een specifieke receptor (non-covalent), hoeft
niet lichaamsvreemd te zijn.
Antigeen: Een stof of molecuul die bindt aan de immunoglobuline receptor van een B cel of
een T cel (T cel via het MHC).
Immunogenicity: ability of a molecule to induce a humoral and/or cell mediated immune
response

Antigeniciteit: ability of a molecule to bind to an antibody

Elke immunogene stof is antigeen; maar niet elke antigene stof is immunogeen!

Voorwaarden voor immunogeniciteit

Waar moet een stof aan voldoen om een immuunrespons op te wekken en dus een
immunogeen is?
1. Foreignness (lichaamsvreemd)
2. Molecular size
3. Chemical composition and complexity
4. Ability to be processed and presented with MHC on an antigen presenting cel (APC)
or altered self cell ALLE 4 ZIJN NODIG

1 Foreignness
• De mate van immunogeniciteit van een stof hangt af van de mate van lichaamsvreemdheid
van die stof
 Evolutionaire afstand (phylogenetic distance)
 Albumine van een kip zal dus eerder een respons opwekken in de mens dan albumine van
een chimpansee
• Self / non-self recognition
 In welk orgaan bevinden zich de meeste (self) antigenen?
 Tolerantie
 B (bone marrow) and T (thymus) cell maturation involves negative selection against
strong self-recognizing cells
 Waar gebeurt de herkenning lichaamseigen-vreemd en hoe ging dat ook alweer?

T cel selectie [dia 12]

B cel selectie [dia 13]

2 Molecular size
• Active immunogens >100 kD or >100.000 g/mol
• <5-10 kD is meestal niet immunogeen

3 Chemical complexity
• Grote maar “saaie/eentonige” macromoleculen zijn niet immunogeen. Bv. polymeren van
suikers of 1 enkel aminozuur
• Eiwitten hebben een complexe structuur, dus zijn in principe immunogeen
- Wanneer zijn eiwitten niet immunogeen? Lichaamseigen
 - Welke 4 eiwitstructuren zijn er te onderscheiden? Primair, secundair, tertiar en
quarternair

Chemical composition
• Polysacchariden; vooral de branch points kunnen immunogeen zijn
• Lipiden kunnen een B cell respons geven. Toepassingen:
- Immuniseren met lipiden-conjugaten met als gevolg: specifieke antilichamen tegen
lipiden
- Antilichamen tegen lipiden worden gebruikt in testen voor kwantificeren van
bijvoorbeeld prednison (immunosuppressief corticosteroid dat van cholesterol gemaakt
wordt, onderdrukt ontsteking, kwantificatie voor juiste behandeling)

4 MHC presentatie
• Grote onoplosbare of geaggregeerde stoffen zijn vaak meer immunogeen omdat ze beter
gefagocyteerd worden
- Welke cellen kunnen fagocyteren?
- Welke cellen zijn APC?
• Niet afbreekbare macromoleculen zijn zwak immunogeen omdat ze niet gepresenteerd
kunnen worden op MHC (bijvoorbeeld polymeren van D-aminozuren)

Epitopen
• Epitoop (of antigene determinanten): specifiek stuk van een antigen dat door een
antilichaam/BCR of TCR wordt herkend en gebonden
• Immuun (B of T) cellen binden maar een deel van een antigen: het epitoop
• Een antigen is complex en kan meer dan 1 verschillende epitopen hebben
- Wekt een heterogene mix van antilichamen op=polyclonaal (1 B cel=monoclonaal)

• B cellen en T cellen binden aan verschillende epitopen

• B cellen binden een antigen die vrij in oplossing is
- De epitopen van deze antigenen zijn meestal vrij toegankelijk op het oppervlak
• T cell epitopen zijn peptiden
- Door enzymatisch afbraak van pathogene eiwitten
- Herkent door de TCR wanneer geassocieerd met een MHC molecuul
- Hoe zat het ook alweer met processing, presenting en verschillende T cellen? [dia 22]

B-cel epitopen
Epitopen die B cellen herkennen
• Eiwit in natieve staat (tertaire/quaternaire structuur)
- Toegankelijke epitopen, zijn dus hydrofiel
- Kunnen hydrofobe aminozuren dienen als epitoop? Alleen na denaturatie
2 soorten:
Sequential epitopes  lineaire aaneengesloten aa-sequenties
Nonsequential epitopes (=conformational epitope)  na vouwing pas de juiste conformatie
voor herkenning

[opdracht dia 27 tm 30]

Sequentieel of niet-sequentieel
Experiment:
• Immunizeer muis met kippen-ei lysozyme
• Extraheer antiserum van muis
• In blauw een van de mogelijke epitopen van lysozyme
Is dit epitoop sequentieel of niet?

1. Incubeer antiserum met:

- Natural loop (heel lysozyme)
- Open loop
- Closed loop
2. Welke vorm kan het antilichaam binden?

Antibody – antigen interaction

●Niet covalent!
- Waterstofbruggen
- Ionbindingen
- Van de Waals krachten
- Hydrofobe interacties
● Krachten zijn zwak
● Over korte afstand ~1A=1x10^-10 m=0,1nm
● Goede “pasvorm” nodig
● Typische bindingsconstanten: 1x10^4 –1x10^11M
Multivalente binding
Antilichamen hebben 2 of meer bindingsplekken voor antigenen  multivalent

De binding van een antilichaam (Ab) aan een antigen (Ag) dat meerdere gelijke epitopen
heeft, is dan ook sterker dan met maar 1 binding (monovalent).
Deze bindingssterkte heet avidity

Affinity en Avidity
Affinity (Ka): Sterkte van een bepaalde binding tussen een antigen en antilichaam
Avidity (totale bindingssterkte): Totale som van affinity  Abs zijn vaak multivalent en
binden meerdere gelijke epitopen op een Ag

[oefening dia 39, 40, 41!]

een hogere avidity kan een lage affinity opheffen:

IgG heeft 2 bindingsplekken
IgM (pentameer) heeft 10 bindingsplekken

IgG  2x binding met hoge affiniteit

IgM  4x binding met lage affiniteit

Totale som affiniteit (=aviditeit) = gelijk

[oefeningen dia 43 tm 49]

Les 3

[oefeningen dia 4 tm 7]

Immunogeniciteit versus Antigeniciteit

Immunogenicity: ability to induce a humoral and/or cell mediated immune response
- Humoral
- Cell-mediated
Antigenicity: ability of a molecule to bind to an antibody/BCR/TCR
Elke immunogene stof is antigeen; maar niet elke antigene stof is immunogeen!

B-cel epitopen
Epitopen die B-cellen herkennen
Sequential (continuous) epitopes lineaire aaneengesloten AA-sequenties
Nonsequential (discontinuous/conformational) epitopes  na vouwing pas de juiste
conformatie voor herkenning

Experimenten in de 20e eeuw [zie kopieen]

-Interactie tussen lichte en zware keten of interactie tussen zware ketens  SS-bruggen en
niet-covalente verbindingen
-Elke lichte constante keten kan bestaan uit: κ of λ (niet specifiek voor klasse, bepaald door
AA volgorde)

Light chain bestaat uit variabel VL en constant CL deel

2 klassen light chain:
- kappa; κ
- lambda; λ
Bij de mens is 40% van Igs is λ en 60% is κ
Elke zware constante keten kan bestaan uit: μ, g, a, δ, e
Dit isotype (door aminozuurvolgorde bepaald) bepaalt in welke klasse het antilichaam behoort

Heavy chain bestaat uit variabel VH deel en meerdere constante CH delen (afhankelijk welk
isotype)
5 klassen heavy chain:
- mu  μ
- gamma 
- alpha 
- Delta  δ
- epsilon 
μ, g, a, δ, e zijn verschillende isotypes
Elk isotype bepaalt in welke
klasse (IgM/G/A/D/E) het antilichaam behoort
Variabele regio bevat hypervariabele regionen  complementary-determining regions
(CDRs) Present on heavy and light chains

Eiwitstructuren
Secundaire structuur:
 Aminozuren verbonden d.m.v. covalente peptide binding
 β-strand/sheets en α-helices

β-strand/sheets

Anti-parallele β-strands vormen β-sheets (harmonica vorm)  CO-groep (strand 1) vormt

waterstofbrug met NH-groep (strand 2) Aantal β-strands verschilt per β-sheet; hier 2 anti-
parallelle strands

Greek key topology

Immunoglobulin domeinen bevatten een

sandwich van 2 β-sheets 
immuunglobulin fold

Immunoglobin domein [dia 29,30]

[oefening dia 31 tm 34]

Immunoglobuline klassen – isotypen

Structuur
antilichaam in
detail
CH2 (of CH3) domeinen worden gescheiden door koolhydraten (CHO). Dit zorgt voor een
betere toegankelijkheid van de CH domeinen voor o.a. complement activatie

VL en VH domeinen bevatten hypervariabele stukken eiwit op de antigen bindende plekken

Deze regionen worden complementary- determining regions (CDRs) genoemd

Variability: Number of different amino acids at a given position / Frequency of the most
common amino acid at given position

Meeste variabiliteit in regios waar de β-strands worden verbonden; loops  Hypervariabel =

CDRs (complementair aan epitoop)

[oefening dia 46 tm 49]

Les 4
Immunoglobulin fold is a sandwich of β-pleated sheets of between 7 and 9 antiparallel β-
strands arranged in two β-sheets with a Greek key topology

Antibody effector functions [dia 22, tm 26]

IgM 09:49 27

• (μ2k2)n of (μ2l2)n, n=1 of 5

• Bevat een J chain (Joining chain) Antibody class - IgM
• Lage affiniteit, maar: • (µ2k2)n of (µ2l2)n, n=1 of 5

- bevat 10 antigen bindingssites • Bevat een J chain (Joining chain)

- max. 5 tegelijk bezet geometrische hinder
- hoge aviditeit te bereiken
• Wordt als eerste geproduceerd
• Efficiënt in binden virussen (repeats)
• Lage affiniteit, maar:
- bevat 10 antigen bindingssites
- max. 5 tegelijk bezet à geometrische hinder
- hoge aviditeit te bereiken
• Wordt als eerste geproduceerd
• Efficiënt in binden virussen (repeats)

• Grote complexen fagocytose • Grote complexen à fagocytose

C1q-binding mogelijk (complement)

IgG
• g2k2 of g2l2
• Meest aanwezige Ab in serum!
• 4 subklassen met elk een andere functie
• 3 typen  placenta passeren
Waarom belangrijk?
• 2 typen complement fixatie/ADCC
• Belangrijk in kankertherapie (les 7)
• Alle IgGs stimuleren opsonisatie

IgE
• e2k2 of e2l2
• Bind Fc receptoren op mest cellen, basofielen en
eosinofielen  secretie van granules = degranulatie
• Betrokken bij allergische reacties
• Belangrijk in bescherming tegen wormen en
protozoa (parasieten)

IgD
• d2k2 of d2l2
• Membraangebonden (co-expressed met IgM)
• Kleine hoeveelheden (0,2% totale Ig in serum)
• Functie ???
 Waarschijnlijk betrokken bij B cel activatie

IgA
• (a2k2)n of (a2l2)n, n=1, 2, 3 of 4
• Bevat een J chain (Joining chain)
• Meest aanwezige Ab in secreties:
- Mucuslaag darmen
- Speeksel
- Tranen
- Moedermelk
• Uitgescheiden IgA = dimeer/polymeer (IgA in circulatie = monomeer)
• Excretie via transcytosis:
- Poly-Ig receptoren binden aan J-chain, dus IgA dimeren (maar ook IgM)
- Endocytose
- Transport via vesicles naar lumen
- Poly-Ig receptor laat IgA los in lumen
• Voorkomt hechting en kolonisatie van (pathogene)
darmbacteriën
• Geen complement activatie geen ontstekingsbeeld
• Wel ADCC (via FcR op NKs) en degranulatie
• Lange halfwaardetijd: Fc ongevoelig voor proteases
• Meest geproduceerde antibody (~5-15g per dag)!

Fc receptoren
• komen voor op verschillende cellen
• Bind Fc regio van een antilichaam
 Poly-Ig receptor: transfer IgA (and IgM) across epithelial surfaces
 Neonatal Fc receptor (FcRN): transfer IgGs from mother to fetus
 Gamma: IgG, epsilon: IgE, alpha: IgA binding

Zie dia 41
Les 5

Antilichamen als antigeen

- Antigene determinant is eigenlijk een epitoop
- Antilichamen hebben ook epitopen
Regio van een antilichaam (antigen) kan herkent en gebonden worden door een ander
antilichaam
Drie typen: Isotypische antilichamen, Allotypische antilichamen, Idiotypische antilichamen
Anti-isotype antilichamen
Isotype: epitoop op een zware of lichte constante keten van één specifieke Ig (sub)klasse

Anti-isotype: antilichaam gericht tegen isotype epitoop  Cross-reactiviteit kan optreden

(bijvoorbeeld muis/rat)

Anti-allotype antilichamen
Allotype: (alternatief isotype) epitoop op een zware of lichte constante keten van de
alternatieve vorm (allel) van een specifieke Ig

Anti-allotype: antilichaam gericht tegen allotype epitoop  kleine verschillen (paar

aminozuren), bv:
- in verschillende strains van muizen
- in de zwangere vrouw  maakt anti-allotype tegen foetus

Anti-idiotype antilichamen
Idiotype: epitoop op een zware of lichte variabele keten (antigenbindingsite) binnen één
specifieke Ig (sub)klasse

Anti-idiotype: antilichaam gericht tegen idiotype epitoop  Muis injecteren met Mab (zelfde
bindingsite, dus zelfde idiotype)

[tabel dia 10]

Les 6

Polyklonaal  mix van antilichamen gericht tegen verschillende epitopen van een antigen
Monoklonaal  1 type antilichamen gericht tegen 1 epitoop van een antigen
Te verkrijgen door;

Polyklonale antilichamen
Gebruikt in; agglutinatie en immunoprecipitatie reacties
Nadeel; kruisreactiviteit
Monoklonale antilichamen zijn niet geschikt in deze reacties omdat..

Monoklonale antilichamen
• Antilichamen geproduceerd uit 1 B-cel (1 kloon)
• Antilichamen gericht tegen 1 epitoop (zelfde affiniteit)
Toepassing:
 Diagnostiek en research-laboratoria (Welke experimenten? ELISA, immunofluorescentie)
 Immunotherapie
bv bij bestrijding van kanker (Waarom niet met polyklonaal? Vaak kruisreacties)

4 categorieën van kankertherapie

• Chemotherapie: blokkeert DNA-synthese
• Hormoontherapie, verstoort tumorgroei
• Targeted therapies: small molecule inhibitors
• Immunotherapie: inductie of versterking van de anti-tumor immuunrespons

Immunotherapie
Behandeling met medicijnen die immuunsysteem versterken
• Toediening van cytokinen
 aansporing eigen B en T cellen tot immuunrespons
• Toediening van vaccins
 stimulatie aanmaak tumorspecifieke lymfocyten/antilichamen.
 alleen nog onderzoeksgerelateerd
• Toediening monoklonale antilichamen (p420-421 en 644-645)
 in vitro gemaakt
 rechtstreekse aanval op tumorcellen
 heel specifiek

Monoklonale antilichamen
Te verkrijgen door;

Antilichamen engineering (p137 6th)

Human Mab from mouse?
Compleet humaan artificieel chromosoom in muizencel gezet  HAC HAC-transgenic cattle
(vee) zijn ook al beschikbaar (~ 60 liter bloed)

Phage display [dia 20, 21]

Geen hybridoma technologie nodig
Constructie van een ‘Phage library’
- Gensegmenten geisoleerd van VH en VL
- Recombinatie (willekeurig) mbv linkerpeptide  enorme diversiteit, 1011!
- Expressie  scFv unit (single chain fragment variable unit)

[opgaven dia 22]

Les 7