- DNA

Tách triết VLDT

- mRNA
- Plasmid
- Restriction Enzyme
Enzyme
- Others Enzyme (nuclease, ligase,
polymerase, …)
- Phage
Vector Tách dòng
- Cosmid
- YAC (Yeast Artificial Chromosomes)
- Virus
- Plasmid
- Phagemid
- BAC (Bacteria Artificial Chromosomes)
- Ti – Plasmid

Vector Biểu Hiện + promoter mạnh vs yếu

Host cell - Virus

- Yeast
- Bacteria  E.coli
Gene Cloning (4 bước)
- Tạo vector tái tổ hợp
- Nuôi cấy kiểm tra (kiểm tra 3 cách)
- Chuẩn bị gene
- Kĩ thuật biến nạp
- Nested PCR
PCR
- Reverse PCR
- Inverse PCR
- Standard PCR
Điện di so sánh
- PolyAcrylamide
- Agarose
- Maxam Gillbert
Giải trình tự gene
- Sanger

Phương pháp lai so sánh - Northern Blotting

- Southern Blotting
 - Western Blottin
Ứng dụng - Nông nghiệp
- Y học
-Xã hội học

VECTOR TÁCH DÒNG (Cloing vector)

1. Khái niệm
- Là DNA có kích thước nhỏ
- Cho phép cài các đoạn DNA cần thiết
- Có thể tái bản không phụ thuộc và không ảnh hưởng đến bộ gen của vật chủ
2. Đặc điểm
- Có nhiều điểm cắt đặc hiệu
- Mang gen tín hiệu (chỉ thị màu, chỉ thị kháng sinh)
3. Các loại vector tách dòng
Plasmid
Phage: Vector được cải biến từ bộ gen phage
Phagemid: gen của plasmid và phage
Cosmid: plasmid và đoạn cos của phage
NTS nhân tạo
Ti plasmid

VECTOR BIỂU HIỆN (Expression vector)

1. Khái niệm
- Là vector tách dòng mang promoter mạnh
- Chp phép biểu hiện cả gen chỉ thị và gen tách dòng
- Gồm: Promoter mạnh, trình tự sao chép ori, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của
riboxom, tín hiệu để kết thúc dịch mã, trình tự đa cắt nối MCS, gen chỉ thị…

CÁC KỸ THUẬT PCR

 Nguyên lý chung
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
 - Biến tính: 90 – 95 độ C, 1 – 2 phút, làm đứt các liên kết củ DNA, tách làm 2 sợi
- Gắn mồi: 55 – 65 độ C, 30 – 60 giây, Mồi bắt cặp vưới các mạch đơn
- Tổng hợp: 70 – 72 độ C, E DNA polymerase gắn thêm nu vào các đonạ mồi, mồi được
kéo dài tạo thành DNA mạch đơn mới, sản phẩm của chu kỳ trước là mồi cho chu kỳ sau
Nguyên liệu:
- DNA khuôn
- Nu tự do dNTP
- Mồi Primer xuôi, ngược
- Enzyme DNA Polymerase
- Đệm
- Thiết bị
1. Standard PCR
Kỹ thuật PCR chuẩn được thực hiện khi biêt rõ các trình tự đặc hiệu ở 2 đầu đoạn DNA cần
nhân để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu ở 1 đầu đonạ khuon, chỉ có thể thiết kế được một
đoạn mồi.
2. PCR ngược
Là kỹ thuật PCR cải tiến để nhân các gen từ mạch khuôn là mRNA và RNA
2 giai đoạn:
- Phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA tạo đoạn cDNA: sử dụng E phiên mã ngược tạo
đoạn cDNA mạch kép, tương ứng vs các đoạn khuôn là mRNA và RNA
- Khuếch đại đoạn DNA: dùng PCR chuẩn để nhân đoạn cDNA
3. Nested PCR
- 2 lần PCR chuẩn kế tiếp nhau
- Trong lần PCR thứ 2, dùng cặp mồi thứ 2 và dùng kết quả PCR của lần 1 làm khuôn
4. PCR đảo
- Nhân đoạn DNA chưa biết trên phân tử DNA, nằm trước hoặc sau một đoạn DNA đã biết
một trình tự
- Thiết kế cắp mồi đặc hiệu từ đoạn trình tự đã biết: dùng E giới hạn cắt ở giữa đonạ đã
biết rồi dùng A DNA Ligase nối đảo 2 đầu tạo đoạn DNA đã biết ở 2 đầu đoạn chưa biết,
từ đó thiết kế cặp mồi
- Chạy PCR chuẩn
5. PCR dạng neo
- Nhân đoạn gen đích khi biết 1 trình tự nhỏ ở 1 đầu DNA, vì quá nhỏ nên PCR đảo kém
hiệu quả
- Người ta dùng đoạn neo (Anchored DNA) gắn vào đầu chưa biết của DNA khuôn nhờ các
adaptor đặc hiệu và E nối
- Từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu và làm PCR chuẩn
6. PCR phức
 - Dùng nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA khác nhau trên một
phân tử DNA
- Dùng để nhân các exon của gen, phát hiện sớm tôm, cá bị bệnh do virus, vi khuẩn
7. PCR tại chỗ in situ PCR
 Nhân gen, đoạn DNA ngay trên tế bào, không cần tách chiết hay tinh sạch
Các bước:
 Cố định tế bào và mô của các mẫu nghiên cứu trên lam kính
 Xử lý E Lysozym phá thành tb, xử lý E proteinase để hủy protein
 Bổ sung các TP cần thiết của pu PCR
 Đặt lam kính vào thiết bị và chạy
 Ktra dưới kính huỳnh quang
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
1. Nguyên lý chung
 DNA là đại phân tử sinh học mang điện âm, do đó trong điện trường nó sẽ di chuyển về
phái cực dương vs tốc độ khác nhau tùy theo kích thước
 Có nhiều loại bản gel khác nhau
2. Điện di Agarose
 Gel Agarose là một chuỗi polymer mạch thẳng
 Sử dụng gel Agarose 0.3% - 2,0% tùy theo kích thước DNA
3. Điện di Polyacrylamid
 Gel Polyacrylamid được tạo ra từ QT polymer hóa acrylamide (liên kết chéo)
 Điện di trên gel Polyacrylamid – SDS – PAGE
 Dùng để xác định số lượng và kích thước chuỗi protein hoặc các chuỗi tiểu đơn vị
protein trong phân tách protein
 Thành phần: Thiol hòa tan cắt leien kết disulfide và SDS phá vỡ lk kp CHT rồi liên kết vs
tất cả protein, tháo cuộn làm biến tính protein => toàn bộ protein bị biến tính và chuoix
polypeptide tích điện âm. Một số thành phần khác: Glyxerol, chất nhuộm, đệm…
 Nguyên tắc:
+ gồm 2 hệ gel: Gel cô và gel tách
4. So sánh
 Giống:
 Đều là điện di tren gel
 Thích hợp với các mẫu lớn
 Kích thước lỗ có thể điều chỉnh bởi nồng độ
 Khác:

Agarose Polyacrylamide
 Điện di ngang  Điện di dọc
 Dùng gel agarrose  Dùng gel polyacrylamide
  Chỉ có 1 hệ gel  Có 2 hệ gel
 Không cần làm biến tính  Có bước làm biến tính

CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Khi DNA mạch đôi bị đun đến nhiệt độ lớn hơn Tm thì nó sẽ tách thành 2 sợi đơn do các lk
hydro bị phá vỡ. Tuy nhiên khi giảm nhiệt từ từ và ở trong dk thích hợp thì chúng sẽ bắt cặp trở
lại.
1. Kỹ thuật lai Southern blotting
 Nguyên lý:
Là lai giữa các đoạn DNA mạch đơn của các đoạn cần nghiên cứu với các mẫu dò được đánh
dấu phóng xạ (oligo nucleotide đã biết trình tự) nhằm ktra sự có mặt của các trình tự đích.
Các đoạn DNA được biến tính tách dời các mạch đơn và được chyển lên màng lai. Bằng phản
ứng lai hóa các đoạn mạch đơn trên màng lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ để ktra các trình
tự cần thiết bằng phóng xạ tự ghi.
 Các bước:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu:
- DNA: tách chiết, xử lý bằng E cắt -> Đoạn nhỏ
- Điện di agarose
- Biến tính trên bản gel
Bước 2: Thấm truyền:
- Đặt bản gel vào hộp blotting, đặt màng lai lên trên và thêm lớp giấy thấm Whatman.
Trên cùng đặt vật nặng 0.5 – 1kg để tx tốt hơn
- Để từ 8 – 12h
Bước 3: Lai phân tử
- Dịch lai: 0,2 – 0,4cm
- Mẫu dò đặc hiệu đánh dấu phóng xạ
- Màng lai
Để 3 – 8h trong nhiệt độ 65 độ C, thêm dịch lai để 65 độ C, lắc nhẹ
Rửa màng lai ở 65 độ C bằng SSC
Thấm khô hoặc sấy màng lai
Bước 4: Xác định kết quả
2. Kỹ thuật lai Northern Blotting
 - Nhằm phát hiện các trình tự nhất định của phẩn tử RNA, bằng cách lai RNA vs mẫu dò
DNA, tạo phân tử RNA-DNA.
- Nguyên tắc: Giống Southern Blotting
3. Kỹ thuật lai Western Blotting
- Là kỹ thuật lai protein với kháng thể đặc hiệu, sử dụng trong nghiên cứu protein và
enzyme
 Cách làm
- Chọn mẫu và tách chiết protein
- Điện di polyacrylamide
- Thấm truyền để chuyển lên màng lai
- Lai protein vs protein kháng thể đặc hiệu
- Hiện hình, nhuộm màu và kiểm tra
4. Kỹ thuật lai tại chỗ
5. So sánh

Southern blotting Northern Blotting Western Blotting

- Đều là kỹ thuật lai phân tử
- Các bước thực hiện tương đồng nhau
- Lai DNA, sản phẩm là - Lai RNA-DNA - Lai protein với kháng
DNA-DNA thể đặc hiệu

1. Vector tách dòng? Nêu các yêu cầu đối với Vector tách dòng. Sự khác nhau giữa vector
tách dòng và vector biểu hiện?
2. Đặc điểm của Enzyme nucleotide và polymerase
3. Nguyên tắc chung của biểu hiện gen. Nếu biểu hiện gen không thành công hay nêu
những nguyên nhân có thể xảy ra?
4. Nguyên tắc chung của điện di. So sánh điện di agarose và polyacrylamide (phạm vi, ứng
dụng, các bước tiến hành)
5. So sánh phương pháp lai
6. Nêu phương pháp chọn gen quan tâm. Các bước tách dòng gen?

Câu 1:
- Vector tách dòng là những phân tử DNA có kích thước nhỏ, cho phép cài các đoạn DNA
cần thiết, có thẻ tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia tế bào, tồn tại trong vật chủ
qua nhiều thế hệ mà không làm biến đổi bộ gen
- Đặc điểm: VTTD phải có nhiều điểm cắt đặc hiệu duy nhất cho các loại E gh khác nhau và
phải mang gen tín hiệu
 - Nguyên tắc chọn:
+ dựa vào kích thước, BC đoạn DNA cần tách để chọn vector
+ sự tương đồng giữa các vị trí cắt đặc hiệu: đoạn cài DNA và vector tách dòng phải có các vị trí
cắt đặc hiệu của cùng một loại E gh
+ vector tách dòng phải thích hợp với tế bào chủ, có kn tái bản với số lượng bản sao lớn nhưng
không làm thay đổi bộ gen của tb chủ
+ gen chỉ thị dễ nhận biết
+ phải có hiệu quả tách dòng cao, tỉ lệ tạo vector tái tổ hợp cao
- So sánh
+ giống: đều mang gen, đều là vector tách dòng, có gen chỉ thị, có điểm cắt đặc hiệu của E gh,
có trình tự nhân lên ori (kn sinh sản, tái bản)
+ khác: vector tách dòng k có vùng promoter (điểm khởi đầu phiên mã), không có vị trí cắt
ribosome (vùng dịch mã), kích thước rất nhỏ (để chui vào TB trong quá trình biến nạp), DNA cài
có kích thước nhỏ.
Câu 4:
Nguyên lý chung
Nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm sinh học của ptu mang điện tích (DNA, protein, enzyme…)
 DNA là đại phân tử sinh học mang điện âm, do đó trong điện trường nó sẽ di chuyển về
phái cực dương vs tốc độ khác nhau tùy theo kích thước
 Có nhiều loại bản gel khác nhau
Điện di Agarose
 Gel Agarose là một chuỗi polymer mạch thẳng
 Sử dụng gel Agarose 0.3% - 2,0% tùy theo kích thước DNA
 Bước tiến hành
 Ứng dụng
- Xác định kích thước DNA
- Nghiên cứu tương tác DNA-protein
- ứng dụng cho pp lai
- ứng dụng cho chiết mẫu
- phân tích protein kinase
- thường sd cho enzyme và DNA
Điện di Polyacrylamid
 Gel Polyacrylamid được tạo ra từ QT polymer hóa acrylamide (liên kết chéo)
  Điện di trên gel Polyacrylamid – SDS – PAGE
 Dùng để xác định số lượng và kích thước chuỗi protein hoặc các chuỗi tiểu đơn vị
protein trong phân tách protein
 Thành phần: Thiol hòa tan cắt lk disulfide và SDS phá vỡ lk kp CHT rồi liên kết vs tất cả
protein, tháo cuộn làm biến tính protein => toàn bộ protein bị biến tính và chuoix
polypeptide tích điện âm. Một số thành phần khác: Glyxerol, chất nhuộm, đệm…
 Nguyên tắc:
- gồm 2 hệ gel: Gel cô và gel tách
 ứng dụng
- xác định trong lượng ptu protein
- xác đinh trạnh thái oligo của pro
- nghiên cứu protein gấp cuộn và không cuộn
- NC tương tác pro-pro
- Sử dụng chủ yếu cho protein
 So sánh
 Giống:
 Đều là điện di tren gel
 Thích hợp với các mẫu lớn
 Kích thước lỗ có thể điều chỉnh bởi nồng độ
 Khác:
 Agarose: tách các đoạn DNA có kích thước 0,5 – 20 kb. Điện di ngang. Phân giải thay đổi
khi nồng độ thay đổi. bước làm đơn giản.
 Polyacrylamide: phân tách các đoạn DNA có kích thước < 1000 cặp base. Điện di đứng.
Đọ phân giải cao, ít thay đổi, có thể phân biệt được những đoạn chỉ cách nhau 1 nu.
Bước chuẩn bị phúc tạp.
Câu 6: Tách dòng gen
Bước 1: chuẩn bị gen cần tách dòng
Tách chiết DNA, RNA từ sinh vật mang nguồn gen tự nhiên hoặc nhân tạo (vi khuẩn).
Tinh sạch và chọn lọc để thu được gen cần tách dòng
PCR để nhân gen cần thiết lên đến số lượng lớn
Có thể tổng hợp nhân tạo DNA chèn trên cơ sở trình tự đã biết. PCR để nhân số lượng gen lên
Bước 2: tạo vector tái tổ hợp
Dựa vào đặc điểm gen tách dòng mà chọn vector tách dòng và các E gh phù hợp nhằm thực
hiện pu ghép nối giữa gen cần thiết với vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp.
Bước 3: biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ
Sử dụng biến nạp để đưa vectỏ tái tổ hợp vào tb chủ, tạo dk thích hợp để tb phát triển
Bước 4: sàng lọc các dòng tb mamg gen tái tổ hợp
Tách riêng dòng tái tổ hợp có hoạt tính
Bước 5: nuôi cấy tb tái tổ hợp thu sản phẩm
Câu 3: biểu hiện gen
Nguyên nhân biểu hiện không thành công
- Tế bào khả biến không nhận plasmid tái tổ hợp
- Tb nhận plasmid nhưng k có gen lạ
- Mtrg nuoi cấy tb khả biến chưa thích hợp
- Kích thước plasmid quá nhỏ có thể bị mất trong quá trình thực hiện
- Sai sót trong quá trình biến nạp làm hỏng vector tái tổ hợp (nhiệt độ quá cao, xung điện
quá mạnh…)
- Gen được tách chiết chưa tinh sạch
- Pcr bị lỗi dẫn đến số lượng gen quá ít, khó có thể biểu hiện gen
- Vector không thích hợp với DNA cài
- Vector biểu hiện có vùng promoter yếu