Mircea Covic, Dragos Stefanescu, lonel Sandovici GENETICA MEDICALA Editia a Il-a revazuta $i actualizata Cuvant inainte de Mircea Malita gi Nicolae Cajal POLIROM 2011Capitolul 2 STRUCTURA SI ORGANIZAREA CELULARA A ADN ADN este molecula fundamentala a vietii. Toate mecanismele prin care se realizeazi structura si funcfille celulelor, organizate in jesuturi gi organe, precum si rispunsurile lor la aciunea mediuui in- tem sau extern — sunt codificate gi reglate de structura uimitor de simpl4 si clegant& a molecule de ADN. De actea, infelegerea structurii ADN sia organizirii sale in cclule este fundamental’ pentru studiul geneticii medicale si a medicinii, in general. A. ADN este substratul molecular al ereditatii 1. Evolufia conceptiilor despre natura genci in arul 1865, Gregor Mendel a formulat ipoteza existentei genelor poliivit citeia fiecare caracter este determinat de ,,0 pereche de factori ereditari" (oumifi mai tarziu gene) gia stabilitlegile evediafii. Astiel, ela pus bazele geneticii ca stint. Iiial, in ipoteza lui Mendel, gena era o entitate abstracta, ipoteticd, a carei naturé chimici era ne- cunoscuti, Ulterior, la incepurul secolului XX, de- monstrandu-se rolul cromozomilor in_ereditate (Walter Sutton, Theodor Boveri si mai ales Thomas H. Morgan, premiul Nobel, 1933), gena a devenit un element coneret, material, un segment dintr-un cro- mozom care determind un caracter specific, dat na- tura ei chimied a ramas in continuare necunoscutd. La inceputul deceniului patru, s-a stabilit e& in structura cromozomilor existé proteine yi acizi muckici: ADN si ARN; una din aceste componente trebuia sa fie substratul chimic al genei. Multi cer- cettiori credeau atunci cd genele sunt formate din proteine, cele mai complexe substanfe chimice din celule; ADN era considerat o molecula prea simple pentru inmagazinarea informatiei creditare gi trans- ‘miterea ci fn succesiunea generatiilor. Existau totusi uncle argumente .indirecte” care pledau pentru rolul genetic al ADN: localizarea aproape exclusiva @ ADN in mucleu si cromozomi, structuri cu rol important in ereditate; cantitatea sa constanta si carac- teristicd speciei, proporjionala cu numarul cromo- zomilor (cclulele sexual au jumatate din cantitatea de ADN a celulelor somatice);stabilitatea metabolic’ a moleculei de ADN. in 1944, Oswald Avery, Colin Mac Leod, Madyn McCarty (de la Institutul Rockefeller) au demonstrat experimental c& ADN-ul este substratul molecular al ereditati. 2, Demonstrarea rolului genetic al ADN in 1928, microbiologul englez Frederick Griffith, studiind morfologia si patogenitatea diferitelor tul- ini de pneumococ, a facut o observatie remarcabil®. Unele tulpini aveau o capsula polizabaridica si culti- vate pe agar formau colon ,netede”, find numite S (de Ia smooth”), iar aliele erau necapsulate si for~ mau colonii ,rugoase”, fiind numite R (de la ‘wrough”). Griffith a observat c& soarecii injectagi cu phoumococi § au murit, iar cei injectafi cu tulpina R au supraviefuit; deci, pneumococii $ capsula{i erau patogeni, producdnd septicemie si moarte. Patoge- nitatea, determinata de prezenta capsulei, se trans- mite ereditar. in mod surprinzator, un amestec de pneumococi R (nepatogeni) vii si pneumococi S (patogeni) omorati prin caldura a avut un efect let De la animalele moarte s-au izolat surprinzitor24 pneumocaci $ vii, Explicatia posibila a acestui fenomen era transformarea tulpinilor de pneumo- coci R vii intulpini S vi, sub influen{a unor compo- nente din strictura pnoumococilor $ insetivatis natura chimic& a substanfei care a produs transformarea nu a putut fi insi stabilité in epoca respectivi. ‘in 1944 Avery, Mac Leod, McCarty aureluat ex- perientele hui Griffith si au demonstrat ei factorul transformant este ADN. Autorii au aritat c& transferul ADN extras de lao tulpina de pneumococi S capsulati, patogeni, la pncumococi R necapsulati, nepatogeni, determina transformarea lor in pneu mococi patogeni (R —+ S); mai exact, un segment de ADN-S, ce contine gena pentru capsul, a fost incor poratin ADNpneumococilor R, Accasti modificare na era realizata de proteine sau de alte componente din structure pneumococilor $ si era inhibatd de enzima ADN-aza (figura2.1); odata produsa, modificarea se transmite la generatile urmitoare de pneumococi, find deci ereditard, Pe aceasta ba74, s-a presupus, ch ADN este materialul genetic. ‘Aga cum sc intdmpla adesea cu marile adevaruri, rolul genetic al ADN, clar si elegant demonstrat de Avery ef al. a fost ins un timp negat. in 1952, Allied Hersiey si Martha Chase (Premiul Nobel, 1969) au demonstrat ef eranaferul exclusiv al ADN de la bacteriofagi le Escherichia coli transforma aceasti bacterie in celule producatoare de particule fagice, cu o structura completa, inclusiv capsula pro- teici (figura 2.2). Autorii au marcat proteinele ccapsulare ale bacteriofagilor cu sulf radioactiv CS), iar ADN cu fosfor radioactiv (*P); cand bacteria E. coli a fos infectath cu bacteriofagi ,marcaji", se observa'c& numai P (deci ADN) patrunde in celula, fracfiunea marcata ex #8 (proteinele capsutare ale Proteirele cepsulet |ADN fac este int mreae specie smaceat specific liberares une! noi mas a gemratii de fags (rin liza bacterie) care au contin #38 fn expels lo ul posts AON HP 3 “Yh &, GENETICA MEDICALA bacteriofagului) ramanfnd Ia exterior Formarea ulterioara a unor particule fagice noi, complete, a demonstrat clar ci ADN era unicul purtitor al informatici ereditare PNEUMOCoCI S CAFSULATI JOMORAT! PRIN ‘CALDURA IZOLARE POLL ZAHARIDE LIPIDE ARN PROTEINE [ADS ‘CULTURA DE PNEUMOCOCI R NSCAPSULATI Vil ©: /\ sos ‘TRANSFORMARE EREDITARA ® @ eo oR oR OR Noe Figura 2.1. Demonstrarea rolului genetic al ADN {odifieat dupa Suzuchi ea, 1991) [ADNeste sngura substan extasi din pneumo- coeii S care transforma pneamococit K vit, necapsulai si repatogeni, in pneumoco S vi, capsulayi si palogeni,tansformarea este per- manent ereditars Figura 2.2. Reprezentarea diagramatici a experientet Hershey-Chase, care demonstrearii cd ADN este materialul genetic al fagilor (modificat dupa Ayala si Kier, 1984) Autorii au marcat proteinelefagice cu 3 gi ADN fagie eu “P; tn baserile infectate eu fag patrunde numai ADN rrarcat cu "P: se formea7 fag noi o structars complet, inelusiv capsule proteicd| Gapitolut 2: STRUCTURA $1 ORGANIZAREA CELULARA A ADN Demonstrarea faptuui ca transferul ADN de la un microorgenism la altul produce transformari permanente gi ereditare ale primitorului a constituit dovada decisiva c& genele sunt aledituite din ADN. Experienfele de transformare ereditar’ produse de ADN si numeroase alte dovezi au stat Ia baza une roi paradigme fundamentale in biologic sau inaugurat 25 revolutia molecular’ in geneticd. Introducerea unor segmente de ADN in celule cultivate in vitro (proces nhumit ,gransfecjte ") sau in zigotifsmbrion’ (yanimale transgenice”) sti la baza ingineriei genetics. Mai mult, a reprezintd principiul de baza al terapiei genice, una din cele mai exiraordinare realizéri ale medicin ultimilor ani. B. Structura ADN Descoperirea rolului genetic al ADN' a concen- ‘rat atenjia cercetatorilor asupre structurii sale, intrucit descifrarea ei reprezenta singura cale pentru fnfelegerea naturii si funetiei genei, in anul_1953, James Watson si Francis Crick au propus un model al moleculei de ADN alcituit din doui catene poli-_ nuckotidice, Tegafecomplementar_prin_bazele azotate, infigurate intt-o elice dubla, rasucit dreapta. “Wfodelul Watson-Crick al structurii ADN repre- inti, probabil, cea mai mare descoperire a biologiei moderne (Premiul Nobel, 1962). Acest_modcl.. universal valabil in lumes vie, corsspunde funetiilor ‘material genetic, deoarece exvlicé mogul in care Se stocheazd, se trai Feditar’. Gena inceteazi s& mai fie ocntitate ,anis- ierioasd”, are o structurd chimicd complex 5i bine definitd, iar ADN devine nu numai esenta geneticii, ci si un veritabil_,,simbol al viefi’”. Consecintele pentru practica medicala ale revolufiei detcrminase ‘de descoperirea structurii si functiei ADN sunt si vor fi atat de spectaculcase, incit nu vor avea egal in {storia medicinii spre 1. Structura primara si secundaria a ADN LI. Siructura primara a ADN 'ADN este un macropolimer de .dezoxiribonu- cleotide”. Lungimes si greutatea sa molecularé sunt foarte mari, permifénd stocarea unei cantitati uriage dde informajic. Cantitatea de ADN variaza de la 0 specic la alta (la om, gm, = 3,5*10" daltoni), dar ‘este constant laindivizii aceleiasspecii, recur siin {oate celulele somatice (diploide) dc la aeclasi individ. Unitatea structural a ADN este dezoxiribonu- leotidul, alcatuit din trei clemente distinete ~ un ‘lucid cu cinci atom de carbon (0 pentoza), 0 bazd azotatd si un grup fosfat ~ unite prin legaturi covalente (putcmnice) (figura 2.3). Pentoza este reprezentati de D-2-dezoxiribozi, in forma sa furanorica. Baza azotati, care poate fi purinick — adenina (A), guanina (G)— sau pirimidinies — timina (1), citozina (C), se leagh la C,. al dezoxiti- bozei, alcatuind impreuni un nucleozid. Grupul fosfat (provenit din acidul ortofosforic) se leagt la C, al dezosiribozei, formand cu aceasta si baza azo- tati un nucleotid, unitatea fundamentald a structuri catenci de ADN. Grupul fosfat confer’ molecule’ de ‘ADN caracterul de ,acid” si numeroase sareini negative, neutralizate in vivo prin fizarea histonelor, proteine bazice. in ADN, exist’ patru tipuri de dezoxiribonucleotide — acid dezoxiaderitie, dez0x1- ‘guanilic, dezoxicitidilic 51 dezoxitimidilie ~ care se vor deosebi numai prinbaza azotatd; gruparea fosfat si dezoxiriboza sunt elemente constante. wf a, s 1 ip cH on Figura 2.3. Structura unui dezoxiribonucleotid (@-Dezonicitidna 5° trifostat) Polimerizarea nucleotidelor, in molecula de ADN, se fealizewzi prin legdturi covalente 3°- 5° {osfodiesier, formate inte gruparca OH a C, al dezoxiribozei unui nuclectid si restul fosfet fixat la , al nucleotidului urmator, Se formeaza astfel © catend (lan}) continud, liniard (neramificata), care ici se imegrened fn Teele vinwurl nateralul genetic este ARN; ele sunt numite ,rerovirusurt” deoarees tn timp! in ‘gem celular dupa ce ARN lora fost convertt in ADN, de citre o enzama mmitstranscriptazd inversd, Unele din aceste —S—S— ‘Virusuri produc cancere gi alte boli (SIDA).26 GENETICA MEDICALA reprezint& structura primar a ADN accent catena prezinta o parte ,,constanti’’, fosfoglucidica (in care gruparea fosfat altemeazi regulat cu dez- oxiriboza), ce formeaz axul catenci, si 0 parte variabila”, reprezentata de bazele azotate, care se fixeazi perpendicular gi lateral pe ,coloana verte- brala” fosfoglucidica (bazele azotate de pe aceeesi catend nu se leag® intre ele) (figura 2.4) Capatul 5 al catenei [ADENINA] (Suanina] ! Spre capatul 3 alcatenei tiermiatacu “OF Figura 2.4. Diagrama structurii primare a catenei de ADN Se observa axulfosfoslucidc, eu orientare(polaritate) 5° -» 3, pe care se fixeazd lateral 1 perpendicular basele arolte. Scoventasructutiprezentate se poate sere: 5’ pApGpT-OH (unde pete legaturafosfodieste- Fd, jar ~ OH este gruparea teil de la capac 3°) sau, mai simmplu, 5? AGT 3 fin catena de ADN, pozitia unui nucleotid nu impune cu necesitate in vecindtatea sa prezenta unui anumit alt nucleotid; pozitile adiacente pot fi ovu- pate de oricare din cele patra tipuri de nucleotide, Deci nu exist nici o restrictie in dispunerea/ succesiunca nucleotidelor in lungul catenei de ADN sau, altfel spus, exist o libertate totald de asezare a nucleotidelor. Acest lucru este esential deoarece scovenfa (ordinea) nucleotidclor in ungul catenei de ADN reprezinté informatia geneticl codificat’, pe baza cAreia se stabileste ordinea aminoacizilor in proteine. Sensul de ,citire” a informatiei sence este determinat de polaritatea $° —> 3° a catenei de ADN. Es este dati de faptul c& pozitiile 5’-fosfat al primului nucleotid si 3'-hidroxil ale ultimului nucleotid al catenei sunt libere, neangajate intr-o legatura chimic’. Orice scoventa de nucleotide se «citeste” in directia 5” > 3” gi se serie cu capatul 5° la stinga, de exemplu, 5’-ATGCCTAGATCA-: Fiecare catenti a ADN este deci o secvenjd orientatd definita prin inlinguirea nucleotidelor. 1.2. Structura seeundarii a ADN In elaborarea modelului structurii ADN, Watson $i | Crick s-au bazat pe studiile difractici cu raze X a moleculelor de ADN (Maurice Wilkis, Rosalind | Franklin), precum si pe analizele chimice ale ADN (Edwin Chargraaf). Inaginile objinte prin dfacie curaze X aunor molecule d= ADN de origin diferite eau ttdeauna asertinatore, Televind deci un ,stodel uni” si sugerind eX molecalele de ADN ai 0 orgunizare bire dejnita, oréonat, in care Plsjile componente se rept ele Insle, Modell sugereart txistenta mai multorcatene polinuleotdice go stractrk eticoidala ordoata, Anlizele ehimice sle ADN av eviden- | bat of sua bazelor purinice (A+G) este ins intotdeauna gal cu suma bazeloeptimicinice (TC), ar raportal ATT GC este untar, eterent de specie tm schmb,raporl ATIG+Ceste difertde| gi caracteristic fcdreispesi la can este 17. Prelucrand creator aceste date, Watson si Crick | au propus un model al moleculei de ADN alcatuit din doua catene polinucleotidice, legate intre ele prin bazele azotate, in mod complementar (figura 2.5.a) si infagurate plectonemic pentru a forma o dubla spirald elicoidala (0 elice dubla) orientata spre dreapta, cu diemetrul de 20 A gi pasul elidel de 34 A (figura 2.5.b). Pomind de la faptul c& raportul | A/T= GIC = 1, Watson si Crick consider’ c& in mo- Iecula de ADN se produce o imperechere ,preferen- {iala” a bazelor care unese cele dou catene; bazele azotate (situate spre interiorul moleculei) se leagh complemeniar: 0 bezi purinicd se uneste cu 0 baz’ pirimidinicé sau, mai exact, A-T si G-C (forménd un cuplu sau o pereche de baze, prescurtat pb)’. Lega turile se reslizeazA prin punji de hidrogen. legituri clectrostatice slabe (figura 2.5.a), fn felul acesta, secventa nucleotidelor unei catene determini cu necesitate secvenja nucleotidelor celcilalte catene. [Deci cele dows catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare si sirict codeterminate. Cunoasierea 2, 1,000 pb de baze formeazd o Filobu2A, iar 1.000 Kb 0 megabazi; genomul uman are 3200 megabazeCagitolul 2: STRUCTURA $I ORGANIZAREA CELULARA A ADN 21 secver{ei nucleotidice a unei catene va permite awomat determinarea secventei nucleotidice a celei- lake catens. De exemplu: S’-ATGCCAG-3" 3°-TACGGTC-S". Trin] ===: [Tin OE ioe O® Tein arin a t Sant Pas[a nm sant mare 7S Figura 2.5, Structura secundaria ADN (modificat dupd Strachan gi Read, 1999) 4) Cele dou catene polinucleotdice ale ADN, legate implementa, ov disporiieantiparalela dsort dineeti- ler opise ale legiturilor 3° 5°; b) Dubla spiral elicoi- dala coaniala, dextrogira, in'care pasul clicei este 344 nm, iar diametrl ci de? nm; se observ cele doul ‘ipur de sanquri sau ineizri, nick 1 mare fn acest context, vom sublinia o idee asupra careia vom reveni: legea complementaritagil baze~ lor (A:T $i G-C) (regula Watron-Crick”) sti la ‘baza mocanismelor prin care se realizeazi functiile geneticeale ADN: transcriptia, replicarea, repararea leziunilor, recombinarea, precum gi tehaicilor actuale de analiza a genelor. Liberate total de agezare a nucleoidelor in ungul catenelor de ADN (pe vertical) se asoeiaza cu nece- sitatea dispozitiei lor complementare (in planul orizontal al molecule). ,Libertatea si necesitateadau substratutui ereditait’ inalte sa dferenfiers sh capacitate de a stoca, exprima i transmite perfect ‘mesajul pe care il detine” (Parot, 1985), in mole- ccule-simbol a viett este astel ,imseris” ural dintre prircipil filosofice fundamentale ale existenfei omu- lui: liberate si necesitate LLegatunle stereochimice/spatiale necesare pentru mperecherea coreeti dintre A-T si G-C fac ea orien- tarea (polaritatea) celor doud catene sd se dirijeze insensuri opuse, deci s& fie antiparalete. Acest Iu- cra are consecinfe importante in cities” informa- tiei in procesul sintezei proteice, precum sin meca- nismul replicirii (biosintezei unor noi molecule de ADN). Cele dou catene ale ADN se infisozrii (se imple- tesc) plectonemic (unain jurul ateia, cao ,fxinghie”, si amindoud in jurul unui ax central imaginar al moleculei), formand 0 dublé spiralé elicoidala coaxial (0 clice dubla), orientaté spre dreapta (dextrogir) (figura 2.5.b). Ea poate fi comparat cu O,Scard m spiratar mare axcle fostugluvslive fu- rmeaza marginile sedi, iar perechile de baze, treptele i, Aceasti structurd, asociat& functiilor majore pe care le indeplineste ADN, a fost plastic numiti sclicea viefi”, fiind un veritabil simbel al lumii vi. Structura ADN este, in ensamblul ei, perfect regulata, ordonatt: diametrul moleculei 20 A (2 am); otura completa aelicei este de 36 A sau 3,6 usu si permite dispunerea a 1D perechi de baze (figura 2.5.b). in configuratia ei spagiald, molecula de ADN rezint& dowd sanquri laterale (incizeri): unul mai tic (12. A) si altul mai mare (24 A). Ele sunt im- portante in recunoasterea stereochimica ji fixarea pe ADN « diferitelor tipuri deproteine cu care ADN interactloneaza. in gantul mic se fixeazs histonele (proteine bazice mici care formeaza legituri ionice cu axul fosfo-glucidie acid) care organizeazi ADN intr-o structura compact numité cromatini. Fixa- rea histonelor nu depinde de secventa nucleotidelor din ADN, dar modificarea lor chimicé ~ prin meti- lare, fosforilare, acetilare — influenteaza tiria inter- actiunilor cu ADN peeare il face astfel mai mult sau ‘mai putin accesibil proteinelor care regleaza tran- scriptia. Aceste proteine — numite generic factori de transcripfie — se fixeazi in sanful mere, (unde bazele sunt mai accesibile) dar numai pe anumite seevente (promotor) ale genelor. Am insistat asupra acesior interactiuni ADN-proteine deoareee, aya cum vom vedea, ele sunt decisive pentru organizarca si functionarea ADN in celule.28 GENETICA MEDICALA CASETA 2.1 ‘Denaturarea si hibridizarea ADN in conditii experimentale se poate produce ruperea (desfacerea) legaturilor de hidrogen dintre cele doud catene, prin denaturare termicd (incélzire la 63-100°C) sau chimicd (tratament cu alcali ete.) (figura 2.6). Aoest proces de conversie a ADN de la forma bicatenari Ia starea monocatenard se numeste denaturare. Prin récirea lenté a solujiei, monocatenele de ADN se poi reasocia pe baza complementaritipii si reface structura originald; procesul se numeste renaturare sau hibridizare. Vitezo de reasociere depinde de concentrajia ADN 3i timp (ze numeste cot de la concentrafie x timp; valoarea col la care se produce o asociere de 50% se numesie cot 1/2). Prin racire brusci monocatenele ADN raman separate $i pot fi folosite pentru realizarea unor hibrici moleculari (pe baza complementaritait dintre catene ) de tip ADN-ADN, fie intre dowd molecule de ADN de la specit diferite fe intre fragmente de ADN objinute arificial (numite ,sonde") si regiunea corespunzaitoare, complementard din ADN nati Se pot objine de asemenea hibrizi intre 0 catend ADN si 0 molecula de ARN complementarai (de tip | ARNm) rezultdnd un heteroduplex. Fenomenele de denaturare yi hibridizare sunt ample utilizete in genetica molecular’, in tehnicile ADN recombinant, si in medicina in | = diagnosticul molecular: hibridizarea intre 0 monocatend de ADN de laun pacient sio sondi de ADN (marcata fluorescent) ce fluorescent i corespunde unel gene; hibridizarea sondei gi prezenta semnalului idicd prezenta genei; absenia semnalului indicd absenfa‘deletia genei; = terapia genica: hibridizarea intre ADN al bolnavului si 0 moleculd de ARN (oligonucleotid antisens) complementara genei mutante produce un heteroduplex ce blocheazd expresia genet mutant. ‘fn conditii fiziologice, molecula de ADN are 0 mare stabilitate' metabolica, datorita legaturilor f\- zico-chimice dintre elementele unei eatene precim si dintre cele doua catene’. Ele sunt stréns legate una de alta si de obicei nu se pot separa, Accasti stabilitate este o condigle obligatorie pe care trebuic SA o indeplineasca substratul material al ereditatii Totusi, sub actiunea unor enzime cele dou’ catene ale ADN se pot desface parfial, pe segmente limi= tate, gi fimefioneaz& ea ,matri}S” pentmu sinteza unor molecule noi, complementare (ARNm in procesul de transcriptie, sau o alt& catend ADN fn cursul re- plicirii). Catenele ADN pot fi separate in laborator una de alta, prin diferite ,tratamente” (incdlzire, tre- tare cu alcali). Aceste monocatene de ADN sunt folosite la realizarea unor hibrizi molecular (caseta 2.1) im majoritatea tebnicilor de amplificsre si liza a ADN (ce vor fi prezentate in capitolul 5) 1.3. Relasiile dintre structura gi funcyiile ADN Modelul structurii ADN intruneste toate conditiile pe care trebuie sé le indeplineasca materialul genetic: +s stocheze o cantitate mare de informatie, inte-o forma stabild, dar usor de exprimat; +s reproduca informatia (prin replicare) si 8.0 transmité cu mare fidelitate de la 0 generagic 1a alta (prin diviziune), eventual st 0 ,repare” corect, daca se produce o leziune; REFACERE DUBLU ELI DENATURARE CATENE. SEPARATE CO _sameuvizare >= —————r"- SONDA GENICA Figura 2.6, Denaturares si hibridizaren ADN 4) Denatarares termica i objinerea de monocatene, prin ce brusc. b) Formarea uror hirizi moleculaitre ‘© monocateni de ADN gi o sonc genica mareai (cu 2p sau cu un fuoroerom) care se va fixa in poriunes de ADN cu 0 seevenja complementara + si exprime informatia genetic’ prin sinteza ARNm. si, pe accasth bazi, a unor protcine specifice; + si fie capabil de variatie. 13 Depi legararie de hidrogen sunt legatuel elecwostaice slabe, mulitudinea lor asigurd ,coeziunca” catenelor.Capitolul 2: STRUCTURA, Aceste proprietii fundamentale si caracteristice ale ADN ji conferd calitatea de a fi molecula esen- Hall a viepit. a) Inform: ADN define, prin genele pe care le poseda, infor- maliile necesare pentru ca celulele 88 tiasca, 58 se multiplice si si se diferentieze (capatind anumite specializiri). In ansamblul organismului, ADN de- termina si controleaz’ embriogeneza, dezvoltares, ‘cresterea, metabolismul si reproducerea ~ deci toate procesele majore ale functionarii organismaului ‘uman, Informajia genctic& necesara acestor procese este reprezentata de secvenfa liniard (succesiunea sau ordinea de inldntuire) a nucleotidelor in mo- lecula de ADN; ea determina structura proteinelor care alcituiese celulele gi tesuturile si participa la functionarea lor complexa. Proteinele sunt formate din lanfuri de aminoacizi; secvenfa aminoseizilor in protein determin proprietatile caracteristice ale fiecBrei proteine; aceast& ordine specifica a amino- acizilor este determinata de secvenja nucieotidelor in ADN. Informatia ereditart este codificatd, fiind serisa fntr-un limbaj foarte simplu, cu sjutorul unui walfabet nucleic” ce are numa patru ylitere”: Ay T, G iC (corespunzitoare celorpatma tipuri de nucle- tide). Folosind aceste elemente de cod se pot serie scuvinte” de (rei litere, asamblate into ,frazd” ce alcdtuieste o gen’. La fiecare triplet de nucleotide, numit codon, corespunde pe baza codului genetic (vezi capitolul 4) un anumit aminoacid din structura proteinei sau un ,semmal” necesar pentru a incepe sau termina lectura mesajului (figura 2.7). Informatia geneticd se ,citeyte” intr-un singur sens, determinat de polaritatea 5'->3' a catenei de ADN (de exemplu, 5" AGTTGTAAACCA 3°). ADN dublu helix 3 3 Catena ADN 3° matrif ARN mesager 5" | ORGANIZAREA CELULARA A ADN. 29 | __ Gena este unitatea de informatie ereditara; ea este alcituit’ dintr-o succesiune specific de { codon’, ce determina ordinea aminoaetzilorint-an polipeptid gi, prin aceasta, funetia lui, Modificarea secvenfei nucleotidelor prin mutatia genei va duce la modificarea unui/unor codon(i) $3, de cele mai multe ori, le modificarea structurii si functici proteinei sintetizate. b) Expresia informatiel ereditare Expresia informafiei ereditare ceprezintl, in esenfé, sinteza de proteine, Informayia geneticd codificati din ADN nu este folosita direct in sinteze proteinelor (figurile 1.1 912.7). Ba este mai inti copiati — transeripfie — intr-o molecula de ARNm, folosind acelasi cod si mecanistrul complementaritafi. Urmeaza apoi trans- lafia sau decoditicarea infurmatiei genetice din ARNm intr-o secvenia specifica de ominoacizi a proteinei, pe baza corespondentei dintre fiecare codon si un anumit aminoacid. Copierea informatici in ARNm se face numai de ‘pe una din catenele ADN, in directin "95"; aceasta catend a fost mumit catend copiatd sau matrita*. Ba este totdeauna aceeasi pentru o anumita gend, dat la ‘gene diterite poate fi una sau alta dintre cutencle ADN (diteofia de copiere va fi inst diferitt), Catena ADN complementard catenei transcrise este similara ca secventi cu ARNm (exceptind inlocuirea timinei cca uracilul) 5: diteotie (5’->3") sise numeste carend de refering3 sau eaten’ ,sens”. Dupi desfacerea en- zimatic’, temporari, a legiturilor de hidrogen dintre ‘cele doui catene ale ADN, copicrea se face in dirce- ia 3/5", sintetizandu-se 0 molecula de ARNm, complementaré si antiparaleld (5'—33°) fata de ca- tena matrit; ea va avea aceeasi secventi si orientare f8. De aceea, notarea si ‘TRANSCRIPTIE 3 oon codon cofon codon codon codon codon coon don coon econ cogen cagon cogon cngoncogon — TRANSLATIE TS0- TSG] ou | ata [aca] ser PROTEINA MET cupser Figura 2.7, Informatia genotici din ADN si modul ei de expresie ‘Seeventa de nucleotide din APN determin sinters nei proteine cu o smumiti secventi de amincacizi 4 Catena 3? — 5? se mai numeste gi catend antisens3» GENETICA MEDICALA descrierea unei gene se fac, conventional, referin- du-se la catena 5’ —» 3” de referintd (sens) a ADN. Mult timp, s-a considerat ¢ fluxul informagional este unidirectional: ADN -> ARNm ~> Proteina. Accasta relatie universala pentru cucariote, mumité i ndogma fundamentald a geneticit” a fost reeve- uata prin identificarea ..transeriptiel inverse”, de le ARN ~> ADN. Anumite secvente din ADN (de exemplu LINEs) codificd 0 transcriptazé inversé ‘care permite ca un transcript ARN si poatd fi copiat winvers” intr-o secvent& complementar’ de ADN. Prin acelasi mecanism, retrovirusurile, care au ca material genetic ARN, se pot incorpora in genomul celulei gazda, confectionindu-si 0 copie comple- mentar& dc ,ip ADN”. Fenomenul este larg folo: astizi si in tchnologiile ADN recombinant (vezi capitolul 5) pentru obfinerea unor molecule de ADN ‘complementar feta de ARNm exiras din celule; in fond, acest ADNe reprezint& gena (mai exact partea ‘codanta) pe baza cireia se va sintetiza ARNm gi apoi proteina corespunzatoare. ©) Replicarea $i repararea ADN proprietate esentiala a ADN este capacitatea dea servi ca model (matriti/tipar) pentru replicarea sa si sinteza a dova noi molecule, idersice informa- Final intre cle $i en molecula initial, Pentru aceasta, cele dova catene ale ADN se desfac si fiecare cateni servesle ca matrifd pentru aranjarea secventiald yi complementard a deroxivibonucleo- tidelor. Prin polimerizarea lor, se formeaza o catend snout” care reface impreun’ cu cateaa ,veche” © molecula de ADN (vezi figura 1.1). Replicarea semieonservativa a ADN (vezi capitolul 6.A) este cheia ereditdji: un organism parental transmite prin gamefi oreplicd a ADN-ului su primei celulea descen- Genfilor. Astfel, prin replicare, informasia ereditara se perpeiueazd in mod stabil in cursul generatiilor. Uneori, in cursul replicdrii se pot produce erori, rin imperecheri gresite (necomplementare) ale nucleotidelor (de tipul C-C, A-G sau A-C), Ele ar putea produce o modificare a informatiei genetice, acl mu ar interveni un mecanism enzimatie de , re- parare"; pe baza catenei matrifa, acesta corecteazi erorile de replicare (vezi capitolul 6.4.4). 2. Structuri alternative ale ADN Forma clasiea a structurii ADN, descrisa de Watson si Crick, corespunde conformafici de tip B, care se realizeazi freevent in vivo (in conditii de umiditate erescuti. $i concentratie ionicd joast). Au fost descrise insé si alte conformatii sau kzoforme: 4 si C. Ele au acelasi plan general de structurd: elice dubli orientata spre dreapta, dar se deosebese de tipul B printr-o serie de particuleritai fizive (inclinarea bazelor fai de ax, modificarea pasului elicei gi numrul de baze per turd clice): forma A este mai scurta $i mai groasa, iar forma C mai lung si mai subtire. in organism, fn anumite rogiuni alo molecule! de ADN (cu oanumita secventé nucleotidied), se produc modificari (tranzitii) conformationale A <> B <> C. ‘Aceste modificiri permit recunoayterea segmentelor respective de citre anumite molecule exogene, care regleazd expresia genelor. in 1979, Alexander Rich si Richard Dickerson descoperi un tip particular de ADN-Z_ sau ADN-senestra. El are 0 molecult dublu elicoidala, orientata spre stanga, care isi pierde simetria caracteristict formei B deoarece axul fosfo-glucidic ia o forma neregulat& in zig-zag, producdnd defor- ‘area si alungirea moleculei de ADN (12 pbpe turd) care va avea un singur fel de incizuri (figura 2.8), Conformatia ADN-Z este o conformatie normald, ce exist in vivo gi apare, in anumite conditii fizico- -chimice, ia regiunile bogate in pereshi de baze G-C; prin metilarea citozinei si acfiunea unci topoizomeraze ‘seproducerotirea bazelor cu 180° si conversia formei Bin Z, tranzigia B <> Zeste insé deseori reversibila. ADNCZ intervine, foarte probabil, in inactivarea unor gene si deci in controlul expresiei informatici genetice. Conversia locala & — Z (mai ales in situ- surile de reglare transcripliei) poate fi realizata prin fixarea msi intensd a histonelor sau a altor mo- Tecule ce produc represia genelor sau prin metilarea citozinei din situsurile GC. De remarcal faptul edn anumite regiuni (cu seevente nucleotidice repetitive) ADN dublucatenar poate for ‘ma structuri non lineare, ramificate cruciform” sau nin ae de par”, ee participt la instabilitatea regiunil 91 favorizeaci mecenismul de amplificare a repetitilor. Deasemenes, prin imperecheriparticulare ale bazelor azolate (de tip Hoogsicen) in special purinice se pot forma structuri sub forma de ,dripla elice” (prin interactiunea unei molecule de ADN dublu catenar cu ‘© molecula de ADN monecatenar sau cu © molecull Figura 2.8, Forme alternative ale structurii ADN (modificat dupa Passarge, 2007)CCapitolul 2: STRUCTURA $1 ORGANIZAREA CELULARK A ADN 31 de ARN), care inhib transcrptia, sau ,fetradete G” (pra plirea uncisingurecstene de ADN i imperecheri intr patru guanine situate in acelasi plan). in finalul acestei prezentari este important de subliniat faptu! c& tranzifia ADN B ¢ Z, ca si modi- fictrile conformationale A <> B <+ C, care apar in anumite regiuni ale ADN (cu o secvenfa special a nucleotidelor), dcmonstreazi elocvent faptul ca mo- Iccula de ADN mu are o structurd fixd, rigidé, inere- menitd. in functie de conditiile de mediu, moleculele ADN sunt flexibile, intr-o permanenta stare dina- mica, deformandu-se neincetat; pe drept cuvant, se ‘poate spune ci molecula de ADN (simbolul viet) ,pul- ‘seazd sau respira”. C. Organizarea ADN in celula 1, Aparatul genetic Structurile celulare care contin ADN (nucleul si mitocondriile) si cele care interyin in realizarea funcfilor sale (ribozomii si centriolii) aleatuiese aparatal genetic. Nucleul este elementul principal al aparatului genetic, centrul de comanda si control al tuturor activititilor celulare. E1 confine circa 99.5% din toatl cantitatea de ADN a celulei. ‘Structura nucleului difer in cele dou’ etape importante ale ciclului de viaya al celulei, intectaza sidivizinnea ari a intea acum in detalii (veri capi- tolul 6.B.1), vom preciza ca interfaza este alcatuita (Ggua 29) din: faza G, — presintetic’, in care ‘romozomii despiralizafi sunt monocromatidioni gi au o singuri molecul’ de ADN, iar confinutul total al ADN este 2C’; faza S—in care se produce sinteza “. U, ). xc + impi a © +s song meager iraqi ‘tuk mice ADIN per eromozom, 46 cromoromni monocroeatidien ‘despite ADN per cromezom eo Figura 2.9, Fazele ciclulul celular gi confimutul de ADN al cromozomilor umani (dupa Stracham gi Read, 1999) 5. C repreztl cantitatea ADN din celulele heploide ADN, prin replicare semiconservativa, si cantitatea, de ADN a celulei se dubleazi la 4C; faca G, ~ postsintetic’, in care cromozomii despiralizati sunt bicromatidieni, fiecare cromatida find alcanuita dintr-o singuri moleculi de ADN. La inceputul diviziunii cromozomii se spiralizeaz, se condenscazi, si devin vizibili la microscopul optic. Incursul mito- zei sc produce, prin disjunctie (separare) eromati- diana, distribujia (segregarea) egala yi totald a ‘materialului genetic dublat in faza 8. Nacleul interfazie este delimitat a exterior de (0 membrand lipidica dubla, Foita extern’ a mem- branei nucleare se continu cu membrana reticu- lului endoplasmic, in timp ce foifa interna vine th contact cu nucleoplasma gi este cAptusita cu mole- cule de laminina A si B. Membrana prezinté nu- ‘merosi pori, constituifi din complexe proteice care facliteaza schimburile nucleo-citoplasmatice, fn in teriorul nucleului se alld un nucleoschelet (matrice nucleard), cromatina, nucleoplasma siunul sau mai multi nucleoli (organite implicate in formarea ribozomilor). Matricea nuclear este consttutS dint.o refea fibrils: +a complex, formaté din proteine gi ARN. Proteinele cu rol structural (actin, citckeratine, laminine, vi menting) constituie un’ yschelet intuanuclear”, ce permite atasarea ordonati.a moleculelo: de ADN (prin intermediul zonelor de heterocromaiind), ceca ce rmenfine forma sferick a nacleului;alteproteine au un ro] functional, participind la realizarea/reglarea funcfilor ADN, Mutapile ce modifica acesteproteine (Gx special laminina) produc diferite boli (eucodistro- fia avtozemal dominant’, distrofia musculard ‘autozomal dominanta Emery-Dreifuss, lipodistrofia portiala de tip 2 sau progeria de tip Hutchinson- Gilford, {in nucleu, fiecare moleculi de ADN se asociazit cu proteine histonice, nehistonice si mici cantitayi ée ARN, formand un complex nucleo-proteic nu- mit cromatina. Interactiunile dintre ADN 1 pro- ‘eine (inca insuficient elucidate) au un rol structural fundamental in organizarea supramoleculard a