21 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ANTRAXULUI SI INFECTIILOR CU BACILI ANTRACOIZI 21.1. DATE GENERALE 21.1.1. © minidefinitie Genul Bacillus reuneste bacili tipic grampozitivi in culturile tinere, majoritatea speciilor sunt mobile cu flageli peritrichi; neacidorezistensi. Produc spori foarte rezistenti, iar sporularea nu este represata prin expunere la aer, uneori find chiar stimulata. Catalazopozitivi. Aerebi sau faculiativ anacrobi. Au activitafi biochimiee foarte diverse. 21.1.2. Repere taxonomice Genul Bacillus face parte din familia Bacillaceae, care mai cuprinde si bacilii gram- pozitivi sporulati anacrobi reuniti in genul Clostridium (vezi capitolele 22—24), Dintre numeroasele speci de Bacillus, interes pentru microbiologia medical prezinta Bacillus anthracis, specie zooantropofila, agentul ctiologic al antraxului, si speciile asemandtoare morfologic, pe care le numim generic bacili antracoizi. Toti bacilli antracoizi pot contamina ocazional prelevatele patologice, iar In conditii particulare uni determina imbolnaviri. De aici interesul pentru identificarea corecta a acestor bacili si precizarea semntficayiet lor in prelevatele patologice. 21.1.3. Habitat Cele mai multe specii sunt larg raspindite in natura, dar din cauza rezistentei sporilor, izolarea lor intr-o circumstanta sau alta nu fine in mod necesar de habitatul natural. Bacillus anthracis este un patogen al unor animale si al omului. B. thuringiensis si alte speci sunt patogene ale insectelor. Multe specii le gasim in apele de suprafata, in sol si excrementele omului sau ale variatelor animale; sunt implicate in degradarea alimentelor contaminate, iar unele determina toxiinfectii alimentare sau sunt accidental patogene. Cateva specii sunt termofile facultative (B, subtilis 5. a.) sau obligate (B. stearotermophilus) 21.1.4, Factori de patogenitate Cel mai frecvent patogenitatea acestor bacterii este codificata plasmidic. B. anthracis produce o capsuld (factor antifagocitar) , codificata de plasmidul pXO1, $1 0 toxina com- plex, codificata de plasmidul pXO2. In toxina B. anthracis sunt identificate tret com- 204ponente: factorul edematogen (FE), factorul letal (FL) si antigenul protector (AP). Fixarca B. anthracis pe celulele cucariote se face prin AP, care recunoaste receptorii membranari sspecifici si permite astfel patrunderea in celula a componentelor toxice propriu-zise FE si FL. Anticorpii anti-AP previn fixarea bacteriei pe celula si impiedica astfel efectul toxic al complexului. B. cercus produce 0 toxind emetizanta, 0 enterotoxind diareigend, dour hemolizine si fosfolipaze. Penicilinaza produsi de B. cereus interfereazA tratamentul cu acest antibiotic al infectiilor mixte, in care se asociazA, chiar in calitate de simplu organism de colonizare, Factorii de patogenitate ai altor bacili antracoizi implicati ocazional in infectii umane nu au fost inca identificati cu certitudine 21.1.5. Receptivitatea la infectiile cu Bacillus Receptivitatea la antrax este generali, dar infectia apare mai frecvent ca boals profesional (vezi mai jos) Toxiinfectii alimentare dup muhtiplicarea B. cereus, B. licheniformis si B. subtilis apar prin consumul de alimente in care aceste specii se multiplica in cantitagi de peste 10° UFC/g. Alte infectii cu bacili antracoi2i au fost semnalate la pacienti imunocompromisi sau debilitati (aloooliei, diabeticiy, Uneors, probabil, isi mitifesta poleutialul patogess tt asociatii sinergice cu alte bacterii. B. cereus poate avea si rol patogen primar, cind infec- teaz4 plagi, mai ales plagi oculare. 21.1.6. Infectiile determinate de speciile genului Bacillus Antraxul, in raport cu poarta de intrare, are trei forme clinice: cutanata, pulmonar’ si digestiva, 1 Antraxul cutanat este forma cea mai frecventa a bolii la om. La poarta de intrare, chiar gi fa 0 simpla abraziune, apare inifial 0 papula, care evolueaza rapid In vezicula si pustuld pe un fond de edem pronunjat, dar nedureros. Leziunea se uleereaza si se acopera cu o crusta neagra, asemandtoare carbunelui antracit (de unde si numete boli. Progresiv edemul se accentueaza, crusta se extinde si in jurul ei apare 0 coroana de vericule. Limfadenita regionala insoteste leziunea locald. Mai frecvent afectate de antrax sunt zonele cele mai expuse contaminarii (maini, fafa, ceafa), in special la ingrijitorit de animale, tabacari etc. = Antraxul pulmonar apare dupa inhalarea sporilor de B. anthracis de catre lncratorii din industria lanii, blanurilor, fainii de oase sau dupa folosirea lor ca arma bacteriologica. Evolueazi ca 0 pneumonic complicata precoce cu mediastinita extrem de grava. = Antraxul digestiv, forma wzuala la animale, la om apare rar dupa consumul carnii de la animalele boinave de antrax insuficient prelucrata termic, Evolueaza ca o enterocolita hemoragica, toaiva. Toate formele de anirax pot evolua septicemic, iar meningoencefatita cdrbunoast este 0 complicatie posibila si mortala In afara de toxiinfectii alimentare, bacilii antracoizi determina infectii locale (e. ale plagilor, oftalmite, pneumonii, pleurezii) sau sistemice (e. g. bacteriemii, septicemii, endocardite, meningite, osteomielite). Mai frecvent este implicat B. cereus, urmat de B. licheniformis, B. subtilis si exceptional de alte speci 20521.2. INVESTIGATIA ETIOLOGICA A INFECTIILOR DETERMINATE DE SPECII DIN GENUL Bacillus 21.2.1. Diagnosticul microbiologic Diagnosticul antraxului este rezervat laboratoarelor specializate, care pot asigura conditiile de securitate microbiologica necesare: e. g. laboratorul Centrului Republican de Igiend si Epidemiologie, 2.2.1.1. Prelevate patologice Suspiciunea de antrax impune precautii deosebite ta prelevarea si transportul probelor, pentru a preveni contaminarea personalului si colectivitijii. In raport cu forma clinic, se preleva: exsudate din carbunculul cutanat, aspirat din edemul local si ganglionii regionali, sputa, materii fecale, hemoculturi, lichid cefalorahidian, probe necroptice. Cand se impune, necropsia va fi executati cu precautie maxima, deoarece dupa deschiderea cadavrului, In contact cu aerul, B. anthracis sporuleaz’. In infectiile cu bacili antracoizi prelevatele sunt foarte variate: de la alimente, vvarsatura si materi fecale tn toxiinfectile alimentare, la exsudate din plagi, sputd, exsudat pleural, sange etc., In funcjie de localizarea infectiei 21.2.1.2. Microscopia directa Microscopia dirceti orienteaz’ rapid diagnosticul, Se efectueaza pe frotiuri sau amprente de organe colorate cu albastru de metilen policrom si Gram. In caz de antrax se observa printre celulele inflamatorii sau tisulare bacili mari de 4—10 zm/1—1,5 um, cu capetele retezate, dispusi izolat, in perechi sau streptobacili (cu aspectul tulpinii de bam- bus), grampozitivi, capsulati si nesporulati. Prin coloratia cu albastru de mctilen poticrom capsula se observa mai bine, colorata metacromatic in roz, ca un invelis continuy in jurul bacililor inlantuiti. La pacientit cu antrax cutanat microscopia prin coloratii uzuale este pozitiva numai in stadiul precoce al boli Bacilii antracoizi apar in prelevatele patologice cu caractere microscopice asemanatoare B. anthracis. De aceea decisiva pentru identificarea microscopica rapidd a B. anthracis in prelevatele patologice este colorajia imunofluorescenta, 21.2.1.3. Izolarea $i identificarea Etapa 1. Prelevatele patologice se epuizeaza pe cate 0 placa cu gelozé nutritiva si cu xelozi-sange, cu incubare aeroba peste noapte la 37°C. Hemoculturile se Insmanteaza in bulion glucozat, Prelevatele hipercontaminate (materii fecale, alimente, probe accroptice de la cadavre in putrefactic) sc epuizeazd pe un mediu selectiv corespunzator speciilor urmarite. E. g. pentru B. anthracis gcloz’ cu polimixina B, lizozim, EDTA si acetat de taliu; pentru B. cereus medii cu polimixina B si clorura de litiu etc. Etapa II. Se urmaresc coloniile suspecte. Coloniile de B. anthracis sunt mari, rugoase, cu aspect de sticlA pisata, nehemolitice, cu circumferinga neregulata, care, examinata la stereomicroscop (10X), apare inconjurata cu prelungiri laterale ondulate (sin coamé de leu» sau «in cap de meduzao), datorate dispunerii streptobacililor in lanjuri paralele. Particulara coloniilor de B. anthracis este stenacitatea»: marginea coloniei ridicata usor cu acul de inoculare ramane erecta ca albuyul de ou bine batut spums. 206In general, bacilii antracoizi formeaza colonii hemolitice. Coloniile de B. cereus sunt asemanatoare cu cele de B. anthracis, dar lipsite de stenacitate» si fara crestere de lanjuri laterale. Coloniile de B. subtilis sunt mari, tind sa invadeze suprafata mediului insuficient uscata. Rotunde sau neregulate, opace, devin progresiv zbarcite si se coloreaza in crem sau brun. B, licheniformis formeaza colonii opace, rugoase cu periferia «in cap de meduzio, puternic aderente de mediu. Progiesiv se avoperd us subslania mucoasd 51 devin: brane. Etapa I11. Se identificd izolatele pe baza urmatoarelor caractere: a) Microscopice. B. anthracis, B. cereus $i B. licheniformis se dispun in lanturi si au spor oval, central, care nu deformeaza bacilul. B, subtilis apare rar in lanjuri. B, anthracis este imobil, bacilii antracoiai sunt mobili by Aspectul culturii i bulion. B. anthracis formeaz un depozit floconos eu super- natantul clar, B. cereus tulburd uniform mediul cu un depozit usor de dispersat, 8. subclis creste sub forma de pelicula increfita cu mediul subiacent clar. B. licheniformis formeaz& tun depozit mucos eu supernatant clar. ©) Aspectul culturii in coloana de gelatina nutrtiva insamanjata prin intepare. B. anthracis lichefiaza gelatina cu aspectul de brad rasturnat cu varful in jos. Bacilii antracoizi pot lichefia gelatina, dar cu aspecte de erestere diferite: infundibuliforma (B. cereus), de sfecla (B. subtilis) @) Cresterea pe mediul cu etilendiaminotetraacetat (EDTA) - polimixinalizozim. B. anthracis creste, bacilii antracoizi nu cresc. ©) Sensibilitatea la fagul y anti-B, anthracis, f) Testul colierului de perle. Se cultiva tulpina de testat la 37°C pe geloz’ nutritive cu 0,5—1 UI penicilin’, Se examincaza cu marire de 100X frotiuri din cultura de 6—8 ore. Numai B. anthracis formeaza in aceste conditii lanturi de forme globulare. ®) Patogenitatea pentru soareci. Dupa injectarea culturii la soareci, B. anthracis determina infectie septicemicd mortala in 1—3 zile si poate fi observat cu morfologia caracteristica pe frotiuri din sange si amprente de splina. Bacilii antracoizi sunt avirulenti pentru soareci. Aparitia tulpinilor de B. anthracis rezistente la penicilina obliga la efectuarea an- tibiogramei, test necesar si pentru bacilii antracoizi implicati in infectii locale sau sistemice. Izolarea prin infectarea soarecilor sau cobailor. Este 0 metodii sensibila indicati pentru prelevatele hipercomtaminate (sputa, materii fecale, sol etc.), care sunt injectate subcutanat. Dupa 48 ore (pana la 15 zile de supraveghere) animalele infectate cu B. anthracis mor prin septicemie: vezi mai sus patogenitatea experimentala. Implicarea bacililor antracoizi in toxiinfectiile alimentare poate fi demonstrata cand 1i izolam in cantitari mai mari de 10° UFC/g aliment sau cand aceeasi specie si acclasi serovar sunt izolate din aliment gi din fecalele bolnavilor, dar sunt absente in fecalele martorilor (persoane din acceasi colectivitate care nu s-au imbolnt Semnificatia bacilitor antracoizi izolati din prelevatele necontaminate (c. g. sange, lichid cefalorahidian cic.) este clara. Prezenta lor in prelevate contaminate (ec. g. exsudate din plagi) trebuie interpretata prudent. 207Etapa IV. Se analizeaza, se interpreteaza si se redacteaza buletinul de analiza: e. g. «Din ... am izolat B, anthracis» sau «Am jzolat Bacillus...» (cu precizarea speciei antracoide semnificativa clinic). 21.2.2. Diagnosticul prin metode imunologice Intratermoreactia cu antraxina (extract complex proteinopolizaharidonucleic obtinut do E. Sleahov din tulpina vaccinanta de B. anthracis) depisteazh o sensibilizare dc tip intarziat, In 1/3 mijlocie a antebrafului se injecteaz’ intradermic 0,1 ml antraxina si se citeste efectul dupa 24—48 ore. O papuld infilirativa cu diametrul peste 8 mm, in absenta reactici la antebraful martor, semnifica reactie pozitiva, prezenta la fosti bolnavi si la vaccinat {gnosticul retrospectiv al antraxului la cadavre, in picile animalelor etc. poate fi stabilit prin reactia termoprecipitinelor descrisa de Ascoli. Se extrage antigenul termostabil al B, anthracis prin fierberea timp de 10—45 minute a probei suspecte omogenizate in solujie saling izotona. In tuburi de precipitare se pipeteazd, fart a amesteca reactivi, filtratul absolut transparent al extractului antigenic si ser anticarbunos. Aparitia unui inel opac de precipitare la limita dintre reactivi indica o reacfie poritiva: prezenfa antigenului Cirbunos in proba examinata. Un martor pozitiv (antigen carbunos + ser antic&rbunos) si unul negativ (Solutie salina izotona + ser anticirbunos) trebuie si valideze speciticitatea reactici, 21.2.3. Biopreparate utilizate in diagnosticul, profilaxia si tratamentul specific al antraxului = Bacteriofagul y anti-B. anthracis. Ser imun precipitant pentru reactia Ascoli, = Antraxina (exiractul antigenic din tulpina vaccinanta de B. anthracis), pentru depistarea sensibilizarii specifice prin i.d.r. = Vacein via atcauat: susponsic liofilieata de sport ai tulpiaii atenuate de, anthracis = Imunoglobulind umand hiperimund anti-B. anthracis.