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  • GTC 78 Microbiologia de Alimentos PDF

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    ®@ ICONTEC GUIA TECNICA GTc COLOMBIANA 78 2002-08-28 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. * 2 GUIA PARA LA PREPARACION Y PRODUCCION DE MEDIOS DE CULTIVO. GUIA GENERAL PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA LA PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO PONDENCH esa guia es ura DT) por macueoi 31125-12000 fi zrimsi feseng sit guice! praparaton ant prdueton of micwoiciogs de rirosileg ca PROLOGO: El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Ceriffcaciin. ICONTEC. es el organismo nacional de normalzacién, segiin el Decreto 2268 de 1993. HICONTEC es una enfdad de carécter privado, sin animo de lucro, cuya Misién es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccién al consumider. Colabora cen el sector gubemamental y spoya al sector privado de! pais, para lograr ventajas competiivas en los ‘mercados intemno y extsmo, La representacién de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacién Técnica esta garantzada por los Comites Técnicos y el periodo de Consulta Publica, este ultimo caracterizado por la paticipacién del piblico en general La GTC 76, fue raticada por ef Consejo Directive el 2002-08-27 Esta noma esta sujeta a ser actualizeda permanentemente con el objeto de que respenda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. ‘A.continuacion se relacionan las empresas que colaboraron en ef estudio de esta norma a través de su participacién en el Comité Técnico 000031 de Microbiologia, ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. INSTITUTO COLOMBIANO. ALPINAS.A. AGROPECUARIO ASINAL LTDA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD ASOCIACION COLOMBIANA DE IVONNE BERNIER LABORATORIO MICROBIOLOGIA, LTDA. AVESCO LABORATORIO BIOCONTROL BAVARIA S.A. LESNIAK EU BIOCONTROL, LEVAPAN S.A. BIOQUILAB LTDA MERCADEO DE ALIMENTOS DE CENICANA COLOMBIA S.A. COMPANIA NACIONAL DE NULAB LTDA, CHOCOLATES S.A. PURIFICACION Y ANALISIS DE COOPERATIVA DE GANADEROS DE FLUIDOS LTDA. CARTAGENA LTDA, QUIOS LTDA. CREPES & WAFLES TRES MM, COLOMBIA S.A. FRIGORIFICO SUIZO S.A. UNIVERSIDAD JAVERIANA GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. INGENIO PROVIDENCIA S.A. Ademas de las anteriores, en Consulta Pablica el Proyecto se puso a consideracién de las siguientes empresas: ALGARRA S.A ASESORIAS MICROBIOLOGICAS AQUALAB AVESCO ALGARRA CONSULTORA BEATRIZ DEL PILAR AQUALAB MACIAS CARULLA VIVERO S.A ‘CASA LUKER S.A CERVECERIA LEONA COLOMBINA S.A. COMPARES NACIONAL DE LEVADURAS LEVAPAN CONGELAGRO CONSULTORIAS MICROBIOLOGICAS. DISA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO YY _ ALCANTARILLADO DE BOGOTA FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY FRESENIUS MEDIGAL CARE FRIGORIFICOS COLOMBIANOS S.A, FRIGORIFICOS SUIZO $.4, CONSULTOR NARDA PABON CONSULTOR MARIA CLEMENCIA HORA, CONSULTOR ANA MARIA MORALES. INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO PROVIDENCIA INGERIO RIOPAILA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS ANVIMA LABORATORIO PROCALIDAD LABORATORIOS GRAM ELOREDA GRASAS S.A. MINISTERIO DE SALUD NESTLE DE COLOMBIA S.A. PANARICO COLOMBIA MANANTIAL PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. PRODUCTORA DE JUGOS S.A QUALA S.A, QuIOs LTDA. RICA RONDO TECNIMICRO LABORATORIO DE ANALISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PUBLICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO VIKIEGOS $A, ICONTEC cuenta con un Centro de Informacion que pone a cisposicién de los interesados normas intemacionales, regionales y nacionales. DIRECCION DE NORMALIZACION GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 78 ROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. GUIA PARA LA PREPARACION Y PRODUCCION DE MEDIOS DE CULTIVO. GUIA GENERAL PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LA PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO. INTRODUCCION En ef laboratorio de microbiologia, muchos ensayos y procedimientos dependen de que los medios de cultivo sean homogéneos y produzcan resultados reproducitles. Los medies de cuttivo se usan con todas las técnicas de cultivo tradicionales y también en rmuchas icnicas altermas. En ef comercio se pueden obtener muchas férmulas de medios de cultive. y en a lteratura se deseriben muchas mas. disefiadas para fines de crecimiento especie. ademas, fen les latoratorios donde se hacen examenes microbioldgicos de alimentos, «| objetivo principal es mantener. resucitar. hacer crecsr, detectar y/o enumerer una gran variedad de mmicroarganismes. Los requisites dei mecio son especificos tanto para la muestra como para los organismos que se detectaran. Los medios de cutive que cumplan ciiterios esiabiecidos de ‘desempeiio son, por lo tanto, un requisito previe de cualquier trabzjo microbiolégice confieble. Es aconsejable hacer suficientes ensayes para demostrar ij {a aceptabilidad de cada lote del medio: y i) que el medic es “adecuade para el fin" y i que el medio pueda produci resuitedos consistentes. Estos tres efterias son parte esencial de los procedimientos de control interno de calidad y, con la documentacién adecvads, permitiran una vigiancia efeciiva del medio de cutive y ‘contibuiran a la produccién de datos tanto precises. OBJETO Esta guia properciona Ia terminologia general relacionads con el asequramiento de la calidad ‘en la preparacion de medios de cultive, y especifica los requisitos minimos para un andlisis, ‘microblotigico de productos destinsdos al consumo humano o de alimento para animales. Estos requiskos se aplican a tres categorias de medios de cultivo usados en los laboratorios donde se preparan o se usan medios de cullivo para analisis microbiolagicos: = medios fabricades comerciaimente y lstes para usar, - medio preparado a pair de férmulas deshidratadas disponibles comercialmente (bien sea un medio completo para recuento en place como por ejemplo ager Piste Count o un medio basal al cual se le agregan suplementos como por ejemplo agar BsircParker y GUIA TECNICA COLOMBIANA cic 78 + medic preparado por componentes individuales. 2. REFERENCIAS NORMATIVAS Ests guia incorpera, con referencias fechades 0 no fechadas, disposiciones provenientes de otras publicaciones. Tales referencies normativas se citan en los lugares adecuados del texto y Jas publicaciones aparecen a continuscion. En al caso de referencias fechadas. solamente se hardn correcciones 0 revisiones a esta guia cuando se comrjan o revisen dichas referencias. Para referencias no fechadas se apics la lima edicién de la publicacion de referencia. EN 1559:1996. In Vitfo Diagnostics Sisiems. Culture Media for Microbiology. Terms and Definitions. EN 12522:1999. In Vitro Diagnostics Medical Devices. Culture Media for Performance Criteria for Culture Media. robiology. 150 6402:1984. Quality Management and Qualify Assurance-Vocabulary 3. TERMINOLOGIA 34 GENERALIDADES Esta seccién contiene Iss definiciones generales relacionades con sseguramiento de Is calidad, si como diferentes grupos de ferminolagia relacionada con medios de cultive y cultivos de controt (cepas de referencia}. Las normas ciladas entre paréniesis indican que el texto es idéntico al citado. 3.2 TERMINOLOGIA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD. 3.24 ‘aseguramiento de la calidad todas las actividades, programadas y sisteméticas, implementadas como parte del sistema de calidad, as cuales demuestran segiin necesidades, la suficiente confisnza en que esa entidad ‘cumpliré los requisitos de calidad. Iso 8402] 3.244 parte de la gestién de la calidad orientada a propercionar confianza respecto al cumplimiento e los requisites de la calidad 3.2.2 control de calidad tBcnicas y actividades operativas que se usan para cumplir los requisites de calidad. iso 6402), 3.2.3 control interno de Ia calided programa continue del control del trabajo det laboratorlo, preparade por sl mismo y basado en ef andlisis y seguimiento det control y. si fuera necesario, acciones comectivas GUIA TECNICA COLOMBIANA etc7e 324 icte de medio de cuttivo Unidad de un medio susceptible de investigacién hasta sus origenes. relacionada con una antidad definida de producto en bruto, producto terminado o final. !2 cual tiene una clase y calidad homogénea y ha satisfecho los requisites de produccién (control del proceso) y las ‘ensayos de aseguramiento de la calidad, se ha producido dentro de un periodo de preduccisn definido y se le ha asignade el mismo ndmero, TEN 123221 3.2.5 desempefio del medio de cultivo la respuesta de un medio de cultivo a los organismos de ensayo. en condiciones deSnidas. 3.3. TERMINOLOGIA DEL MEDIO DE CULTIVO 334 medio de cultivo formula de sustancias, en forma liquida, semiséiida o sélida, formada por constitu naturales ylo sintéticos. disefiados para resist la multiplicacién o preservar la viabilidad de los microorganismos. NOTA Cuands este domino seuss an calaciés con calsbras compuesias, con Fecuens (gorsienple, rasioanrsuecid} [en 1659; 33.2 medio de cultivo clasificado por composicién 33.24 medio de cultivo definido quimicamente medio de culivo formado inicamente por consiituyentes definides quimicamente ‘por ejemplo. estructura molecular y grado de pureza conocicos} [EN 1859) 33.22 medio de cultivo quimicamente incompleto medio de cultive formado total o parciaimente per materisies naturales, procesados, 0 de otra forma, cuya compesicién qu'mica no esta totalmente detnida, earama idefnides que se user 1 los medics de cutee, Co sepecifca designacinas avaricas 3.3.3 clasificacién del medio de cultivo segin la consistencia 3.3.34 medio de cultive liquide medio de cuivo formado por una solucién acuosa con uno 0 varios constituyentes (por ejemplo, agua peptonada, caldo nultitivo}. GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC. 78 NOTA 1 En glpunes eases se agreges caniculas etldas al mado de cute ieee, NOTA2 Simatic lavido er tubes, fascos o toelas se concee. eeuentemente, cone" saids" [en 1859) 3.3.3.2 Medio de cutive sélide y semisslido medio de cultivo liquide, ef cual contien materiales solidiicantes (por ejemplo, agar-agar. gelatina, etc.} en diferentes concentraciones. Seman -aga 2278 NOTA 1 Debio al uae uncial ce maos de cultvo sola Scucos cor aganazat, con ta “ag como sindnimo te mazio ce extho $5°6e j, por fo tarte, en ssién coh BEINGS, reece 2 sce" IER 1859} 334 clasificacién segin su uso 3344 medio de transporte medio de cultvo diseftado para preservar y mantener Ia viabilidad de micreorganismos durante el periodo ene Ia toma dela muestra y su provesamiento en el laboratorio TEN 1659; NOTA. Ususiments ot ms ‘iroorganianos pare seazorer au svaunrvasin tper Sample, medio 32 C= de anspor cortane sustatsas quer permites f= mulésfzscién 2 Bar Amite 3342 medio de preservacién medio de cultivo desarrollado para la preservacién y el mantenimiento de micrccrganismos durante largos periodos de tiempo, que permite Is recuperacién después de este periodo (por ejemplo, medic de huevo Dorser. 3343 medio de resucitacién medio de cultico que permite 2 microorganismes estresados y lesionados repararse y recuperar su capacidad de erecimiente normal sin promover necesariamente su multipicacién. TEN 1858] 3344 ‘medio de enriquecimiento medio de cultivo predominantemente liquido, el cual debido a su compesicién. proporciona condiciones pariicularmente favorables para la muttiplicacién de los microorganismes. IEN 1859) GUIA TECNICA COLOMBIANA _GTC 78. 334.44 medio de enriquecimiento selectivo medio que promueve el crecimiento de microorganismos especifices, al tiempo que inhibe, total © parcialmente, el crecimiento de otros microorganisms (por ejemplo. medio Rappaport. Vassiliadis) 33.442 medio de enriquecimiento no selectivo mecio enriquecido. el cual promueve el crecimiento de la mayoria de los microorganismos (por ‘efemplo, caldo nutritive}, 33.4.5 medio de aisiamiento _medio de cultivo sétido 0 semnis6lido, ef cual promueve el crecimiento de microorganismos. 334.54 medio de sislamiento selective medio que promueve el crecimiento de microorganismos especifices, al tlempo que inhibe otros rmicroorganismos (por ejemplo, agar PALCAM. agar MacContey’, [EN 1859) 3.3.4.8.2 medio de alslamiento no selective medio que no esta disefiado para inhibir selectivamente microorganismas (por ejemplo, agar nusiivo. medio diferencial medio de culivo que permite el ensayo de una o varias caracteriticas ‘siclégicas © biequimicas de los microerganismos para su identiicacién (por ejemplo, medio de urea. agar Kigier) NOTA, Los qedos tleerse sue se puny usar cons mss 2s elemento, s8cenocen come mate oe 33.4.7 ‘medio de identificacién medio de cultivo disefiado para producir una reaccién especifica de identifeacién, que no requiere ningiin ensayo adicionat para confirmacién, janto se conoce come matic 4e sislamianss¢ sano [en 1859) 3.34.8 medio de miitiples usos medios de cuttivo a los cuales se les puede asignar disintas categor‘as: E].: el agar sangre es lun medio de resucitacién, de acuerde con ef numeral 3.3.4.3; un medio de aislamiento, de GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 78. zcuerde con el numeral 3.3.4.5: y un medic diferencial, de acuerdo con el numeral 3.3.4.6. el cual se usa pare detectar hemdlisis. 3.3.5 clasificacién del medio de cultivo segiin el método de preparacién 33.54 medio listo para usar medio de cultivo suminisirado en re otros recipientes\: ipientes listos para usar (por ejemplo, cajss Petri o tubos u + unmedio completo listo pare usar: = unmedio incompleto al cual se agregan componentes habsles al momento de usatio. 3.3.5.2 medio de cultive preparado con térmulas comerciales deshidratadas medio de oultivo seco que no esté listo para usar inmediatamente (por ajemplo, en polvo, granulado, productos lioflizados). La rehidratacién dard una de dos clases de medio. Meio completo listo para usar; = Medio incompleto af cual se agregan componentes habiles al momento de usarlo, 3353 medio de cultive preparado en el laboratorio con components individuales 3.4 TERMINOLOGIA PARA LOS ORGANISMOS DE ENSAYO 344 generalidades 5e tralia de microorganismos ullizedos, generalments, para control de calidad y ensayo del comportamiento del medio de culo. Se definen de acuerde con su fuente. as! 3.4.2 cepa de referencia microorganisme definido, per lo menos. en cuanto 2 géneroy especie. catalogade y descrto de acuerdo con sus caracteristicas y. preferiblemente: com la indicacién de su erigen. [ens 12322) 34.3 cepa madre tun conjunto de cultivos separados e idénticos, obtenidos en el laboratorio a partir de un solo subcultive de la cepa de referencia, bien Sea en el laboratorio e de un proveedor. TEN 123223 1 APM GUIA TECNICA COLOMBIANA Gc 78 ceed cultivo de trabajo. tun subeultivo primario de un stock de le cepa de referencia (3.4.3) 4, PRACTICAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 44 DOCUMENTACION 444.1 Documentacién requerida del fabricante Se recomienda que el fabricant= suministre los siguientes detalles: = nombre del medio. componentes individuales y cualquier suplemento. asi como ‘sus cédigos de producto; = vddigos del lote: = valor pH del medio antes de usar: Informacién de almacenamiento y fecha de vencimiento: = cualquier ensayo de evalu utllzado: in de comportamients y #1 organismo de ensayo = hoje de datos técnicos: - certtficado de control de catdad ~ datos de seguridad y/o riesgos. cuanda sea necesario. 44.2. Lista de verificaci6n del laboratorio. \Vericaciones del Isboratorio al recibir et medio: nombre del mesio y cédigo del ioe: = fecha de recibo: = fecha de vencimiento; - condicién e integridad det envase. 42 ALMACENAMIENTO. 424 Generalidades En todos los casos, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante, cuando estén ‘disponibles, relacionadas con las condiciones de almacenamienta. fecha de vencimiento y uso, GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 78 4.22 Gestién y control de calidad de medios deshidratados y suplementos Usualmente, el medio se compra al fabricante. Se entregan en forma de polvo deshidratado ¢ granules. en recipientes sellados, los suplementos de las distintas sustancias selectivas 0 de iagnéstico vienen en forma liofitzada o liquida. Sin embargo, es aconsejable programar ta compra para que haya una rotacién regular de existencias (por ejemplo. lo primero que entra es lo primero que sale}. Pare mantener un inventaric eficente. se aconseja que las verificaciones adicionales incluyan: ~ nueva verifeacién det sello: = fecha cuando se abrié inicialmente: - __evaluacién visual del contenido de los envases abiertos, Especialmente. después de abrir un envase nuevo. la calidad del medio dependers det ambiente del almacenamiento. El cambio en el fujo del polvo, fa falta de homogeneidad. ‘pelmazamiento, el cambio de color, etc. indican pérdida de calidad del medio deshiaratado. Es aconselable desechar cualquies medio deshidratedo que haya absorbide humedad © ruestre cambios obvios de su aparienciafisica 4.2.3. Medio suministrado comerciaimente y listo para usar ‘Se siguen las insirucciones del fabricante con respecto de las condiciones de almacenamiento, la fecha de vencimlente y el uso. 424 Medio preparado con férmulas deshidratadas, disponibles comercialmente, y componentes basicos individuales La vida Gt de esta clase de medios es variable. Por lo tanto, es diffe indicar los limites generales de tiempes de almacenamienio de los medics preparados. Las _normas intemacionales 0 nacionales espec'ficas pueden estipular las condiciones de la vida Ul Se aconsela proteger los medios de cultivo esterilizadas, dispensados en cajas. tubos 0 frescos ¥ los reactivos que ne se usen inmediatamente, contra la luz y la desecacién. Es aconselable mantener en un reftigersdor no mas de 3 meses, o 2 temperatura ambiente no mas de 1 mes, en condiciones que eviten modicaciones en su compesicion, los medios estétiles, parcisiments completes. como. por ejemplo, los medios a fos cuales se agregan fos componenies finales inmediatamente antes de usarios: excepto si se ha establecido uns fecha de vencimiento. © si la norma nacional o internacional 10 especifica. Sin embargo, se recomienda que los medios a [os cuales se han agregado suplementos labiles selectivos. se usen el mismo dia que se preparan. Se recomienda no guardar los medios sélides que contengan reactivos quimicos y/o substancias labiles. para voiverios a fundi. Es recomendable que no se usen [os Joes de medics que presenten caracler‘sticas como cambios de color. signos de evaporacién, deshidratacién. o crecimiento micrebiano, ‘Se recomienda que. antes de usar o antes de calentar acicionaimente, se equilibre el medio de ‘cukivo a ls temperatura ambiente GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 78 4.3 PREPARACION DEL MEDIO EN EL LABORATORIO 431 Generalidades La prepsracién exacta del medio de cultivo es uno de los pasos fundamentales del examen ‘microbiolégico con el cual se recomlenda especial cuidado, ‘Se respetarén las buenas practicas de laberatorio y se sequiran las instrucciones det fabricante para el manejo de medios deshidratades y otros compenentes. pafticularmente aquellos a contengan materiales peligresos como. por ejemplo, sales biliaes y otros agentes selectives. Cuando se prepare el medio con formulaciones comerciales deshidratadas, se recomienda ‘seguir las instrucciones del febricante en forma precisa. Se recomienda decumentar todos los datos relevantescome. pcr ejemplo, pesoivolumen, pH. fecha de preparacion, condiciones de esterilzacion, operario, Cuando se trate de medios prepsrados con componentes individuales, se recomisnda seguir exactamente lz formula y registrar todos los detates. como se ingica en el numeral 42.1 ademas dela identftcacion completa como, por ejemplo, cétigo y nimera de lole de todas fos components que se usen 43.2 Agua ‘Se recomienda usar agua destilada 0 agua de calidad equivslente, es decir, libre de ‘substancias que pudieran inhibir 0 influenciar el crecimiento de microerganismos en las condiciones del ensayo. Si el agua destilada se prepara con agua clorada, se recomienda neutralizar el cloro antes de destlaria ‘Se aconseja guardar ef agua desflada en recipientes fabricados, preferiblemente. con ‘materiales inertes jvidrio neutro. polietileno, ett:}, y del cual se debe demostrar. antes de su Use inicial, que esta libre de cualquier sustaricia hibitoria, NOTA En algunos casos puece ser necessro usar agus rec praparada, Ere da Grice de earbono sieue%, Para considerar que el agua destlada es de buena calidad es aconsejable que ésta tenga una resistividad no inferior 2 300 000 Sem, PRECAUCION El agua procesada por intercambio de iones {desionizada} puede tener tun ato contenido d= microorganismos: por lo tanto, no es aconsejable usar esta agua sin verificar que el contenido de microorganismos en el agua sea bajo. Se recomienda consultar con el fabricante Ia mejor manera de reducir al roinimo la contaminacién microbiana. E} agua desionizada esterlizada por filkado todavia puede contener sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos. Ref. ACTM aguas para laberaterio. 43.3. Pesaje y rehidratacién Se pesa cuidadosamente lz canfdad adecuada de medio deshidratade (teniendo cuidedo de no inhalar el polvo, especialmente cuando ef medio contiene substancias tdxicas} y se agrega progresivamente Is cantidad necesaria de agua, evitando que se formen grumos, GUIA TECNICA COLOMBIANA GIC 7s 4.34 Disolucién y dispersisn ‘Se sconsefa disolver el medio destidratado répidamenle mezclando instantinea y repetidamente con caientamiento posterior. si fuera necesario. El medio que contiene agar se debe dejar hidratar antes de calentar luego mezclar pare cisolverio. Cuando el medio s: Prepare con compenentes individuales, es aconsejable agregar cada components por separade 9 dejar disolver antes de completar el voiumen definitive. 4.3.5 Medide y ajuste del pH ‘Se mide el pH con un medider de pH y se aust. si es necesaro: por ejemplo, cuando el medio 5e prepara en el laboratorio con componentes individuales para que, después de esteriizar y enitiar a 25 ‘C el medio tengs el pH requerido = 0.2 unidades de pH, excepto si se requiere otra cosa. Normalments, el ajusie se hace con una sclucién de aproximadaments 40 gf (cerca de 1 mol?) de Hicréxido de sodio (20H; © aproximadamente 36.5 9 (cerca de 1 mali} de acide clorhiarice (RCI, NOTA, Loe matloe fetrcados corercs¢mante pueden presenta: cambios sig os por el autcclave, Sv emkargo, siempre cuando sa use agus dest aca ser recesazo ajosar el 2H anes de pasar por el sutelavs 43.6 Vertido Se vierte el medio en los recipientes adecuados con un volumen 1. 2 a 3 veces supericr al del medio. 43.7 Esterilizacién 4.3.1.4 Generalidades ‘Se puede esterlizar el medio de cultivo y los reactives por calor hnimedo (véase el numeral 43.7.2}. 0 8e puede esteriizar por fitracion ivéase el numeral 4.3.7. Para cierios medios no es necesario esteriizar en autoclave, sino que se pueden usar después Ge hervirios. For ejemslo. los medios para Entercbactariscese que contienen verde brilante son particularmente sensibles al calor y & la luz. es aconsejable enfriarios rapidamente cespués Se hervirfos y protegerlos de a luz fuerle. Ademés, algunos reactivos se pueden usar sin estetlizar (véase la respectiva noma nacional, intemacional o las instrucciones del fabricante}. 4.3.7.2 Esterilizacién por calor himedo La esterlizacién por caler himedo se hace en un autoclave © preparador de medio. La operacién en el autoclave demora, generaimente. 15 min 3 121 *C. Cuando fos volimenes son superiores 2 1 000 mi, se adapts el ciclo de esteriizacién como sez necesaria. En todos los Cases se recomisnda Seguir las instrucciones contenidas en la nocma infemacional, nacional o las instrucciones del fabricante. Se recomienda meniforear el comportamiente del autoclave ars asegurar que se alcsnza la temperatura deseada en condiciones tipicas de carga. Se recomienda, para tal fin, el uso de cinta indicadora y termecuplas. nua de radio 1200 mi} an Es esencial conirolarla eficacia de Ia esteriizacién 10 GUIA TECNICA COLOMBIANA —_GTC.78 Después de calentar, es esencial enitiar el medio de manete que se evite el exceso de licién. Esto es importante con medios sensibles, como, por ejemplo, vollimenes medios. ‘grandes y medio para Enterosscteriscese, 4.3.7.3 Esterllizacién por fittracién Se puede esterlizar por fitracién en condiciones de vacio o a presién. Se usan membranas ¥ las elementos del fire estériles con un didmetro de poro de 0.22 am. Se siguen las instrucciones del fabricante con respecto al uso de fos elementos del dliro o a las membranas compradas ya esterlizadas. Las disfintas partes del aparato de fitrade, ensambladas ono, se esteriizan en el autoclave durante 15 min a 121 °C. Si es necesario, se pueden ensamblar en forma asépiica en una cémara de flujo laminar. después de esterlizar en e! autoclave. NOTA Algunas mambranas de Fira puad prsteinas (cor sjemsio $8 recoriends que al eazare hurasezes mevismanse lft, 4.3.1.4 Monitoreo Después de esteriizar. por autoclave, hirviendo o fitrando. se recomienda monitorear todos los medios, en particular con respecio al pH, al coler. la esteriidad y la consistencia, 43.8. Preparacién de suplementos Se recomienda manejar con cuidado los suplementos fabricados que contienen agentes toxices. para evitar la dispersién del polvo. el cual puede causar reacciones alérgicas u otra clase de reacciones al personal del laboratorio. Se recomienda tomar las precauciones necesarias y seguir las instrucciones del fabricante. No es aconsejable usarios cuando haya ‘vencido su vida uti, 1a cual. para anfibiéticos. generalmente es el mismo dia. Las soluclones antibidticas se pueden guardar. en algunas citcunstancias, congeladas en al/cuotas convenisntes pero no se es aconsejable volver a congelar después de descongelar. Es recomendable que el usuario consulte con el fabricante la posible pérdida de actividad por ‘congelamiento o que Is pruebe é! mismo. 4.4 PREPARACION PARA USO 4.4.1 Fundido del medio de cultive agar Se funde el medio de cultivo colocandolo en un baiio de agua hirviendo, 0 con otro proceso ‘uyos resultados sean idénticos (por ejemplo, fujo de vapor por el autoclave}. Se recomienda volver a calentar en el menor tiempo posible los medios que se han pasado previamente por el autoclave. pare mantener la calidad dei medio. Se aconseja evitar que el medio se caliente demasiado. y retirar cuando se ha fundide, Se enfiéa el medio fundido hasta 47 °C +2 °C en un bafio de agua controlade con termostato, hasta cuando se use, El tiempo nesesario para alcanzar 47 *C depende de la clase de medic, el voluren y fa cantidad de unidades en el Baio de agua. Se aconseja usar el medio fundide fan pronio como sea posble, pero se recomiends ‘que no se guarde mas de 4 horas. Nunca 25 recomendable usar un medio de cutive a una temperatura superior a los 60°C. 44.2. Desaireacién del medio de cultivo Si es necesario, inmediatamente antes de usar. se calienta el medio de cultive en agua caliente © bajo fio de vapor. durante 15 min, con la tapa floja: después de calentar, se cierra bien la tapay se enitia el medio répidamente a la temperatura de operacion, 4 GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 78 4.4.3. Adicién de suplementos Los suplementos termolébiles agregan af medio después de enttialo a 47 “C= 2 °C. Los ‘suplementos refrigerados estériles pueden hacer que e! agar se gelatinice o forme hojueias transparentes. por fo tanto se permite que el supiemento estén Feque a la temperatura ambiente antes de agregario al medic. Se mezclan bien y suavemente fodos los suplementos ‘con el medio, luego se distibuyen en los recipientes tan pronto como sea posible. 44.4 Preparacion y almacenamiento de los medios en cajas Petri Se vierte ef medio de cultive en cajas Petri hasta obtener un espeser no inferior a 2 mm (por ejemplo, en cajas de 90 mm se requieren normalmente 15 ml). Se dejs en‘tiar y soliicar el ‘agar colocando las cajas Petr. fapadas, en una superficie horizontal fia, ‘Una céstite de nde de 12 4 de coma c= sie saatr esversavart ol eecimaris de mixoorgentarss, 2 algunas Skesvatrcias Lee fates Qve fiayan ana ciiaas de agua toe. a tomporcin del malo, catidsd de vedo an ios plats Is case ce fe a, cov vat adc" ¢ do Ove late Ig rumnadaa de ls bendsiers an & "subae Ta neubadorsy ts ampere des eubadora, i caneced de oaes Se usa el medio solidificado inmediatamente, 9 se guarda en condiciones que eviten ‘modificaciones en su composicién, por ejemplo. en un sitio oscuro yio en el refigerador de 4 °C. 2 12'C, en bolsas cerradas, durante una semana como maximo, o como indique el fabricante © la nonma especiica, Se rotutan las cajas en la base. con a fecha de preparacién yo la fecha de vencimiento y a identifcacién, Se pueden usar cédigos que cumplan este requisito. La vida dtil de las cajas lenas, aumentard si se guaran en bolsas plisticas selladas. Para evitar que se presenten condensades. las cajas deben estar fias antes de colocarias en las bolsas. No es aconsejable secar Ia supericie oe las cajas de agar antes de guardarlas en Zio, En general, para inocular un medio de culivo sélido. se secan las cajas. preferiblemente retirando las tapas y con la superficie del agar hacia sbajo, en un homo a temperatura entre 25 °C. 50 *C, 0 en un gabineie de fiyje laminar. hasta que dessparezcan las goticas de Ia superficie ‘del medio. se aconseja no secar demasiado. Se recomienda guardar y usar las cajas de agar lstas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, 44.5. Incubacién Se recomienda no apilar t2s cajas en pllas de mis de 6 y dejar espacio para que circule el aire yy se equllibre la temperatura de incubacion tan rapido como sea posible. Cuando el medio sea Fiquido, et Sempo necesario para aleanzar Is temperatura de incubacién depends de varios facteres. como, por ejemplo, el volumen. la carga. l recipiente, Is clase de incubadore. Cuando ‘se usen jarras anaerébicas puede ser necesaric apilar mas de 5 cajes. 4.5 ELIMINACION DEL MEDIO ‘Se recomienda eliminar tante los medios contaminados como los que no se hayan ublizado en forma segura. de acuerdo con las regulaciones locales o nacionales. 5, CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO $.1 CONTROL DE CALIDAD FISICO - QUiMICO. Es aconsejable que los ensayos de laboratorio incluyan lo siguiente, como minimo: 12 GUIA TECNICA COLOMBIANA GTC 72 = valor pHi medido entre 20°C y 25 * y mediante cbservacién: ~ _cantidad cor ta que se lené yio espesor de la capa: = eater: ~ claridadipresencia de artefactos épticas: - __estabilidad / consistenciamumedad de! gel §.2 CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGICO 5.241. Esterilidad Es aconsejable que se pruebe fs esterilidad de una cantidad adecuada de cada lote. 5.2.2 Organismos de ensayo Se recomienda que el conjunto de erganismos de ensayo contenga s6lo micraorganismes de caracteristicas estabies, representativos de su especie, los cuales son confables para

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