Chromosome Res. 2010 Jun; 18(4): 487–502.

Published online 2010 May 7. 

doi: 10.1007/s10577-010-9129-8
PMCID: PMC2886897
PMID: 20449646

Cytogenetic map of common bean (Phaseolus vulgaris L.)

Artur Fonsêca,1 Joana Ferreira,1 Tiago Ribeiro Barros dos Santos,1 Magdalena
Mosiolek,2,3 Elisa Bellucci,4,5 James Kami,6 Paul Gepts,6 Valérie Geffroy,7,8 Dieter
Schweizer,2,3 Karla G. B. dos Santos,1 and Andrea Pedrosa-Harand1,2
Translate:
Res kromosom 2010 Jun; 18 (4): 487–502.
Diterbitkan online 2010 Mei 7.
doi: 10.1007 / s10577-010-9129-8
PMCID: PMC2886897
PMID: 20449646
Peta sitogenetik kacang panjang (Phaseolus vulgaris L.)
Artur Fonsêca, 1 Joana Ferreira, 1 Tiago Ribeiro Barros dos Santos, 1 Magdalena
Mosiolek, 2,3 Elisa Bellucci, 4,5 James Kami, 6 Paul Gepts, 6 Valérie Geffroy, 7,8
Dieter Schweizer, 2,3 Karla GB dos Santos, 1 dan Andrea Pedrosa-Harand1,2

Abstract
A cytogenetic map of common bean was built by in situ hybridization of 35
bacterial artificial chromosomes (BACs) selected with markers mapping to
eight linkage groups, plus two plasmids for 5S and 45S ribosomal DNA and
one bacteriophage. Together with three previously mapped chromosomes
(chromosomes 3, 4, and 7), 43 anchoring points between the genetic map and
the cytogenetic map of the species are now available. Furthermore, a subset
of four BAC clones was proposed to identify the 11 chromosome pairs of the
standard cultivar BAT93. Three of these BACs labelled more than a single
chromosome pair, indicating the presence of repetitive DNA in their inserts.
A repetitive distribution pattern was observed for most of the BACs; for 38%
of them, highly repetitive pericentromeric or subtelomeric signals were
observed. These distribution patterns corresponded to pericentromeric and
subtelomeric heterochromatin blocks observed with other staining methods.
Altogether, the results indicate that around half of the common bean genome
is heterochromatic and that genes and repetitive sequences are intermingled
in the euchromatin and heterochromatin of the species.
Translate:
Abstrak
Peta sitogenetik kacang umum dibuat dengan hibridisasi in situ dari 35
kromosom buatan bakteri (BAC) yang dipilih dengan pemetaan penanda ke
delapan kelompok keterkaitan, ditambah dua plasmid untuk DNA ribosom 5S
dan 45S dan satu bakteriofag. Bersama dengan tiga kromosom yang
dipetakan sebelumnya (kromosom 3, 4, dan 7), 43 titik penahan antara peta
genetik dan peta sitogenetik dari spesies sekarang tersedia. Selanjutnya,
subset dari empat klon BAC diusulkan untuk mengidentifikasi 11 pasangan
kromosom dari kultivar standar BAT93. Tiga dari BAC ini berlabel lebih dari
satu pasangan kromosom, yang menunjukkan adanya DNA berulang dalam
sisipannya. Pola distribusi berulang diamati untuk sebagian besar BAC;
untuk 38% dari mereka, sinyal pericentromeric atau subtelomeric yang sangat
berulang diamati. Pola distribusi ini sesuai dengan blok heterokromatin
pericentromeric dan subtelomeric yang diamati dengan metode pewarnaan
lainnya. Secara keseluruhan, hasil menunjukkan bahwa sekitar setengah dari
genom kacang umum adalah heterokromatik dan bahwa gen dan urutan
berulang bercampur dalam eukromatin dan heterokromatin spesies.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1007/s10577-010-9129-8) contains
supplementary material, which is available to authorized users.
Keywords: fluorescent in situ hybridization (FISH), bacterial artificial
chromosome (BAC), physical map, repetitive DNA sequences, Fabaceae
Translate:
Versi online artikel ini (doi: 10.1007 / s10577-010-9129-8) berisi materi
tambahan, yang tersedia untuk pengguna resmi.
Kata kunci: hibridisasi in situ fluoresen (IKAN), kromosom buatan bakteri
(BAC), peta fisik, sekuens DNA berulang, Fabaceae

Introduction
Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most economically important
species of the genus Phaseolus and the primary dietary protein source for
several populations, mainly in Latin America and Africa (Evans 1986). In
order to assist common bean breeding, several tools have been developed for
this species, including genetic maps (Vallejos et al. 1992; Nodari et al. 1993;
Adam-Blondon et al. 1994; Freyre et al. 1998; Hougaard et al. 2008) and
bacterial artificial chromosome (BAC) libraries (Vanhouten and
Mackenzie 1999; Kami et al. 2006; Gepts et al. 2008). In 2003, an
international consortium named Phaseomics was created in an effort to
accelerate the improvement of common bean (Broughton et al. 2003). One of
the aims of this initiative was to establish a cytogenetic-based physical map
for this species.
Cytogenetic maps of different plant species have been developed in
fluorescent in situ hybridization (FISH) experiments using BAC clones as
probes (Jiang and Gill 2006). This approach is especially recommended for
constructing maps of species with a small genome because the large
proportion of repetitive DNA in larger genomes may hamper the mapping of
BAC clones to unique genomic positions (Jiang and Gill 1996; Dong et
al. 2000; Islam-Faridi et al. 2002; Kim et al. 2005b; Pedrosa et al. 2002).
Such maps are often associated with genetic and contig maps, and may be
useful during whole-genome sequencing projects, either helping to evaluate
the size of the putative remaining gaps (Cheng et al. 2001) or helping to
decide which BACs are euchromatic and potentially gene rich and thus
should be sequenced (Young et al. 2005; Peters et al. 2009).
Common bean is a small-genome species selected for whole-genome
sequencing (Gepts et al. 2005), and accession G19833 is currently being
sequenced by a group of US laboratories (Scott Jackson, personal
communication). Its chromosomes (2n = 22) are small (around 2 µm) and
have similar morphologies, hindering a detailed cytogenetic characterization
by classic methods. Since FISH was first applied to its mitotic chromosomes,
major advances have, however, been obtained (Moscone et al. 1999; Pedrosa
et al. 2003; Pedrosa-Harand et al. 2006). A preliminary FISH analysis has
suggested a low general correlation between genetic and physical distances
when linkage groups (LGs) and chromosomes are compared, indicating the
necessity to establish a more detailed physical map (Pedrosa et al. 2003).
Recently, Pedrosa-Harand et al. (2009) published a BAC FISH mapping for
three ‘BAT93’ common bean chromosomes (chromosomes 3, 4, and 7,
according to the standard common bean nomenclature proposed by Pedrosa-
Harand et al. 2008), which reinforced the low correlation between genetic
and physical distances in this crop.
In the present study, we extended this analysis to complete the chromosomal
map of common bean. For this purpose, BACs from a genomic library from
the Mesoamerican genotype BAT93 (Kami et al. 2006) were selected for the
remaining eight chromosome pairs (chromosomes 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, and 11)
and mapped by FISH. The results were compared to the corresponding
genetic maps (Vallejos et al. 1992; Hougaard et al. 2008) and correlated to
the distribution of different repetitive sequences on each chromosome.
Translate:
pengantar
Kacang biasa (Phaseolus vulgaris L.) adalah spesies yang paling penting
secara ekonomi dari genus Phaseolus dan sumber protein makanan utama
untuk beberapa populasi, terutama di Amerika Latin dan Afrika (Evans
1986). Untuk membantu pemuliaan kacang pada umumnya, beberapa alat
telah dikembangkan untuk spesies ini, termasuk peta genetik (Vallejos et al.
1992; Nodari et al. 1993; Adam-Blondon et al. 1994; Freyre et al. 1998;
Hougaard et al. 2008) dan perpustakaan kromosom buatan bakteri (BAC)
(Vanhouten dan Mackenzie 1999; Kami et al. 2006; Gepts et al. 2008). Pada
tahun 2003, sebuah konsorsium internasional bernama Phaseomics dibentuk
dalam upaya untuk mempercepat perbaikan kacang biasa (Broughton et al.
2003). Salah satu tujuan dari inisiatif ini adalah untuk membuat peta fisik
berbasis sitogenetik untuk spesies ini.
Peta sitogenetik dari spesies tanaman yang berbeda telah dikembangkan
dalam percobaan hibridisasi in situ fluoresen (FISH) menggunakan klon BAC
sebagai probe (Jiang dan Gill 2006). Pendekatan ini terutama
direkomendasikan untuk membuat peta spesies dengan genom kecil karena
proporsi besar DNA berulang dalam genom yang lebih besar dapat
menghambat pemetaan klon BAC ke posisi genom yang unik (Jiang dan Gill
1996; Dong et al. 2000; Islam-Faridi dkk. 2002; Kim dkk. 2005b; Pedrosa
dkk. 2002). Peta semacam itu sering dikaitkan dengan peta genetik dan
contig, dan mungkin berguna selama proyek sekuensing genom keseluruhan,
baik membantu mengevaluasi ukuran celah yang diduga tersisa (Cheng et al.
2001) atau membantu memutuskan BAC mana yang ekromatik dan
berpotensi. kaya gen dan karenanya harus diurutkan (Young et al. 2005;
Peters et al. 2009).
Kacang biasa adalah spesies genom kecil yang dipilih untuk sekuensing
genom utuh (Gepts et al. 2005), dan aksesi G19833 saat ini sedang diurutkan
oleh sekelompok laboratorium AS (Scott Jackson, komunikasi pribadi).
Kromosomnya (2n = 22) berukuran kecil (sekitar 2 µm) dan memiliki
morfologi yang mirip, menghalangi karakterisasi sitogenetik yang rinci
dengan metode klasik. Sejak FISH pertama kali diterapkan pada kromosom
mitosisnya, kemajuan besar telah diperoleh (Moscone et al. 1999; Pedrosa et
al. 2003; Pedrosa-Harand et al. 2006). Analisis awal IKAN menunjukkan
korelasi umum yang rendah antara jarak genetik dan fisik ketika kelompok
keterkaitan (LGs) dan kromosom dibandingkan, yang menunjukkan perlunya
membuat peta fisik yang lebih rinci (Pedrosa et al. 2003). Baru-baru ini,
Pedrosa-Harand dkk. (2009) menerbitkan pemetaan BAC FISH untuk tiga
kromosom kacang umum 'BAT93' (kromosom 3, 4, dan 7, sesuai dengan
nomenklatur kacang umum standar yang diusulkan oleh Pedrosa-Harand et
al. 2008), yang memperkuat korelasi rendah antara genetik dan jarak fisik
pada tanaman ini.
Dalam penelitian ini, kami memperluas analisis ini untuk melengkapi peta
kromosom kacang biasa. Untuk tujuan ini, BAC dari perpustakaan genom
dari genotipe Mesoamerika BAT93 (Kami et al. 2006) dipilih untuk delapan
pasangan kromosom yang tersisa (kromosom 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, dan 11) dan
dipetakan oleh FISH. Hasilnya dibandingkan dengan peta genetik yang sesuai
(Vallejos et al. 1992; Hougaard et al. 2008) dan berkorelasi dengan distribusi
urutan berulang yang berbeda pada setiap kromosom.
Materials and methods

Plant material
Seeds from the P. vulgaris Mesoamerican breeding line BAT93 were
obtained from the germplasm bank of the International Center for Tropical
Agriculture (CIAT; Cali, Colombia).
Translate:
Bahan dan metode
Bahan tanaman
Benih dari jalur pemuliaan P. vulgaris Mesoamerika BAT93 diperoleh dari
bank plasma nutfah Pusat Internasional untuk Pertanian Tropis (CIAT; Cali,
Kolombia).

Chromosome preparation and fluorochrome staining

Root tips obtained from germinated seeds were pretreated with 2 mM 8-
hydroxyquinoline for 18 h at 10°C, fixed in ethanol–acetic acid (3:1 vol/vol),
and stored in fixative at −20°C for up to several weeks. Somatic chromosome
preparation, selection of slides, chromomycin A3 (CMA)/4′,6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI) staining, and destaining for FISH were performed in
accordance with Cabral et al. (2006).
Pachytene chromosome spreads were prepared as described previously,
except that flower buds were fixed without pretreatment and digested in 2%
(wt/vol) cellulase Onozuka R-10 (Serva), 1% (wt/vol) pectolyase (Sigma-
Aldrich), and 1% (wt/vol) cytohelicase (Sigma-Aldrich) for 2 h at 37°C, and
meiocytes were washed twice for 5 min in ice-cold 0.01 M citric acid–sodium
citrate buffer (pH 4.8) and left in distilled water overnight at 4°C before
dissection.
Translate:
Persiapan kromosom dan pewarnaan fluorochrome
Ujung akar yang diperoleh dari kecambah benih diberi perlakuan awal
dengan 2 mM 8-hydroxyquinoline selama 18 jam pada suhu 10 ° C, difiksasi
dalam etanol-asam asetat (3: 1 vol / vol), dan disimpan dalam fiksatif pada
suhu -20 ° C hingga beberapa jam. minggu. Preparasi kromosom somatik,
pemilihan slide, pewarnaan kromomisin A3 (CMA) / 4 ', pewarnaan 6-
diamidino-2-fenilindol (DAPI), dan destaining untuk IKAN dilakukan sesuai
dengan Cabral et al. (2006).
Sebaran kromosom pachytene disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya,
kecuali bahwa kuncup bunga difiksasi tanpa pretreatment dan dicerna dalam
2% (wt / vol) selulase Onozuka R-10 (Serva), 1% (wt / vol) pectolyase
(Sigma-Aldrich), dan 1% (wt / vol) sitohelikase (Sigma-Aldrich) selama 2
jam pada suhu 37 ° C, dan meiosit dicuci dua kali selama 5 menit dalam
larutan dingin 0,01 M asam sitrat-natrium sitrat buffer (pH 4,8) dan dibiarkan
dalam suling air semalaman pada suhu 4 ° C sebelum diseksi.

DNA probes
The probe D2, a 500-bp fragment containing 5S ribosomal DNA (rDNA)
from Lotus japonicus (Pedrosa et al. 2002), and the probe R2, a 6.5-kb
fragment of an 18S–5.8S–25S rDNA repeat unit from Arabidopsis
thaliana (Wanzenböck et al. 1997), were used to localize 5S and 45S rDNA
sites, respectively.
BAC clones were selected by screening high-density BAC filters from a
BAT93 HindIII genomic library (Kami et al. 2006) using genetically mapped
markers (the common bean genomic plasmid clone Bng), as described by
Pedrosa et al. (2003) and Pedrosa-Harand et al. (2009). A second group of
BAC clones was selected from the same library using the legume
marker Leg (Hougaard et al. 2008), as will be described later. Finally, one λ
bacteriophage, SJ19.12, obtained after screening of a JaloEEP558 genomic
library with a nucleotide-binding site probe (Ferrier-Cana et al. 2003), was
also included in this analysis. Bacteriophage SJ19.12 mapped at one end of
LG B10, distal to marker D1476, in the vicinity of the PROD15-680 random
amplification of polymorphic DNA (RAPD) marker (Geffroy et al. 2000).
BAC and plasmid DNA were isolated using the Plasmid Mini Kit (Qiagen),
whereas DNA Nucleobond AX columns (Macherey-Nagel) were used for
bacteriophage isolation, both following the manufacturers' instructions. All
selected clones were labelled by nick translation (Invitrogen or Roche
Diagnostics) with digoxigenin-11-dUTP (Roche Diagnostics), Cy3-dUTP (5-
amino-propargyl-2′-deoxyuridine 5′-triphosphate coupled to red cyanine
fluorescent dye; GE), or SpectrumGreen-dUTP (Vysis).
Translate:
Pemeriksaan DNA
Probe D2, sebuah fragmen 500-bp yang mengandung DNA ribosomal 5S
(rDNA) dari Lotus japonicus (Pedrosa et al. 2002), dan probe R2, sebuah
fragmen 6.5-kb dari unit pengulangan rDNA 18S-5.8S-25S dari Arabidopsis
thaliana (Wanzenböck et al. 1997), masing-masing digunakan untuk
melokalisasi situs 5S dan 45S rDNA.
Klon BAC dipilih dengan menyaring filter BAC densitas tinggi dari
perpustakaan genomik BAT93 HindIII (Kami et al. 2006) menggunakan
penanda yang dipetakan secara genetik (klon plasmid genom kacang umum
Bng), seperti yang dijelaskan oleh Pedrosa et al. (2003) dan Pedrosa-Harand
et al. (2009). Kelompok kedua klon BAC dipilih dari perpustakaan yang
sama menggunakan penanda legum Leg (Hougaard dkk. 2008), seperti yang
akan dijelaskan nanti. Akhirnya, satu bakteriofag λ, SJ19.12, diperoleh
setelah skrining perpustakaan genom JaloEEP558 dengan probe situs
pengikat nukleotida (Ferrier-Cana et al. 2003), juga dimasukkan dalam
analisis ini. Bakteriofag SJ19.12 dipetakan di salah satu ujung LG B10, distal
ke penanda D1476, di sekitar penanda amplifikasi acak PROD15-680 DNA
polimorfik (RAPD) (Geffroy et al. 2000).
BAC dan DNA plasmid diisolasi menggunakan Plasmid Mini Kit (Qiagen),
sedangkan kolom DNA Nucleobond AX (Macherey-Nagel) digunakan untuk
isolasi bakteriofag, keduanya mengikuti instruksi pabrik. Semua klon yang
dipilih diberi label oleh terjemahan nick (Invitrogen atau Roche Diagnostics)
dengan digoxigenin-11-dUTP (Roche Diagnostics), Cy3-dUTP (5-amino-
propargyl-2′-deoxyuridine 5′-triphosphate digabungkan dengan pewarna
fluorescent sianin merah; GE), atau SpectrumGreen-dUTP (Vysis).

Screening of BAC library with Leg

The Laboratory of Gene Expression, Department of Molecular Biology,
University of Aarhus, Denmark, provided 13 Leg primer pairs developed
using the approach described by Fredslund et al. (2005, 2006a, b) and
17 Leg sequences of P. vulgaris BAT93 (Hougaard et al. 2008) for the LG of
interest. Using these sequences, we designed primer pairs with Primer3
software (Rozen and Skaletsky 2000; http://frodo.wi.mit.edu/). After
selecting 17 low-copy or single-copy Leg probes by Southern blot or dot blot
analysis, we radioactively screened the BAC library in accordance with Kami
et al. (2006), with minor modifications, using two (of six) filters for each of
the three pools of five to six probes. In order to assign each clone to the
corresponding probe, we extracted BAC DNA following a standard alkaline
lysis plasmid miniprep protocol and amplified it with the Leg primer pairs.
Translate :
Pemutaran pustaka BAC dengan Leg
Laboratorium Ekspresi Gen, Departemen Biologi Molekuler, Universitas
Aarhus, Denmark, menyediakan 13 pasangan primer Kaki yang
dikembangkan menggunakan pendekatan yang dijelaskan oleh Fredslund et
al. (2005, 2006a, b) dan 17 Urutan kaki P. vulgaris BAT93 (Hougaard et al.
2008) untuk LG yang bersangkutan. Dengan menggunakan urutan ini, kami
merancang pasangan primer dengan perangkat lunak Primer3 (Rozen dan
Skaletsky 2000; http://frodo.wi.mit.edu/). Setelah memilih 17 probe kaki
salinan rendah atau salinan tunggal dengan analisis Southern blot atau dot
blot, kami secara radioaktif menyaring perpustakaan BAC sesuai dengan
Kami et al. (2006), dengan sedikit modifikasi, menggunakan dua (dari enam)
filter untuk masing-masing dari tiga kumpulan dari lima sampai enam probe.
Untuk menetapkan setiap klon ke probe yang sesuai, kami mengekstraksi
DNA BAC mengikuti protokol miniprep plasmid alkali lisis standar dan
memperkuatnya dengan pasangan primer Kaki.

Dot blot analysis for detection of BACs containing repetitive DNA

Denatured BAC DNA corresponding to Bng133 and Bng152 from
chromosome 5 was dot blotted onto a Nylon membrane (Hybond-N +; GE)
and submitted to hybridization with the C0t − 1 fraction [where C0 is the initial
concentration of single-stranded DNA (in mol/L), and t is the reannealing
time (in s)] of P. vulgaris genomic DNA as probe, isolated in accordance
with Zwick et al. (1997). The probe was labelled with digoxigenin using the
Dig high-prime DNA labelling kit (Roche Diagnostics). The membrane was
hybridized overnight with probe DNA in Dig Hyb hybridization buffer
(Roche Diagnostics) at 37°C. After hybridization, the membranes were
washed twice in 2× saline–sodium citrate (SSC) buffer and 0.1% sodium
dodecyl sulfate (SDS) for 5–15 min, and in 0.5× SSC buffer and 0.1% SDS
for 15 min at 68°C. The detection was performed using anti-DIG alkaline
phosphatase conjugate (Roche Diagnostics) and the chemiluminescent
substrate CDP-Star (Roche Diagnostics), according to the manufacturer's
instructions. Signals were captured on an X-ray ECL film (GE).
Translate:
Analisis dot blot untuk mendeteksi BAC yang mengandung DNA berulang
DNA BAC yang didenaturasi sesuai dengan Bng133 dan Bng152 dari
kromosom 5 diberi titik-titik pada membran Nylon (Hybond-N +; GE) dan
diserahkan untuk hibridisasi dengan fraksi C0t - 1 [di mana C0 adalah
konsentrasi awal DNA untai tunggal (dalam mol / L), dan t adalah waktu
reannealing (dalam s)] DNA genom P. vulgaris sebagai probe, diisolasi
sesuai dengan Zwick et al. (1997). Probe tersebut diberi label dengan
digoxigenin menggunakan kit pelabelan DNA prima tinggi Dig (Roche
Diagnostics). Membran dihibridisasi semalaman dengan DNA probe dalam
buffer hibridisasi Dig Hyb (Roche Diagnostics) pada suhu 37 ° C. Setelah
hibridisasi, membran dicuci dua kali dalam buffer 2 × saline-natrium sitrat
(SSC) dan natrium dodesil sulfat (SDS) 0,1% selama 5–15 menit, dan dalam
buffer 0,5 × SSC dan 0,1% SDS selama 15 menit pada suhu 68 ° C. Deteksi
dilakukan dengan menggunakan anti-DIG alkaline phosphatase conjugate
(Roche Diagnostics) dan substrat chemiluminescent CDP-Star (Roche
Diagnostics), sesuai dengan petunjuk pabrik. Sinyal ditangkap pada film ECL
sinar-X (GE).

Fluorescence in situ hybridization

The FISH procedure applied to both mitotic and meiotic chromosomes was
essentially the same as previously described (Pedrosa et al. 2002). Mitotic
and meiotic preparations were denatured for 5 min at 75°C and for 3 min at
73°C, respectively. The P. vulgaris C0t − 100 fraction was added in 20-fold to
400-fold excess to the hybridization mix to block repetitive sequences when
necessary. Digoxigenin-labelled probes were detected with 0.4 μl of sheep
anti-digoxigenin conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC; Roche
Diagnostics) and with 0.7 μl of donkey anti-sheep/goat conjugated with FITC
(Serotec) in 3% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline.
Reprobing of slides for localization of different DNA sequences in the same
cell was performed, in accordance with Heslop-Harrison et al. (1991, 1992),
up to four times. When a repetitive probe was used in a previous
hybridization, reprobing of slides was performed after the chromosomal
DNA had been denatured with 100 µl of 50% formamide in 2× SSC buffer at
75°C for 5 min, dehydrated in an ice-cold ethanol series, and air dried.
Translate:
Hibridisasi in situ fluoresensi
Prosedur FISH yang diterapkan pada kromosom mitosis dan meiosis pada
dasarnya sama seperti yang dijelaskan sebelumnya (Pedrosa et al. 2002).
Sediaan mitosis dan meiosis didenaturasi selama 5 menit pada suhu 75 ° C
dan selama 3 menit pada suhu 73 ° C. Fraksi P. vulgaris C0t - 100
ditambahkan dalam 20 kali lipat hingga 400 kali lipat berlebih ke campuran
hibridisasi untuk memblokir urutan berulang bila diperlukan. Probe berlabel
digoxigenin terdeteksi dengan 0,4 μl domba anti-digoxigenin terkonjugasi
dengan fluorescein isothiocyanate (FITC; Roche Diagnostics) dan dengan 0,7
μl keledai anti-domba / kambing terkonjugasi dengan FITC (Serotec) dalam
3% serum albumin sapi dalam fosfat- buffered saline. Reprobing slide untuk
lokalisasi urutan DNA yang berbeda dalam sel yang sama dilakukan, sesuai
dengan Heslop-Harrison et al. (1991, 1992), hingga empat kali. Ketika probe
berulang digunakan dalam hibridisasi sebelumnya, reprobing slide dilakukan
setelah DNA kromosom telah diubah sifatnya dengan 100 µl 50% formamide
dalam buffer 2 × SSC pada 75 ° C selama 5 menit, didehidrasi dalam etanol
dingin. seri, dan udara kering.

Data analysis
Photographs were taken in an epifluorescence Leica DMLB microscope
equipped with a Cohu charge-coupled device video camera using the Leica
QFISH software. For final processing, images were superimposed and
artificially colored using the Adobe Photoshop software version 10.0 and
adjusted for brightness and contrast only. Chromosomes were named and
oriented according to the standard common bean nomenclature (Freyre et
al. 1998; Pedrosa-Harand et al. 2008).
Translate:
Analisis data
Foto diambil di mikroskop epifluoresensi Leica DMLB yang dilengkapi
dengan kamera video perangkat Cohu charge-coupled menggunakan
perangkat lunak Leica QFISH. Untuk pemrosesan akhir, gambar
ditumpangkan dan diwarnai secara artifisial menggunakan perangkat lunak
Adobe Photoshop versi 10.0 dan disesuaikan hanya untuk kecerahan dan
kontras. Kromosom diberi nama dan diorientasikan sesuai dengan
nomenklatur kacang umum standar (Freyre et al. 1998; Pedrosa-Harand et al.
2008).

Measurements
Relative chromosome size and arm ratio were calculated based on
measurements of the chromosome and arm lengths of at least five mitotic
metaphases. The centromere was determined by the presence of DAPI + bands
at this position after FISH. The “measurement” tool of Adobe Photoshop was
used for all size estimations, including the size of repetitive BAC signals and
45S rDNA clusters in relation to chromosome size. The size of DAPI + bands
generated after FISH was measured from the more conspicuous and
reproducible terminal and pericentromeric bands, and for major nucleolar
organizer regions on chromosomes 9 and 10 (excluding the distended region).
For each of these three categories, the total measured value was compared to
the total genome size obtained by measuring all chromosome lengths. Neither
the brightness nor the contrast of these pictures was adjusted for
measurements in order to avoid possible distortions in signal extension.
In order to establish the relative position of each clone (single-copy BACs,
bacteriophage, and rDNA sites) along the chromosomes, we selected at least
15 clear hybridization signals. In this case, the software Image Tool 3.0 was
used for measurements after the contrast and the brightness of the pictures
had been adjusted with Adobe Photoshop 10.0. To calculate the position of
the signals, we took the following measurements: (1) the distance between
the opposite telomere and the center or the start (45S rDNA) of the signal; (2)
the distance between both telomeres (which gives the total chromosomal
length), by prolonging the previous measurement until the closest telomere;
and (3) the ratio between the first measurement and the second measurement,
to determine the relative position of the signal along the chromatid. The top
of the short arm was conventionally determined as 0, and the bottom of the
long arm was conventionally determined as 1. Assignment of a clone to a
specific chromosome arm was confirmed by reprobing the slides with a
previously mapped clone.
Translate:
Pengukuran
Ukuran kromosom relatif dan rasio lengan dihitung berdasarkan pengukuran
kromosom dan panjang lengan dari setidaknya lima metafase mitosis.
Sentromer ditentukan oleh kehadiran band DAPI + pada posisi ini setelah
FISH. Alat "pengukuran" Adobe Photoshop digunakan untuk semua estimasi
ukuran, termasuk ukuran sinyal BAC berulang dan kluster 45S rDNA dalam
hubungannya dengan ukuran kromosom. Ukuran pita DAPI + yang
dihasilkan setelah FISH diukur dari terminal dan pita perikentromerik yang
lebih mencolok dan dapat direproduksi, dan untuk daerah pengatur nukleolus
utama pada kromosom 9 dan 10 (tidak termasuk daerah buncit). Untuk
masing-masing dari ketiga kategori ini, nilai total yang diukur dibandingkan
dengan total ukuran genom yang diperoleh dengan mengukur semua panjang
kromosom. Baik kecerahan maupun kontras gambar-gambar ini tidak
disesuaikan untuk pengukuran untuk menghindari kemungkinan distorsi
dalam perluasan sinyal.
Untuk menetapkan posisi relatif setiap klon (situs BAC salinan tunggal,
bakteriofag, dan rDNA) di sepanjang kromosom, kami memilih setidaknya
15 sinyal hibridisasi yang jelas. Dalam hal ini, perangkat lunak Image Tool
3.0 digunakan untuk pengukuran setelah kontras dan kecerahan gambar
disesuaikan dengan Adobe Photoshop 10.0. Untuk menghitung posisi sinyal,
kami melakukan pengukuran berikut: (1) jarak antara telomer yang
berlawanan dan pusat atau awal (45S rDNA) sinyal; (2) jarak antara kedua
telomer (yang memberikan total panjang kromosom), dengan
memperpanjang pengukuran sebelumnya hingga telomer terdekat; dan (3)
rasio antara pengukuran pertama dan pengukuran kedua, untuk menentukan
posisi relatif sinyal sepanjang kromatid. Bagian atas lengan pendek secara
konvensional ditentukan sebagai 0, dan bagian bawah lengan panjang secara
konvensional ditentukan sebagai 1. Penugasan klon ke lengan kromosom
tertentu dikonfirmasi dengan menolak slide dengan klon yang dipetakan
sebelumnya.
Results
In order to achieve a high genome coverage for the eight unmapped common
bean chromosomes (chromosomes 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, and 11), we used
74 Bng markers (Vallejos et al. 1992) and 17 single-copy Leg (Hougaard et
al. 2008) mapped to the corresponding LGs for screening the BAT93 BAC
library (Kami et al. 2006). Following the two different approaches described
previously, we identified 82 BACs for 23 Bng markers and 39 BACs for
11 Leg, making a total of 121 BACs corresponding to 34 markers
(Supplementary Table 1). For the remaining markers used, no corresponding
BAC could be identified.
In the present article, 35 of the above selected BACs (Table 1)—plus BAC
gF11 (previously selected for LG B8 by Melotto et al. 2004), one
bacteriophage (SJ19.12, mapped to LG B10), and two plasmids (containing
5S and 45S rDNA sequences)—were hybridized in situ. The other BACs
listed in Supplementary Table 1 were not used for FISH because they were
selected with the same markers or mapped genetically very close to localized
clones. Considering all the 36 BACs hybridized in the present article and 30
BACs hybridized previously (Pedrosa-Harand et al. 2009), making a total of
66 BACs used for constructing a cytogenetic map for common bean, we
observed that only 39 (59%) showed unique localized signals in just one
chromosome pair; however, for half of them (18 BACs), the use of C0t − 1
or C0t − 100 blocking DNA in the hybridization mix (20-fold to 100-fold
more concentrated than the probe) was necessary in order to eliminate
labelling of dispersed repetitive sequences and to obtain unique signals.
Although selected with single-copy markers, 25 BACs (38%) showed highly
repetiti Pengukuran
Ukuran kromosom relatif dan rasio lengan dihitung berdasarkan pengukuran
kromosom dan panjang lengan dari setidaknya lima metafase mitosis.
Sentromer ditentukan oleh kehadiran band DAPI + pada posisi ini setelah
FISH. Alat "pengukuran" Adobe Photoshop digunakan untuk semua estimasi
ukuran, termasuk ukuran sinyal BAC berulang dan kluster 45S rDNA dalam
hubungannya dengan ukuran kromosom. Ukuran pita DAPI + yang
dihasilkan setelah FISH diukur dari terminal dan pita perikentromerik yang
lebih mencolok dan dapat direproduksi, dan untuk daerah pengatur nukleolus
utama pada kromosom 9 dan 10 (tidak termasuk daerah buncit). Untuk
masing-masing dari ketiga kategori ini, nilai total yang diukur dibandingkan
dengan total ukuran genom yang diperoleh dengan mengukur semua panjang
kromosom. Baik kecerahan maupun kontras gambar-gambar ini tidak
disesuaikan untuk pengukuran untuk menghindari kemungkinan distorsi
dalam perluasan sinyal.
Untuk menetapkan posisi relatif setiap klon (situs BAC salinan tunggal,
bakteriofag, dan rDNA) di sepanjang kromosom, kami memilih setidaknya
15 sinyal hibridisasi yang jelas. Dalam hal ini, perangkat lunak Image Tool
3.0 digunakan untuk pengukuran setelah kontras dan kecerahan gambar
disesuaikan dengan Adobe Photoshop 10.0. Untuk menghitung posisi sinyal,
kami melakukan pengukuran berikut: (1) jarak antara telomer yang
berlawanan dan pusat atau awal (45S rDNA) sinyal; (2) jarak antara kedua
telomer (yang memberikan total panjang kromosom), dengan
memperpanjang pengukuran sebelumnya hingga telomer terdekat; dan (3)
rasio antara pengukuran pertama dan pengukuran kedua, untuk menentukan
posisi relatif sinyal sepanjang kromatid. Bagian atas lengan pendek secara
konvensional ditentukan sebagai 0, dan bagian bawah lengan panjang secara
konvensional ditentukan sebagai 1. Penugasan klon ke lengan kromosom
tertentu dikonfirmasi dengan menolak slide dengan klon yang dipetakan
sebelumnya.ve signals, predominantly pericentromeric or subtelomeric, in all
chromosomes and could not be mapped. The remaining two BACs did not
give a signal.

Translate:

Hasil
Untuk mencapai cakupan genom yang tinggi untuk delapan kromosom
kacang umum yang belum dipetakan (kromosom 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, dan 11),
kami menggunakan 74 penanda Bng (Vallejos et al. 1992) dan 17 penanda
tunggal -copy Leg (Hougaard et al. 2008) dipetakan ke Pemda terkait untuk
menyaring perpustakaan BAT93 BAC (Kami et al. 2006). Mengikuti dua
pendekatan berbeda yang dijelaskan sebelumnya, kami mengidentifikasi 82
BAC untuk 23 penanda Bng dan 39 BAC untuk 11 Kaki, sehingga total 121
BAC sesuai dengan 34 penanda (Tabel Tambahan 1). Untuk penanda lainnya
yang digunakan, tidak ada BAC yang sesuai yang dapat diidentifikasi.
Dalam artikel ini, 35 dari BAC yang dipilih di atas (Tabel 1) - ditambah BAC
gF11 (sebelumnya dipilih untuk LG B8 oleh Melotto dkk. 2004), satu
bakteriofag (SJ19.12, dipetakan ke LG B10), dan dua plasmid ( mengandung
urutan 5S dan 45S rDNA) —dibridisasi secara in situ. BAC lain yang
tercantum dalam Tabel Tambahan 1 tidak digunakan untuk IKAN karena
mereka dipilih dengan penanda yang sama atau dipetakan secara genetik
sangat dekat dengan klon lokal. Mempertimbangkan semua 36 BAC yang
dihibridisasi dalam artikel ini dan 30 BAC yang dihibridisasi sebelumnya
(Pedrosa-Harand et al. 2009), membuat total 66 BAC digunakan untuk
membangun peta sitogenetik untuk kacang biasa, kami mengamati bahwa
hanya 39 (59%) menunjukkan sinyal lokal yang unik hanya dalam satu
pasangan kromosom; Namun, untuk setengah dari mereka (18 BAC),
penggunaan DNA pemblokiran C0t - 1 atau C0t - 100 dalam campuran
hibridisasi (20 kali lipat hingga 100 kali lipat lebih pekat daripada probe)
diperlukan untuk menghilangkan pelabelan urutan berulang dan untuk
mendapatkan sinyal unik. Meskipun dipilih dengan penanda salinan tunggal,
25 BAC (38%) menunjukkan Pengukuran yang sangat berulang
Ukuran kromosom relatif dan rasio lengan dihitung berdasarkan pengukuran
kromosom dan panjang lengan dari setidaknya lima metafase mitosis.
Sentromer ditentukan oleh kehadiran band DAPI + pada posisi ini setelah
FISH. Alat "pengukuran" Adobe Photoshop digunakan untuk semua estimasi
ukuran, termasuk ukuran sinyal BAC berulang dan kluster 45S rDNA dalam
skala kromosom. Ukuran pita DAPI + yang dihasilkan setelah FISH diukur
dari terminal dan pita perikentromerik yang lebih mencolok dan dapat
direproduksi, dan untuk daerah pengatur nukleolus utama pada kromosom 9
dan 10 (tidak termasuk daerah buncit). Untuk masing-masing dari ketiga
kategori ini, nilai total yang diukur dibandingkan dengan total ukuran genom
yang diperoleh dengan mengukur semua panjang kromosom. Baik mengukur
kontras gambar-gambar ini tidak terkalahkan untuk pengukuran untuk
menghindari kemungkinan distorsi dalam perluasan sinyal.
Untuk menentukan cara relatif setiap klon (situs BAC wilayah tunggal,
bakteriofag, dan rDNA) di sepanjang kromosom, kami memilih setidaknya
15 sinyal hibridisasi yang jelas. Dalam hal ini, Perangkat lunak Image Tool
3.0 digunakan untuk pengukuran kontras setelah dan koreksi gambar yang
terkalahkan dengan Adobe Photoshop 10.0. Untuk menghitung sinyal, kami
melakukan pengukuran berikut: (1) jarak antara sinyal telomer dan pusat atau
awal (45S rDNA) sinyal; (2) jarak antara kedua telomer (yang memberikan
total kromosom panjang), dengan pengukuran sebelumnya hingga telomer
terdekat; dan (3) rasio antara pengukuran pertama dan pengukuran kedua,
untuk menentukan posisi relatif sinyal sepanjang kromatid. Bagian atas
lengan pendek secara konvensional ditentukan sebagai 0, dan bagian bawah
lengan secara konvensional ditentukan sebagai 1. Penugasan klon ke lengan
kromosom dikonfirmasi dengan menolak slide dengan klon yang dipetakan
sebelumnya.ve sinyal, terutama pericentromeric atau subtelomeric, di semua
kromosom dan dapat tidak dipetakan. Dua BAC yang tersisa tidak
memberikan sinyal.

Table 1
List of mapped markers used for screening BAC clones and the general pattern of
hybridization of the selected BACs after FISH with or without blocking DNA
Translate:
Tabel 1
Daftar penanda yang dipetakan yang digunakan untuk skrining klon BAC dan
pola umum hibridisasi BAC terpilih setelah IKAN dengan atau tanpa pemblokiran
DNA

LGa Marker BAC FISH pattern FISH pattern with blocking DNA
b
clone without
blocking DNA

B1/H Bng41 221F15 Unique +

weakly
scattered

Bng17 38C24 Unique –

1

Bng17 257L12 Unique –

3
LGa Marker BAC FISH pattern FISH pattern with blocking DNA
b
clone without
blocking DNA

B2/D 4-Gm 21N14 Disperse

proximally

Bng45 225P1 Unique –

0

Bng57 14F2 Subtelomeric

18D16 Disperse
proximally +
one terminal
block

Bng17 92I7 Pericentromeri –

4 c

L120 82K2 No signal –

L188 127F19 Unique –

L224 17P14 Subtelomeric –

B5/E Bng49 36H21 Disperse

Bng13 230M2 Pericentromeri –

3 c

Bng15 193O2 Pericentromeri –

2 c

Bng16 103P1 Pericentromeri

1 2 c

B6/G Bng95 121F5 Unique –

Bng17 143N1 Pericentromeri –

7 0 c

Bng20 18B15 Unique –

2

L56 260H1 Pericentromeri –

LGa Marker BAC FISH pattern FISH pattern with blocking DNA
b
clone without
blocking DNA

B8/F Bng58 169G1 Disperse

6

Bng96 234P2 Subtelomeric

0

Bng13 177I19 Unique –

8

B9/K Bng2 224I16 Unique +

weakly
scattered

L159 123O2 Pericentromeri Pericentromeric (50× C0t − 100)

2 c

L206 37P17 No signal –

L207 163I7 Unique +

weakly
scattered

B10/I Bng20 173P6 Unique +

0 weakly
scattered

Bng21 63H6 Subtelomeric –

8
81A17 Pericentromeri –
c

L177 119E1 Subtelomeric –

9

B11/ Bng1 25D1 Disperse

J
Bng25 255F18 Unique + one –
terminal block
 LGa Marker BAC FISH pattern FISH pattern with blocking DNA
b
clone without
blocking DNA

Bng11 179N1 Unique –

2 4

Bng18 66N11 Pericentromeri –

7 c

L220 127J2 Unique + weak –

subtelomeric

(–) Not analyzed.

a
LGs D, E, and so on, defined by Vallejos et al. (1992), corresponding to LGs B2,
B5, and so on from the common bean core map (Freyre et al. 1998), as indicated
previously.
b
Bng markers were mapped by Vallejos et al. (1992) on the Florida map, while
markers 4-Gm and Leg were mapped by Hougaard et al. (2008) on another
mapping population.
Translate:
(-) Tidak dianalisis.
aLGs D, E, dan seterusnya, didefinisikan oleh Vallejos et al. (1992), sesuai dengan
Pemda B2, B5, dan seterusnya dari peta inti kacang umum (Freyre et al. 1998),
seperti yang ditunjukkan sebelumnya.
Penanda bBng dipetakan oleh Vallejos et al. (1992) di peta Florida, sedangkan
penanda 4-Gm dan Kaki dipetakan oleh Hougaard et al. (2008) tentang populasi
pemetaan lainnya.

Many attempts to block pericentromeric and subtelomeric sequences present

in repetitive BACs—from using C0t genomic fractions as general blocker to
using a specific blocker (khipu satellite) for subtelomeric BACs—were
performed (David et al. 2009; K.G.B. dos Santos, unpublished data).
However, none of the attempts was successful (data not shown), possibly
because the proportion of these repetitive sequences in the genome is too
high. Nevertheless, it was possible to remove subtelomeric signals (but not
the pericentromeric ones) from slides, making them useful for rehybridization
with other probes.
Hybridization signals of 15 BACs, showing practically the same pattern in
the pericentromeric region of all chromosomes and corresponding
approximately to 34% of the chromosome complement length, coincided
with the CMA+ bands generated after CMA/DAPI staining (Fig. 1a, b),
except for bands corresponding to 45S rDNA sites. After the FISH procedure,
small DAPI+ bands were sometimes also visible at the centromeric region of
mitotic chromosomes, corresponding to 12% of the chromosome complement
length (Fig. 1c). However, no BAC used in this work showed a similar
centromeric hybridization pattern. These centromeric DAPI + bands possibly
correspond to centromeric repeats not interspersed with single-copy
sequences and, therefore, not isolated by our screening. On the other hand,
terminal DAPI+ bands, generated after FISH, coincided either with major 45S
rDNA sites or with regions labelled by five subtelomeric BACs (Fig. 1f),
corresponding to 5% and 9% of the chromosome complement length,
respectively. Considering both CMA+ and DAPI-after-FISH bands as
indicative of constitutive heterochromatin (see "Discussion"), we estimate
that 48% of the common bean somatic karyotype is heterochromatic (5% of
rDNA, 9% of other subtelomeric blocks, and 34% of pericentromeric blocks).
Although this fraction is visibly enriched in repetitive sequences, it is also
populated by single-copy sequences, and likely by genes, since single-copy
markers are present in the inserts of BACs showing heterochromatin
distribution.
Translate:
Banyak upaya untuk memblokir sekuens pericentromeric dan subtelomeric
yang ada dalam BAC berulang — dari menggunakan pecahan genom C0t
sebagai blocker umum hingga menggunakan blocker spesifik (satelit khipu)
untuk BAC subtelomerik — dilakukan (David et al. 2009; KGB dos Santos,
data tidak dipublikasikan) . Namun, tidak ada upaya yang berhasil (data tidak
ditampilkan), kemungkinan karena proporsi urutan berulang dalam genom
terlalu tinggi. Namun demikian, dimungkinkan untuk menghilangkan sinyal
subtelomerik (tetapi bukan sinyal perikentromerik) dari slide, membuatnya
berguna untuk rehybridisasi dengan probe lain.
Sinyal hibridisasi dari 15 BAC, menunjukkan pola yang hampir sama di
daerah pericentromeric dari semua kromosom dan sesuai dengan kira-kira
34% dari panjang komplemen kromosom, bertepatan dengan pita CMA +
yang dihasilkan setelah pewarnaan CMA / DAPI (Gbr. 1a, b), kecuali untuk
pita-pita yang sesuai dengan situs 45S rDNA. Setelah prosedur FISH, pita
DAPI + kecil terkadang juga terlihat di daerah sentromerik kromosom
mitosis, sesuai dengan 12% panjang komplemen kromosom (Gbr. 1c).
Namun, BAC tidak digunakan dalam pekerjaan ini yang menunjukkan pola
hibridisasi sentromerik serupa. Pita DAPI + sentromerik ini mungkin sesuai
dengan pengulangan sentromerik yang tidak diselingi dengan urutan salinan
tunggal dan, oleh karena itu, tidak diisolasi oleh penyaringan kami. Di sisi
lain, pita DAPI + terminal, yang dihasilkan setelah FISH, bertepatan dengan
situs rDNA 45S utama atau dengan daerah yang diberi label oleh lima BAC
subtelomerik (Gbr. 1f), masing-masing sesuai dengan 5% dan 9% dari
panjang komplemen kromosom. Mempertimbangkan pita CMA + dan DAPI-
setelah-IKAN sebagai indikasi heterokromatin konstitutif (lihat "Diskusi"),
kami memperkirakan bahwa 48% dari kariotipe somatik kacang umum
adalah heterokromatik (5% rDNA, 9% blok subtelomerik lain, dan 34 % dari
blok perikentromerik). Meskipun fraksi ini tampak diperkaya dalam urutan
berulang, fraksi ini juga dihuni oleh urutan salinan tunggal, dan kemungkinan
besar oleh gen, karena penanda salinan tunggal terdapat dalam sisipan BAC
yang menunjukkan distribusi heterokromatin.

Fig. 1
Repetitive-rich regions visualized on mitotic chromosomes of common
bean. a CMA banding pattern (45S rDNA loci on chromosomes 9 and 10 are
indicated by arrowheads). b In situ hybridization of BAC 12M3, labelled with Cy3-
dUTP fluorochrome in the same cell as (a), showing a pericentromeric pattern
corresponding to CMA+ pericentromeric bands. c DAPI+ bands after FISH. d–f In
situ hybridization of repetitive BACs in the same cell. d DAPI counterstaining
(chromosome numbers are indicated). e BAC 12M3, labelled with a
SpectrumGreen-dUTP fluorochrome, showing a pericentromeric pattern. f BAC
63H6, labelled with Cy3-dUTP, showing a subtelomeric pattern. Chromosomes are
counterstained with DAPI and visualized in gray, except in (f). Bar in (f)
represents 2.5 µm

Although single-copy sequences are generally more efficient for chromosome

identification (Figs. 2, ,3,3, ,4),4), BACs showing repetitive hybridization patterns
were very informative in this study. With only one single-copy BAC (BAC 177I19
for chromosome 8) and three repetitive BACs [one pericentromeric (BAC 12M3),
one subtelomeric (BAC 63H6), and one showing a repeat block in chromosome 7
(BAC 255F18)], it was possible to identify each chromosomal pair of ‘BAT93’
through differences in signal intensity and localization, combined with
chromosome size. A BAC for chromosome 5 (36H21) confirmed its correct
identification by the four-BAC pool probe (Fig. 3e–g). The rDNA-bearing
chromosomes (chromosomes 6, 9, and 10) could be alternatively distinguished
by the distribution of their repetitive sequences (Fig. 4).
Translate:
Gambar 1
Daerah kaya berulang divisualisasikan pada kromosom mitosis kacang biasa.
pola pita CMA (lokus 45S rDNA pada kromosom 9 dan 10 ditunjukkan dengan
panah). b Hibridisasi in situ dari BAC 12M3, yang diberi label dengan fluorokrom
Cy3-dUTP dalam sel yang sama dengan (a), menunjukkan pola perikentromerik
yang sesuai dengan pita perikentromerik CMA +. c DAPI + band setelah FISH. d –
f Hibridisasi in situ dari BAC berulang dalam sel yang sama. d DAPI
counterstaining (nomor kromosom ditunjukkan). e BAC 12M3, diberi label dengan
SpectrumGreen-dUTP fluorochrome, menunjukkan pola pericentromeric. f BAC
63H6, berlabel Cy3-dUTP, menunjukkan pola subtelomer. Kromosom diwarnai
dengan DAPI dan divisualisasikan dalam warna abu-abu, kecuali pada (f). Batang
dalam (f) mewakili 2,5 µm

Meskipun urutan salinan tunggal umumnya lebih efisien untuk identifikasi

kromosom (Gambar 2,, 3,3, 4), 4), BAC yang menunjukkan pola hibridisasi
berulang sangat informatif dalam penelitian ini. Dengan hanya satu salinan BAC
(BAC 177I19 untuk kromosom 8) dan tiga BAC berulang [satu perikentromerik
(BAC 12M3), satu subtelomer (BAC 63H6), dan satu menunjukkan blok berulang
di kromosom 7 (BAC 255F18)], mungkin untuk mengidentifikasi setiap pasangan
kromosom 'BAT93' melalui perbedaan intensitas sinyal dan lokalisasi,
dikombinasikan dengan ukuran kromosom. Sebuah BAC untuk kromosom 5
(36H21) mengkonfirmasi identifikasi yang benar dengan probe pool empat BAC
(Gbr. 3e – g). Kromosom pembawa rDNA (kromosom 6, 9, dan 10) dapat
dibedakan secara alternatif dengan distribusi urutan berulangnya (Gbr. 4).

Fig. 2
In situ hybridization of genetically assigned BACs to common bean mitotic and
pachytene chromosomes. a BACs mapped to chromosome 1: 257L12 (pink),
38C24 (blue), and 221F15 (yellow). The top and middle inserts show each
homologous chromosome twofold enlarged with individual signals of BACs
257L12 (pink) and 38C24 (blue), respectively. The bottom insert shows both BACs
on pachytene chromosomes (bar, 1 µm). b BACs mapped to chromosome 2:
225P10 (pink) and 127F19 (yellow). c BAC mapped to chromosome 5: 36H21
(pink). d BACs mapped to chromosome 6: 18B15 (pink) and 121F5 (yellow).
Chromosomes are counterstained with DAPI and visualized in gray. Bar in (d)
represents 2.5 µm.
Translate:
Gambar 2
Hibridisasi in situ dari BAC yang ditetapkan secara genetik ke kromosom mitosis
dan pachytene kacang biasa. a BAC dipetakan ke kromosom 1: 257L12 (merah
muda), 38C24 (biru), dan 221F15 (kuning). Sisipan atas dan tengah menunjukkan
setiap kromosom homolog yang diperbesar dua kali lipat dengan sinyal individu
masing-masing dari BAC 257L12 (merah muda) dan 38C24 (biru). Sisipan bawah
menunjukkan kedua BAC pada kromosom pachytene (bar, 1 µm). b BAC
dipetakan ke kromosom 2: 225P10 (merah muda) dan 127F19 (kuning). c BAC
dipetakan ke kromosom 5: 36H21 (merah muda). d BAC dipetakan ke kromosom
6: 18B15 (merah muda) dan 121F5 (kuning). Kromosom diwarnai dengan DAPI
dan divisualisasikan dalam warna abu-abu. Batang dalam (d) mewakili 2,5 µm.

Fig. 3
In situ hybridization of genetically assigned and repetitive clones to common
bean mitotic chromosomes. a BACs mapped to chromosome 8: 169G16 (yellow)
and 177I19 (pink). b BACs mapped to chromosome 9: 163I7 (pink) and 224I16
(yellow). c Clones mapped to chromosome 10: SJ19.12 (pink) and 173P6
(yellow). d BACs mapped to chromosome 11: 25D1 (pink) and 179N14 (yellow). e–
g In situ hybridization of repetitive and single-copy BACs in the same cell. e DAPI
counterstaining. f BAC clones: 63H6 (subtelomeric; orange), 12M3
(pericentromeric; green), 225F18 (chromosomes 7 and 11; blue), and 177I19
(chromosome 8; pink). Identification of chromosome 5 was confirmed by
hybridizing with 36H21 (yellow). g Karyogram where all 11 chromosome pairs are
identified. Chromosomes are counterstained with DAPI and visualized
in gray. Bar represents 2.5 µm in (f) and 2 µm in (g).
Translate:
Gambar 3
Hibridisasi in situ dari klon yang ditetapkan secara genetik dan berulang ke
kromosom mitosis kacang biasa. a BAC dipetakan ke kromosom 8: 169G16
(kuning) dan 177I19 (merah muda). b BAC dipetakan ke kromosom 9: 163I7
(merah muda) dan 224I16 (kuning). c Klon dipetakan ke kromosom 10: SJ19.12
(merah muda) dan 173P6 (kuning). d BAC dipetakan ke kromosom 11: 25D1
(merah muda) dan 179N14 (kuning). e – g Hibridisasi in situ dari BAC berulang
dan salinan tunggal dalam sel yang sama. e DAPI counterstaining. f Klon BAC:
63H6 (subtelomerik; oranye), 12M3 (pericentromeric; hijau), 225F18 (kromosom 7
dan 11; biru), dan 177I19 (kromosom 8; merah muda). Identifikasi kromosom 5
dikonfirmasi dengan hibridisasi dengan 36H21 (kuning). g Karyogram di mana
semua 11 pasangan kromosom diidentifikasi. Kromosom diwarnai dengan DAPI
dan divisualisasikan dalam warna abu-abu. Batang mewakili 2,5 µm in (f) dan 2
µm in (g).

Fig. 4
Physical localization of BAC clones to P. vulgaris ‘BAT93’ mitotic chromosomes
counterstained with DAPI (gray). Subtelomeric (63H6) and pericentromeric (12M3)
repetitive BACs are shown in orange and green, respectively, and were isolated
from the same cell in order to show the relative intensity of the signals among
chromosomes. Unique clones (yellow, blue, and pink) are ordered according to
their distribution along arms (from top to bottom). The 5S (red) and 45S (green)
rDNA loci are also shown. Chromosomes 3, 4, and 7 were not included here
because they had been previously mapped (Pedrosa-Harand et al. 2009). Bar on
top represents 5 µm.
Translate:
Gambar 4
Lokalisasi fisik klon BAC ke kromosom mitosis P. vulgaris 'BAT93' diwarnai
dengan DAPI (abu-abu). BAC berulang subtelomerik (63H6) dan pericentromeric
(12M3) masing-masing ditampilkan dalam warna oranye dan hijau, dan diisolasi
dari sel yang sama untuk menunjukkan intensitas relatif sinyal di antara
kromosom. Klon unik (kuning, biru, dan merah muda) disusun menurut
distribusinya di sepanjang lengan (dari atas ke bawah). Lokus 5S (merah) dan
45S (hijau) rDNA juga ditampilkan. Kromosom 3, 4, dan 7 tidak dimasukkan di sini
karena telah dipetakan sebelumnya (Pedrosa-Harand et al. 2009). Batang di atas
melambangkan 5 µm.
Eighteen selected BACs plus BAC gF 11 (selected with the SAS13 marker from the
anthracnose resistance locus C0 − 4) and bacteriophage SJ19.12 were mapped to
the eight chromosomes analyzed in the present study (Table 2 and
Figs. 2, ,3,3, ,4).4). On average, two clones were mapped per chromosome, but
only one BAC (36H21) could be mapped to chromosome 5. After dot blot analysis
using the C0t − 1 genome fraction as probe, no other BAC identified for this
chromosome was selected for FISH, since all showed strong hybridization
signals indicative of the presence of highly repetitive DNA in its insert (data not
shown). For chromosome 1, two BACs were colocalized on the distal region of
the long arm (Fig. 2a). In order to have a higher-resolution mapping of the
colocalized BACs, we used pachytene chromosomes, providing evidence that
BAC 257L12 is more terminally located (Fig. 2a, bottom insert).
Translate:
Delapan belas BAC yang dipilih ditambah BAC gF11 (dipilih dengan penanda
SAS13 dari lokus resistensi antraknosa C0 - 4) dan bakteriofag SJ19.12 dipetakan
ke delapan kromosom yang dianalisis dalam penelitian ini (Tabel 2 dan Gambar
2,, 3,3, , 4) .4). Rata-rata, dua klon dipetakan per kromosom, tetapi hanya satu
BAC (36H21) yang dapat dipetakan ke kromosom 5. Setelah analisis dot blot
menggunakan fraksi genom C0t-1 sebagai probe, tidak ada BAC lain yang
teridentifikasi untuk kromosom ini dipilih untuk IKAN, karena semua
menunjukkan sinyal hibridisasi yang kuat yang menunjukkan adanya DNA yang
sangat berulang dalam sisipannya (data tidak ditampilkan). Untuk kromosom 1,
dua BAC dikolokalisasi pada daerah distal lengan panjang (Gbr. 2a). Untuk
mendapatkan pemetaan resolusi tinggi dari BAC terkolokalisasi, kami
menggunakan kromosom pachytene, memberikan bukti bahwa BAC 257L12
terletak lebih terminal (Gbr. 2a, sisipan bawah).
Table 2
Genetic locations of markers and the physical locations of their associated BACs
on the respective LGs and mitotic metaphase chromosomes
Translate:
Meja 2
Lokasi genetik penanda dan lokasi fisik dari BAC terkait pada masing-masing LG
dan kromosom metafase mitosis

Genetic map Cytogenetic map

Marker Positiona Clone Meanb n Standard deviation

Chromosome 1/H

Bng41 0.15 BAC 221F15 0.23 15 0.03

Bng17 0.96 BAC 38C24 0.91 15 0.03

1

Bng17 0.98 BAC 257L12 0.91 15 0.04

3

Chromosome 2/D

4-Gm – BAC 21N14 0.71 15 0.05

L188 – BAC 127F19 0.71 15 0.06

Bng45 1.00 BAC 225P10 0.93 15 0.02

Chromosome 5/E

Bng49 0.54 BAC 36H21 0.65 15 0.05

Chromosome 6/G

Bng95 0.33 BAC 121F5 0.61 15 0.05

Bng20 1.00 BAC 18B15 0.85 15 0.04

2

Chromosome 8/F

SAS13 – BAC gF11 0.08 15 0.02

Bng13 0.08 BAC 177I19 0.19 15 0.03

8

Bng58 0.80 BAC 169G16 0.92 15 0.03

Chromosome 9/K

L207 – BAC 163I7 0.56 15 0.02

 Genetic map Cytogenetic map

Marker Positiona Clone Meanb n Standard deviation

Bng2 1.00 BAC 224I16 0.92 15 0.02

Chromosome 10/I

Bng20 1.00 BAC 173P6 0.53 15 0.02

0
– Phage SJ19.12 0.59 15 0.05

Chromosome 11/J

Bng11 0.00 BAC 179N14 0.08 15 0.03

2

Bng25 0.51 BAC 255F18c 0.25 15 0.04

Bng1 0.79 BAC 25D1 0.67 15 0.04

L220 – BAC 127J2 0.87 15 0.04

a
The position of a genetic marker on the genetic map is indicated as a percentage
of the total LG length, calculated from data presented by Vallejos et al. (1992).
Markers 4-Gm, Leg, and SAS13 were mapped on other populations; thus, their
approximate genetic position is indicated in the idiogram only.
b
The position of BACs along the chromosome is indicated as a percentage of
total chromosome length, with the telomere of the short arm indicated as 0.00 and
with the telomere of the long arm indicated as 1.00.
c
A stronger additional signal was mapped to chromosome 7 at position 0.89 ± 0.04
(n = 15).

Based on previous (Pedrosa-Harand et al. 2009) and present data, an idiogram

was built for common bean (Fig. 5). P. vulgaris cv. BAT93 has three metacentric
chromosomes (chromosomes 4, 5, and 8), seven submetacentric chromosomes
(chromosomes 1, 2, 3, 7, 9, 10, and 11), and one acrocentric chromosome
(chromosome 6), according to the morphology classification of dos Santos
Guerra (1986). Chromosomes 6 and 10 have both 5S and 45S rDNA sites. An
additional 45S rDNA site is present on chromosome 9. Pericentromeric repetitive
sequences, identified by pericentromeric BACs, were present on all
chromosomes as very evident blocks, except on chromosome 6, which labelled a
small region, and chromosome 9, with an even smaller one. Subtelomeric
repetitive sequences, present in BACs with this hybridization pattern, were
visualized on all chromosomes, except for chromosome 9. Chromosomes 1, 4, 5,
7, 8, 10, and 11 presented subtelomeric sites on both arms, although some with
different sizes, while chromosomes 2, 3, and 6 presented only one site each, but
with different sizes.
Translate:
a. Posisi penanda genetik pada peta genetik diindikasikan sebagai persentase
dari total panjang LG, dihitung dari data yang disajikan oleh Vallejos et al. (1992).
Marker 4-Gm, Leg, dan SAS13 dipetakan pada populasi lain; dengan demikian,
perkiraan posisi genetiknya hanya ditunjukkan dalam idiogram.
b. Posisi BACs sepanjang kromosom ditunjukkan sebagai persentase dari total
panjang kromosom, dengan telomer lengan pendek diindikasikan sebagai 0,00
dan dengan telomer lengan panjang diindikasikan sebagai 1,00.
cA sinyal tambahan yang lebih kuat dipetakan ke kromosom 7 pada posisi 0.89 ±
0.04 (n = 15).

Berdasarkan data sebelumnya (Pedrosa-Harand et al. 2009) dan sekarang,

idiogram dibuat untuk kacang biasa (Gbr. 5). P. vulgaris cv. BAT93 memiliki tiga
kromosom metasentrik (kromosom 4, 5, dan 8), tujuh kromosom submetasentrik
(kromosom 1, 2, 3, 7, 9, 10, dan 11), dan satu kromosom akrosentrik (kromosom
6), menurut klasifikasi morfologi. dari dos Santos Guerra (1986). Kromosom 6 dan
10 memiliki situs 5S dan 45S rDNA. Situs rDNA 45S tambahan terdapat pada
kromosom 9. Sekuens berulang pericentromeric, yang diidentifikasi oleh BAC
pericentromeric, terdapat pada semua kromosom sebagai blok yang sangat jelas,
kecuali pada kromosom 6, yang diberi label wilayah kecil, dan kromosom 9,
dengan yang lebih kecil lagi . Urutan repetitif subtelomerik, yang terdapat pada
BAC dengan pola hibridisasi ini, divisualisasikan pada semua kromosom, kecuali
untuk kromosom 9. Kromosom 1, 4, 5, 7, 8, 10, dan 11 menampilkan situs
subtelomer pada kedua lengan, meskipun beberapa dengan ukuran berbeda ,
sedangkan kromosom 2, 3, dan 6 masing-masing hanya menampilkan satu situs,
tetapi dengan ukuran yang berbeda.
Fig. 5
Idiogram of common bean in comparison to its genetic linkage map established
by Vallejos et al. (1992). The position of Leg on LGs from the Florida map is
tentatively indicated by vertical bars and based on the position of those markers
in the core map (Hougaard et al. 2008). The idiogram shows the relative
chromosome length, position of centromeres, distribution of pericentromeric and
subtelomeric heterochromatin, rDNA loci, and position of the mapped clones. The
sizes of the subtelomeric blocks revealed by BAC 63H6 are only approximate. All
other sizes and positions are based on measurements (see "Materials and
Methods"). For chromosomes 3, 4, and 7, only a few BACs mapped by Pedrosa-
Harand et al. (2009) are indicated. Chromosome 10 was used for normalizing
chromosome and LG lengths.
Translate :
Gambar 5
Idiogram kacang umum dibandingkan dengan peta keterkaitan genetik yang
dibuat oleh Vallejos et al. (1992). Posisi Kaki pada Pemda dari peta Florida untuk
sementara diindikasikan oleh batang vertikal dan berdasarkan posisi penanda
tersebut di peta inti (Hougaard et al. 2008). Idiogram menunjukkan panjang
kromosom relatif, posisi sentromer, distribusi heterokromatin perikentromerik
dan subtelomerik, lokus rDNA, dan posisi klon yang dipetakan. Ukuran blok
subtelomerik yang diungkapkan oleh BAC 63H6 hanyalah perkiraan. Semua
ukuran dan posisi lain didasarkan pada pengukuran (lihat "Bahan dan Metode").
Untuk kromosom 3, 4, dan 7, hanya beberapa BAC yang dipetakan oleh Pedrosa-
Harand et al. (2009) diindikasikan. Kromosom 10 digunakan untuk menormalkan
panjang kromosom dan LG.
Four BACs were mapped to chromosome 11, two to each arm. BAC 225F18,
localized proximally on the short arm, showed an additional prominent signal
terminally on the long arm of chromosome 7 (Fig. 3e), corresponding to a new
repetitive DNA sequence (T.R.B. dos Santos et al., manuscript in preparation).
While the distance between the DNA markers corresponding to BACs 225F18 and
179N14 corresponds to almost 50% of the LG size, the physical distance between
them only represents 8% of the total chromosomal length. Similarly, the physical
distance between BACs 163I7 and 224I16, from the long arm of chromosome 9,
was equivalent to 36% of the total chromosomal length, but the estimated genetic
distance between their DNA markers probably corresponds to ca. 90% of the LG.
These data suggest a higher recombination rate along these chromosome arms.
On the other hand, a comparison of genetic and physical distances
between Bng25 (225F18) and Bng1 (25D1) from chromosome 11 revealed
suppression of recombination in the pericentromeric region.
Translate:
Empat BAC dipetakan ke kromosom 11, dua di setiap lengan. BAC 225F18,
terlokalisasi secara proksimal pada lengan pendek, menunjukkan sinyal menonjol
tambahan pada lengan panjang kromosom 7 (Gbr. 3e), sesuai dengan urutan DNA
berulang baru (T.R.B. dos Santos et al., Naskah dalam persiapan). Sementara
jarak antara penanda DNA yang sesuai dengan BAC 225F18 dan 179N14 sesuai
dengan hampir 50% ukuran LG, jarak fisik di antara mereka hanya mewakili 8%
dari total panjang kromosom. Demikian pula, jarak fisik antara BAC 163I7 dan
224I16, dari lengan panjang kromosom 9, setara dengan 36% dari total panjang
kromosom, tetapi perkiraan jarak genetik antara penanda DNA mereka mungkin
sesuai dengan ca. 90% dari LG. Data ini menunjukkan tingkat rekombinasi yang
lebih tinggi di sepanjang lengan kromosom ini. Di sisi lain, perbandingan jarak
genetik dan fisik antara Bng25 (225F18) dan Bng1 (25D1) dari kromosom 11
mengungkapkan penekanan rekombinasi di daerah pericentromeric.

Discussion
In this article, we present the mapping of the remaining eight chromosome
pairs of common bean using 20 clones that gave unique sequences with or
without blocking DNA, complementing the previous mapping of chromosomes 3,
4, and 7 (Pedrosa-Harand et al. 2009). We also propose a set of four BAC clones
that can be used to recognize all chromosomes of the complement of BAT93,
aiding future mapping. This is the third cytogenetic map of a legume species,
after L. japonicus (Pedrosa et al. 2002) and Medicago truncatula (Kulikova et
al. 2001), and the first for a tropical legume. Because of its proximity to other
economically important species from the phaseoloids clade such as soybean and
cowpea (Gepts et al. 2005), it will be useful for further syntenic studies in the
group, especially considering the tetraploid nature of soybean (Shoemaker et
al. 2006; Schlueter et al. 2008).
The common bean cytogenetic map presented here is integrated into the
core linkage map of the species (Freyre et al. 1998) through BACs selected using
markers from the Florida map (Vallejos et al. 1992) and the recently developed
map using comparative anchor-tagged sequence loci (Hougaard et al. 2008).
Except for chromosome 5, for which only one anchoring point could be
established, LGs were assigned and oriented in respect to chromosome short
and long arms, confirming the orientation of LGs and chromosomes recently
proposed (Pedrosa-Harand et al. 2008). LG I (Vallejos et al. 1992) corresponds to
the short arm and part of the long arm of chromosome 10 only because the BAC
corresponding to the terminal Bng200 marker mapped to the middle of the long
arm. Although the long arm has a large terminal 45S rDNA cluster, the position of
the clones mapped to this chromosome indicates that LG I does not have good
coverage. Indeed, more terminal markers were mapped to the corresponding LG
10 (Hougaard et al. 2008), including an rDNA locus (Freyre et al. 1998) and an
RAPD marker PROD15680 (Geffroy et al. 2000), in the vicinity of which the
bacteriophage SJ19.12 was mapped. LGs G and K, on the other hand, apparently
only correspond to the long arms of chromosomes 6 and 9, respectively. In both
cases, short arms seem to be composed mainly of 45S rDNA. The 45S rDNA locus
on chromosome 6 has been observed in all accessions of P. vulgaris investigated
so far (Moscone et al. 1999; Pedrosa et al. 2003; Pedrosa-Harand et al. 2006).
Variations in the size of this cluster were correlated with the arm and
chromosome sizes. Indeed, although chromosome 6 is acrocentric and is the
smallest chromosome in ‘BAT93,’ it is metacentric and the largest in ‘Saxa’
(Moscone et al. 1999; present results). Chromosome 9 also seems to carry a
conserved rDNA locus (Pedrosa-Harand et al. 2006), but its morphology had not
been correctly established before. It was initially considered to be metacentric
(Moscone et al. 1999; Pedrosa et al. 2003), but its centromere was probably
misidentified due to lack of a conspicuous primary constriction. The presence of
pericentromeric repetitive sequences adjacent to the terminal rDNA cluster and
the occasional observation after FISH of the DAPI staining of positive dots in the
same region indicate that this chromosome is submetacentric in ‘BAT93’ and
probably in all accessions of the species.
The order of markers in the LG was in complete agreement with the order
of the corresponding BACs along the chromosomes. For chromosome 1, two
BAC clones 38C24 and 257L12, corresponding to Bng171 and Bng173,
respectively, colocalized on mitotic chromosomes, but could be ordered after
mapping on pachytene chromosomes. BAC 257L12 mapped more terminally than
38C24, corresponding to the more terminal position of Bng173 relative
to Bng171 in the LG. These BACs were adjacent to each other in pachytene
chromosomes, confirming their close physical proximity and explaining the
difficulty in ordering these markers with high confidence on the genetic map
(Vallejos et al. 1992). The map of chromosome 11 confirmed the suppression of
recombination in extended pericentromeric chromosome regions observed
previously (Pedrosa-Harand et al. 2009): less than a quarter of the LG length
corresponded to more than half of the chromosome size. The mapping of
heterochromatin along chromosomes indicated that suppression of
recombination correlates with the presence of prominent pericentromeric
heterochromatic blocks (see Fig. 5).
The pericentromeric heterochromatin was defined by the repetitive
distribution pattern of BAC 12M3, which gave pericentromeric signals, and the
colocalization of these regions with the bright CMA + bands after CMA/DAPI
staining (see also Zheng et al. 1993). The BAC clone that mapped more proximally
on the long arm of chromosome 11, BAC 25D1, and two other BACs (36H21 and
173P6) mapped to pericentromeric heterochromatin and needed the addition
of C0t − 100 blocking DNA to give single-copy signals. Blocking was, however,
also necessary for some BACs that mapped to euchromatin. The occurrence of
many BACs containing repetitive sequences, although all had been selected with
single-copy markers, indicates that unique sequences are frequently interspersed
with repetitive sequences, confirming the less compartmentalized nature of the
common bean genome (Pedrosa-Harand et al. 2009). In complete agreement with
this hypothesis, sequencing of the B4 resistance gene cluster in BAT93,
combined with FISH experiments, revealed that low-copy genes were
interspersed with repetitive sequences (Geffroy et al. 2009; David et al. 2010).
The high proportion of repetitive sequences intermingled with single-copy
sequences in euchromatin and heterochromatin is not the only prominent feature
of the relatively small common bean genome (approximately 600 Mb;
Arumuganathan and Earle 1991). Half (48%) of its genome was estimated to be
heterochromatic based on the proportion of rDNA (5% of the genome),
subtelomeric blocks (9%), and pericentromeric blocks (34%) on mitotic
chromosomes. This value may be underestimated because small regional
heterochromatic regions are not detectable by the cytological procedures used
(Houben et al. 2003), but it correlates well with estimates of the proportion of
repetitive sequence (49.3%; Schlueter et al. 2008) and the proportion of
methylated DNA (60%), obtained by methyl filtration of common bean (BAT93)
DNA (P. Gepts, unpublished data). It is, however, larger than previous estimates
for the heterochromatin content of the species (approximately 10% and 21%),
which were based on centromeric DAPI + bands after FISH (Moscone et al. 1999)
and C-bands (Zheng et al. 1991), respectively. It is also considered high when
compared to estimates for other species based on measurements of
heterochromatin revealed by C-banding or CMA/DAPI staining (see, for example,
Guerra 1993). Furthermore, it is similar to the estimated heterochromatin content
from sorghum, which has a larger genome (818 Mb; Kim et al. 2005a), although
smaller than estimates based on pachytene-condensed regions from M.
truncatula (60% of 560–580 Mb; Kulikova et al. 2004). Interestingly, the
pericentromeric heterochromatin of the species can be clearly subdivided into
two different domains: the pericentromeric region, corresponding to BAC 12M3
distribution, CMA+ bands, probably the strongly condensed pachytene regions
(Pedrosa-Harand, unpublished data), and the C-bands described in previous
publications (Zheng et al. 1991; Moscone et al. 1999), and the centromeric region,
revealed by DAPI after some FISH experiments and corresponding to only about
12% of the chromosome length. None of the hybridized BACs selected with
genetically mapped markers showed a “centromeric” distribution, possibly due to
the lack of single-copy dispersed sequenced in this domain. We hypothesize that
the centromeric regions may be composed mainly of tandemly repeated
sequences, while the pericentromeric regions surrounding the centromere are
composed of dispersed repetitive sequences interspersed with single-copy
sequences, leading to distinct stainability after different banding procedures of
these two heterochromatic domains. Supporting this hypothesis, subcloning and
sequencing of pericentromeric BACs identified retroelement-like sequences in
their inserts (K.G.B. dos Santos et al., manuscript in preparation). This marked
difference is, however, not clear in the centromere structure of other plant
species studied so far, such as Arabidopsis, rice, and maize, because the
centromeres of these species are composed of intermingled satellite repeats,
centromere-specific retrotransposons, and genes (Nagaki et al. 2004; Ma et
al. 2007; Yan and Jiang 2007; Gill et al. 2008). Therefore, it is possible that the
proportion of these different types of sequences, rather than their presence or
absence, defines these different chromatin domains.
It is worth noting that the bands obtained with DAPI after the FISH
procedure are different from the CMA + bands that, because of their extension,
probably correspond to the previously reported C-bands (Zheng et al. 1991, 1993;
Moscone et al. 1999). DAPI-after-FISH bands have been considered as largely
equivalent to C-bands in common bean and other species (Moscone et
al. 1996, 1999; Barros e Silva and Guerra 2009), but we demonstrate that they
correspond to only a small fraction of the pericentromeric heterochromatin in
common bean. Consequently, estimates of heterochromatin content based
exclusively on DAPI-after-FISH bands should be considered with caution. A
combination of different approaches is more likely to reveal the heterochromatin
of a species in its totality and complexity.
We demonstrate that the genome of common bean is composed of 52%
euchromatin enriched with single-copy sequences interspersed with dispersed
repeats, 31% of pericentromeric heterochromatin (22%, excluding 12% of
centromeric heterochromatin) and subtelomeric (9%) heterochromatin enriched
with dispersed and tandem repeats interspersed with single-copy genetically
mapped sequences, and 17% of rDNA (5%) and centromeric (12%)
heterochromatin composed of repeats probably organized in tandem and largely
devoid of low-copy-number genes. The tandem arrangement of the repeats in the
subtelomeric heterochromatin of common bean has been demonstrated (David et
al. 2009). This organization has implications for the strategy defined for
sequencing the common bean genome. In practice, only the latter relatively small
fraction (17%) could be left aside during a genome sequencing endeavor,
considering that most of the heterochromatin also contains genes that should be
sequenced. Therefore, a whole-genome approach, such as the selected whole-
genome shotgun sequencing strategy (Scott Jackson, personal communication),
is more appropriate. We should also anticipate the difficulty of dealing with a high
proportion of repetitive sequences in the common bean genome (Schlueter et
al. 2008) and possibly the need for further BAC FISH mapping for ordering
contigs or estimating gaps, as performed in tomato (Peters et al. 2009).
Furthermore, this organization suggests that the heterochromatin should be
considered as a heterogeneous chromosomal domain (see Chang et al. 2008)
even in a species with a small genome.

Acknowledgements
We thank Alba Torres (CIAT) for providing the seeds, Dr. Maeli Melotto (University
of Texas at Arlington) for BAC gF 11, Dr. C. Eduardo Vallejos (University of Florida)
for the Bng clones, and the Laboratory of Gene Expression, Department of
Molecular Biology, University of Aarhus, for the Leg primers and sequences. A.F.
and T.R.B. dos Santos were supported by grants from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil. J.F. and K.G.B. dos Santos
were supported by grants from Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do
Estado de Pernambuco, Brazil. The work was partially supported by the Gregor
Mendel Institute of Molecular Plant Biology, Austria, and by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil. Development of BAC libraries
was funded by the US Department of Agriculture Cooperative State Research,
Education, and Extension Service National Research Initiative Plant Genome.
Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons
Attribution Noncommercial License which permits any noncommercial use,
distribution, and reproduction in any medium, provided the original author(s) and
source are credited.
Translate:
Diskusi
Pada artikel ini, kami menyajikan pemetaan dari delapan pasangan kromosom
kacang biasa yang tersisa menggunakan 20 klon yang memberikan urutan unik
dengan atau tanpa pemblokiran DNA, melengkapi pemetaan kromosom 3, 4, dan
7 sebelumnya (Pedrosa-Harand et al. 2009 ). Kami juga mengusulkan satu set
empat klon BAC yang dapat digunakan untuk mengenali semua kromosom
pelengkap BAT93, membantu pemetaan di masa depan. Ini adalah peta
sitogenetik ketiga dari suatu spesies legum, setelah L. japonicus (Pedrosa et al.
2002) dan Medicago truncatula (Kulikova et al. 2001), dan yang pertama untuk
legum tropis. Karena kedekatannya dengan spesies penting secara ekonomi
lainnya dari klade faseoloid seperti kedelai dan kacang tunggak (Gepts et al.
2005), ini akan berguna untuk studi sintenik lebih lanjut dalam grup, terutama
dengan mempertimbangkan sifat tetraploid kedelai (Shoemaker et al. 2006;
Schlueter dkk.2008).
Peta sitogenetik kacang umum yang disajikan di sini diintegrasikan ke dalam peta
keterkaitan inti spesies (Freyre et al. 1998) melalui BAC yang dipilih
menggunakan penanda dari peta Florida (Vallejos et al. 1992) dan peta yang baru
dikembangkan menggunakan tag jangkar komparatif lokus urutan (Hougaard et
al. 2008). Kecuali untuk kromosom 5, di mana hanya satu titik jangkar yang dapat
ditetapkan, Pemda ditetapkan dan diorientasikan sehubungan dengan kromosom
lengan pendek dan panjang, yang mengkonfirmasikan orientasi LG dan
kromosom yang baru-baru ini diusulkan (Pedrosa-Harand et al. 2008). LG I
(Vallejos et al. 1992) terkait dengan lengan pendek dan bagian dari lengan
panjang kromosom 10 hanya karena BAC yang sesuai dengan penanda terminal
Bng200 dipetakan ke tengah lengan panjang. Meskipun lengan panjang memiliki
cluster rDNA 45S terminal yang besar, posisi klon yang dipetakan ke kromosom
ini menunjukkan bahwa LG I tidak memiliki cakupan yang baik. Memang, lebih
banyak penanda terminal dipetakan ke LG 10 yang sesuai (Hougaard et al. 2008),
termasuk lokus rDNA (Freyre et al. 1998) dan penanda RAPD PROD15680 (Geffroy
et al. 2000), di sekitarnya bakteriofag SJ19.12 dipetakan. LG G dan K, sebaliknya,
tampaknya hanya sesuai dengan lengan panjang kromosom 6 dan 9. Dalam
kedua kasus, lengan pendek tampaknya sebagian besar terdiri dari 45S rDNA.
Lokus 45S rDNA pada kromosom 6 telah diamati pada semua aksesi P. vulgaris
yang diselidiki sejauh ini (Moscone et al. 1999; Pedrosa et al. 2003; Pedrosa-
Harand et al. 2006). Variasi ukuran cluster ini dikorelasikan dengan ukuran lengan
dan kromosom. Memang, meskipun kromosom 6 adalah akrosentrik dan
merupakan kromosom terkecil di 'BAT93,' itu adalah metasentrik dan terbesar di
'Saxa' (Moscone et al. 1999; hasil saat ini). Kromosom 9 juga tampaknya
membawa lokus rDNA yang dikonservasi (Pedrosa-Harand et al. 2006), tetapi
morfologinya belum ditetapkan dengan benar sebelumnya. Awalnya dianggap
metasentrik (Moscone et al. 1999; Pedrosa et al. 2003), tetapi sentromernya
mungkin salah diidentifikasi karena kurangnya penyempitan primer yang
mencolok. Adanya sekuens berulang pericentromeric yang berdekatan dengan
cluster rDNA terminal dan pengamatan sesekali setelah FISH dari pewarnaan
DAPI titik-titik positif di wilayah yang sama menunjukkan bahwa kromosom ini
adalah submetasentrik di 'BAT93' dan mungkin di semua aksesi spesies.
Urutan penanda di LG sepenuhnya sesuai dengan urutan BAC yang sesuai di
sepanjang kromosom. Untuk kromosom 1, dua klon BAC 38C24 dan 257L12,
masing-masing sesuai dengan Bng171 dan Bng173, terkolokalisasi pada
kromosom mitosis, tetapi dapat dipesan setelah pemetaan pada kromosom
pakiten. BAC 257L12 dipetakan lebih terminal dari 38C24, sesuai dengan posisi
terminal lebih dari Bng173 relatif terhadap Bng171 di LG. BAC ini berdekatan satu
sama lain dalam kromosom pachytene, mengkonfirmasikan kedekatan fisik
mereka dan menjelaskan kesulitan dalam memesan penanda ini dengan
keyakinan tinggi pada peta genetik (Vallejos et al. 1992). Peta kromosom 11
mengkonfirmasi penekanan rekombinasi di daerah kromosom pericentromeric
yang telah diamati sebelumnya (Pedrosa-Harand et al. 2009): kurang dari
seperempat panjang LG berhubungan dengan lebih dari setengah ukuran
kromosom. Pemetaan heterokromatin sepanjang kromosom menunjukkan bahwa
penekanan rekombinasi berkorelasi dengan adanya blok heterokromatik
perikentromerik yang menonjol (lihat Gambar. 5).
Heterokromatin perikentromerik ditentukan oleh pola distribusi berulang BAC
12M3, yang memberikan sinyal perikentromerik, dan kolokalisasi daerah ini
dengan pita CMA + cerah setelah pewarnaan CMA / DAPI (lihat juga Zheng et al.
1993). Klon BAC yang dipetakan lebih proksimal pada lengan panjang kromosom
11, BAC 25D1, dan dua BAC lainnya (36H21 dan 173P6) dipetakan menjadi
heterokromatin perikentromerik dan membutuhkan penambahan DNA
pemblokiran C0t - 100 untuk memberikan sinyal salinan tunggal. Namun,
pemblokiran juga diperlukan untuk beberapa BAC yang dipetakan ke eukromatin.
Terjadinya banyak BAC yang mengandung urutan berulang, meskipun semua
telah dipilih dengan penanda salinan tunggal, menunjukkan bahwa urutan unik
sering diselingi dengan urutan berulang, menegaskan sifat yang kurang terkotak
dari genom kacang umum (Pedrosa-Harand et al. 2009) . Sesuai sepenuhnya
dengan hipotesis ini, sekuensing cluster gen resistensi B4 di BAT93,
dikombinasikan dengan eksperimen FISH, mengungkapkan bahwa gen salinan
rendah diselingi dengan urutan berulang (Geffroy et al. 2009; David et al. 2010).
Proporsi yang tinggi dari urutan berulang yang bercampur dengan urutan salinan
tunggal dalam eukromatin dan heterokromatin bukan satu-satunya fitur menonjol
dari genom kacang umum yang relatif kecil (sekitar 600 Mb; Arumuganathan dan
Earle 1991). Separuh (48%) dari genomnya diperkirakan heterokromatik
berdasarkan proporsi rDNA (5% dari genom), blok subtelomerik (9%), dan blok
pericentromeric (34%) pada kromosom mitosis. Nilai ini mungkin diremehkan
karena daerah heterokromatik regional kecil tidak dapat dideteksi oleh prosedur
sitologi yang digunakan (Houben et al. 2003), tetapi berkorelasi baik dengan
perkiraan proporsi.
urutan berulang (49,3%; Schlueter et al. 2008) dan proporsi DNA yang dimetilasi
(60%), diperoleh dengan filtrasi metil dari DNA kacang biasa (BAT93) (P. Gepts,
data tidak dipublikasikan). Namun, ini lebih besar dari perkiraan sebelumnya
untuk kandungan heterokromatin spesies (sekitar 10% dan 21%), yang
didasarkan pada pita DAPI + sentromerik setelah FISH (Moscone et al. 1999) dan
C-band (Zheng et al. 1991), masing-masing. Ini juga dianggap tinggi jika
dibandingkan dengan perkiraan untuk spesies lain berdasarkan pengukuran
heterokromatin yang ditunjukkan oleh pita C atau pewarnaan CMA / DAPI (lihat,
misalnya, Guerra 1993). Lebih lanjut, hal ini mirip dengan perkiraan kandungan
heterokromatin dari sorgum, yang memiliki genom yang lebih besar (818 Mb; Kim
et al. 2005a), meskipun lebih kecil dari perkiraan berdasarkan daerah kental
pachytene dari M. truncatula (60% dari 560–580 Mb; Kulikova et al.2004).
Menariknya, heterokromatin pericentromeric dari spesies dapat dengan jelas
dibagi menjadi dua domain yang berbeda: daerah pericentromeric, sesuai dengan
distribusi BAC 12M3, CMA + band, mungkin daerah pachytene sangat kental
(Pedrosa-Harand, data tidak dipublikasikan), dan C-band dijelaskan dalam
publikasi sebelumnya (Zheng et al. 1991; Moscone et al. 1999), dan daerah
sentromerik, diungkapkan oleh DAPI setelah beberapa percobaan FISH dan
hanya bersesuaian dengan sekitar 12% dari panjang kromosom. Tak satu pun
dari BAC hibridisasi yang dipilih dengan penanda yang dipetakan secara genetis
menunjukkan distribusi “sentromerik”, mungkin karena kurangnya sekuens
tunggal salinan yang tersebar di domain ini. Kami berhipotesis bahwa daerah
sentromerik mungkin terdiri terutama dari urutan berulang secara tandem,
sedangkan daerah pericentromeric di sekitar sentromer terdiri dari urutan
repetitif tersebar yang diselingi dengan urutan salinan tunggal, yang mengarah
ke stainabilitas yang berbeda setelah prosedur pita yang berbeda dari dua
domain heterokromatik ini. Mendukung hipotesis ini, subklon dan sekuensing
BAC pericentromeric mengidentifikasi sekuens mirip retroelement dalam
sisipannya (K.G.B. dos Santos et al., Manuskrip dalam persiapan). Perbedaan
mencolok ini, bagaimanapun, tidak jelas dalam struktur sentromer spesies
tanaman lain yang dipelajari sejauh ini, seperti Arabidopsis, padi, dan jagung,
karena sentromer spesies ini terdiri dari pengulangan satelit yang bercampur,
retrotransposon khusus sentromer, dan gen (Nagaki et al.2004; Ma et al.2007; Yan
dan Jiang 2007; Gill et al.2008). Oleh karena itu, ada kemungkinan bahwa
proporsi jenis urutan yang berbeda ini, daripada ada atau tidaknya, yang
menentukan domain kromatin yang berbeda ini.

Perlu dicatat bahwa pita yang diperoleh dengan DAPI setelah prosedur FISH
berbeda dari pita CMA + yang, karena ekstensi mereka, mungkin sesuai dengan
pita C yang dilaporkan sebelumnya (Zheng et al. 1991, 1993; Moscone et al.
1999 ). Pita DAPI-setelah-IKAN telah dianggap sebagian besar setara dengan pita-
C pada kacang biasa dan spesies lain (Moscone et al. 1996, 1999; Barros e Silva
dan Guerra 2009), tetapi kami menunjukkan bahwa pita tersebut hanya sesuai
dengan sebagian kecil dari heterokromatin pericentromeric di kacang biasa.
Akibatnya, perkiraan konten heterokromatin hanya berdasarkan pita DAPI-after-
FISH harus dipertimbangkan dengan hati-hati. Kombinasi pendekatan yang
berbeda lebih mungkin untuk mengungkapkan heterokromatin suatu spesies
dalam totalitas dan kompleksitasnya.
Kami menunjukkan bahwa genom kacang umum terdiri dari 52% eukromatin yang
diperkaya dengan urutan salinan tunggal diselingi dengan pengulangan
terdispersi, 31% heterokromatin pericentromeric (22%, tidak termasuk 12% dari
heterokromatin sentromerik) dan subtelomerik (9%) heterochromatin diperkaya
dengan tersebar dan pengulangan tandem diselingi dengan sekuens yang
dipetakan secara genetika salinan tunggal, dan 17% rDNA (5%) dan
heterokromatin sentromerik (12%) terdiri dari pengulangan yang mungkin
terorganisir secara tandem dan sebagian besar tanpa gen dengan jumlah salinan
rendah. Pengaturan tandem pengulangan dalam heterokromatin subtelomerik
kacang umum telah dibuktikan (David et al. 2009). Organisasi ini memiliki
implikasi untuk strategi yang ditentukan untuk mengurutkan genom kacang
umum. Dalam praktiknya, hanya fraksi yang relatif kecil terakhir (17%) yang dapat
disisihkan selama upaya pengurutan genom, mengingat sebagian besar
heterokromatin juga mengandung gen yang harus diurutkan. Oleh karena itu,
pendekatan genom utuh, seperti strategi pengurutan senapan seluruh genom
yang dipilih (Scott Jackson, komunikasi pribadi), lebih tepat. Kami juga harus
mengantisipasi kesulitan menangani proporsi tinggi urutan berulang dalam
genom kacang umum (Schlueter et al. 2008) dan mungkin kebutuhan untuk
pemetaan BAC FISH lebih lanjut untuk memesan contig atau memperkirakan
celah, seperti yang dilakukan pada tomat (Peters et al. al. 2009). Lebih lanjut,
organisasi ini menyarankan bahwa heterokromatin harus dianggap sebagai
domain kromosom heterogen (lihat Chang et al. 2008) bahkan dalam spesies
dengan genom kecil.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Alba Torres (CIAT) yang telah menyediakan benih,
Dr. Maeli Melotto (Universitas Texas di Arlington) untuk BAC gF11, Dr. C. Eduardo
Vallejos (Universitas Florida) untuk klon Bng, dan Laboratorium Ekspresi Gen,
Departemen Biologi Molekuler, Universitas Aarhus, untuk primer dan urutan Kaki.
A.F. dan T.R.B. dos Santos didukung oleh dana dari Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil. J.F. dan K.G.B. dos Santos
didukung oleh hibah dari Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado
de Pernambuco, Brasil. Pekerjaan ini sebagian didukung oleh Institut Biologi
Tanaman Molekuler Gregor Mendel, Austria, dan oleh Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil. Pengembangan perpustakaan
BAC didanai oleh Departemen Riset, Pendidikan, dan Penyuluhan, National
Research Initiative Plant Genome, Departemen Pertanian AS.
Akses Terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi
Nonkomersial Atribusi Creative Commons yang mengizinkan penggunaan,
distribusi, dan reproduksi nonkomersial apa pun dalam media apa pun, dengan
mencantumkan nama penulis dan sumber aslinya.

Abbreviations

BAC Bacterial artificial chromosome

CMA Chromomycin A3

DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole

FISH Fluorescent in situ hybridization

FITC Fluorescein isothiocyanate

LG Linkage group

RAPD Random amplification of polymorphic DNA

rDNA Ribosomal DNA

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSC Saline–sodium citrate