\ Biochimie —Lucréri practice medicind, vol. IT a CAPITOLUL IV ENZIME Enzimele sunt biocatalizatori sau fermenti de naturi organick sintetizate de microorganisme si organisme vegetale sau animale. Prin natura lor chimic& suat proteine, prezente in toate celulele esuturilor si organelor. Enzimele conditioncaz& desfsurarea, coordonarea si autoreglarea reactiilor specifice materiei vii, prin care se realizeaza procesele metabolice ale cresterii, reproducerii gi ale tuturor activitifilor celulare. Caracterele generale ale enzimelor sunt urmatoarele: « ccfioneaz’ in cantit8fi extrem de mici, cea ce atest faptul ca au activitate catalitic& mare (transformé cantitati foarte mari de substrat); ‘* nu se consumt nu modifica echilibrul de reactie ci doar viteza de reactie; © au acfiune reversibila 1 su specificitate de reacfie side substrat. Enzimele acfioneazA att in interiorul organismului, c&t si in extrase, fn afara organismului, cea ce permite dozarea lor in laborator. Acfiunea enzimelor asupra tuturor activitatilor celulare face posibil ca 0 reactie, incompatibilé din punct de vedere termic cu viata (necesiti temperaturi foarte inalte), si aiba totusi loc, lao temperaturé mult mai mie’. jn functic de reactia cataliticd a enzimei gi de substratul asupra ciruia actioneazi, cnrimele se clasificd in gase grupuri: oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, izomeraze, liaze si ligaze. ‘Activitatea enzimatic’ este influenjati de mai multi factori, printre care: « temperatura; + pH-ul; * electrolitii; + concentrafia substratului, + concentrafia enzimei; «+ substanjele activatoare san inhibitoare din mediu. 290Biochimie - Lucrari practice medicind, vol.IT —————_______Biachimie - Lueratri practice medicina, vol.IT Dozarea enzimelor se bazeazi pe determinarea activitatii lor, adic& De capacitatea lor de a cataliza o reactie data ise realizeaza in doua moduri: * masurarea metabolicatii substratului fn unitate de timp; * misurarea concentratici substratului inainte si dup actiunea enzimei. Activitatea enzimatica se exprima in unitiyi enzimatice raportate la | mil (Umm), © unitate de activitate enzimatic’ reprezint& cantitatea de enzima care modifica 1 mol de substrat intr-un minut si tn condifii stabilite (standard). Pentru a putea interpreta corect semnificatia diggnosticd a enzimelor plasmatice trebuic avut in vedere locul lor de sintez si mecanismul lor de secrejie. Dozarea si interprotarea activitatii euzimelor serice sau plasmatice Constituie 0 metodologie curenté in medicina cu o deosebita valoare si semnificatie clinica. Determinarea activitafii enzimatice permite un diagnostic pozitiy si diferential corect, aprecierea evolutiei unor boli, aprecierea eficacitafii unor terapii aplicate, identificarea unor defecte genetice, etc, Evaluarea cantitaliva a unor enzime din serul sanguin prezinta o important deosebits in cazul afectiunilor hepatice, pancreatice, prostatice, cardiace, in anemii, leucoze, tumori, traumatisme musculare, etc., aducnd informafii despre organul sau fesutul lezat si in acelasi timp despre importanta si intinderea leziunii, Pentru determindrile enzimatice se folseste in special serul sanguin deoarece anticoagulatii inhib actiunea multor enzime. IV.1 Influenta temperaturii asupra activitifii enzimatice Actiunea temperaturii asupra reactillor enzimatice este dubl&: modifica viteza reactiei enzimatice sau denatureazi enzima, respectiv apoenzima care este de naturs proteicd. Temperatura optima este de 437°C. deoarece 1a aceasta temperatur’ distrugerea enzimei este practic nula. iat viteza reactici este suficient de mare. Marind temperatura peste accasié Yaloare, se inregistreaza 0 diminuare progresivi a vitezei de reactie pnd la snularea sa, Acest fapt se explicd prin denaturarea termic8 a enzimei i se produce la o anumitt temperatura, proprie fiecirei enzime care se numeste temperatura de inactivare. 40XY Biochimie —Lueriri practice medicind, vol. I a een teers preence mC Enzimele sunt termolabile, adic incdlzite peste o anumitd temperatura isi pierd ireversibil activitatea, Principiul metodei Amilaza salivara este activa la +37°C, dar prin fierbere se inactiveaza si nu mai are actiune hidrolitica asupra amidonului. Materiale necesare eprubete stativ pentru eprubete Pipete de sticli termostat baie de apa vase cu solurie dezinfectanta apa distilata tifon reactivi Reaetivi Solutie amidon 1% in NaCl 0,3% Reactiv Febling I: CuSO, 35g HSOs Sm. ‘pa distilata 1000 ml Reactiv Fehling It: NaOH 30% 300 mi tartrat dublu de sodiu si potasiu 150g api distilat. ad 1000 ml in momentul utilizarii se amesteca parti egale de reactiv Febling I si Fehling 11, Proba Saliva diluata cu apa distilata (pentru micsorarea viscozitaii salivei) ‘Tebnica de ucru ‘In doud eprubete se pipeteazi cate 4 ml de solutie de amidon 1% in NaCl0,3%. Intr-o eprubeta se adaugi 1 ml de saliva proaspata, nefiarta, iar in a doua eprubeti 1 ml de saliva diluata fata. 41’ ! a Biochimie - Lucrdiri practice mediciné, vol.I Se agit eprubetele si se introduc in termostat la +37°C timp de 15 minute. Se adaugit in ficcare eprubeti cite 1 ml de reactiv Febling si se fier pe baie de api timp de 5 minute. Interpretarea rezultatelor {n eprubeta cu saliva nefiarté, enzima activa descompune amidonul la maltoza, care reduce reactivul Fehling la oxid cupros de culoare rogu caramiziu. in eprubeta cu saliva fiarta, in care amilaza din saliva a fost distrusé prin fierbere, amidonul nefiind hidrolizat la maltoza. aceasta nu reduce reactivul Fehling, iar confinutul din eprubeté rémane albastru. IV.2 Influenta pH-Ini asupra activitafii enzimatice Viteza reactiilor enzimatice este influenfata in mare misurd de pH- ul mediului in care actioneaza enzima, fapt explicat de natura proteicd a cnzimelor. Modificarile de activitate a enzimeior sub influenja pH-ului mediului sunt datorate modificdrii stabilititii si a gradului de ionizare ale enzimelor, substraturilor corespunzitoare sau complexelor enzima ~ substrat. Sensibilitatea fat de pH a enzimelor se manifest& in legaturd cu viteza de producere a reactiei pe care catalizeazi gi in legdturd cu stabilitatea lor. Reactia are 0 vitezA maxim pentru o anumit valoare a pH-ului denumit pH optim, iar abaterile de la aceasta valoare produc o scidere brusca a vilezei de reactie. Stabilitatea enzimelor este afectat de aciditatea sau alcalinitatea mediului, o enzims fiind stabila numai intre anumite limite de pH in cadrul e&rora se poate vorbi de un pH optim de stabilitate, Prineipiul metodei Amilaza salivard are activitate maxima la un pH specific, care se poate pune in evidenta prin hidroliza amidonului intr-o gam& de pH uri realizate de sisteme tampon, 42y= Biochimie ~Lucrari practice medicind, vol. It Materiale necesare eprubete statiy pentru eprubete pipete de stil fermostat baie de apa vase cu solufie dezinfectant apa distilata tifon reactivi Reactivi Solujii tampon fosfat cu pH-ur: 5 Solutie amidon 1% tn NaCl 0,3% Solutie Lugo! (iod in iodurd de potasiu) 65 7,0; 7,7; 8.0 Proba Saliva dilnata cu apa distilara (pentru micsorarea vasco7itati salivei) Tehnica de lucru in 6 eprubete se pipeteaz cfte 1 ml de solutie tampon cu pH-uti cuprinse tntre 5,8 si 8; se noteaza pHT-ul fiectrei eprubete. Se adauga in ficcare eprubeta cate 1 ml solufic de amidon 1% si cite 1 ml de saliva diluata si se mengin timp de 30 de minute la temperatura de + 37°C in termostat. ‘Dupa récire se adaugi in fiecare eprubeti cate o picatura de solutie Lago Se agita si se urmareste coloratia aparuta in fiecare eprubeta. Interpretarea rezultatelor pH-ul optim al activitétii amilazei salivare se gaseste tn eprubeta colorata in galben rogcat, deoarece in aceasta hidroliza amidonului a avut loc pfind la maltoza si maltodextrine. Eprubetele colorate in albastru indicd prezenfa_amidonului nehidrolizat, iar cele colorate in violet $i brun dovedese o hidroli2& partialA panda la stadiul de dextrine_ 4a