Imunoglobuline: structura si functie Primele dovezi asupra faptului ca anticorpii se regasese intr-o anumita particulara fractiune a serului au aparut in 1939, cand Tiselius si Kabat au imunizat iepuri cu Ovalbumina, Serul animalelor a fost impartit in doua si a fost supus electroforezei Electroforeza proteinelor serului permite separarea acestora in 5 fractii majore: albumine, al-, a2-, B- si y-globuline. Diferentele de migrare ale proteinelor in cémpul electric sunt datorate sarcinilor electrice distincte, marimii si greutijii moleculare ale moleculelor, dar si unor caracteristici ale ‘mediului de migrare (in principal pH) sau unor condifi fizice (de ex. temperatura). Benzile de migrare de la nivelul gelului vor putea fi ulterior colorate, iar scanarea densitometrici a acestora va permite transformarea patter-ului benzilor in grafice caracteristice (electroforegrame), ceea ce permite cuantificarea fiecdrei fractii proteice. Intensitatea marcérii/grosimea benzii determina dimensiunea varfului reprezentat in grafic, iar aceasta reflect concentratia fractiei respective. ® 03° mans a © ® ee e co maa e 7 p? maa so Conversia benzilor obtinute prin electroforezi in varfuri caracteristice. A. electroforegrami normal; B. gammopatie monoclonal; C. gammopatie policlonali; D. inflamatie eronica. Tratarea serului cu antigenul a condus la formarea unui precipitat, iar apoi, serul restant a fost, supus electroforezei, constatandu-se scaderea exclusiva a fractiei y. Concluzia a fost ca in aceasta particulara fractie se regasesc moleculele specifice pentru antigen, care au fost denumite imunogobuline, pentru a le distinge de alte proteine care s-a incadra in aceeasi fractie electroforetica. Majoritatea isotipurilor de imunoglobuline se regisesc in fractia y a serului, Gammopatiile policlonale sunt caracterizate de benzi largi, difuze si intens colorate la nivelul fractiei y, cea ce reflect o crestere a cantititii de imunoglobuline cu diferite isotipuri si specificititi (C). Aceste molecule sunt secretate de plasmocite diverse i reprezintd, cel mai adesea, rezultatul stimularii antigenice cronice de catre diversi patogeni (D). Aparitia unui varf ascuit in regiunea y-globulinelor din electroforegrama este sugestiva pentru prezenta unei gammopatii monoclonal. O astfel de proteina apare ca o consecinfa a proliferarii necontrolate (in dauna altor clone de limfocite B) a unei singure clone de limfocite, care s-au diferentiat in celule secretante de anticorpi. in majoritatea cazurilor, stimulul nu este unul antigenic, cel mai adesea fiind vorba de o afectiune maligna B (B), * Proteinele sunt substanfe amfotere, astfel cd, in functie de pH-ul mediului, se pot comporta ca baze sau acizi, ceea ce se reflectd si asupra sarcinii lor electrie. intr-un tampon de migrare alcalin de exemplu, proteinele vor avea caracter acid si o sarcind electric negativ’,Structura Molecula cel mai intens investigata in studiile de structura a fost IgG1, considerata a fi smolecula prototip”, cea mai bine reprezentata din pune de vedere cantitativ si care se gaseste exclusiv sub forma de monomer. Fiecare astfel de monomer este format din doua lanturi usoare (Light - L) identice eu o GM de aprox. 25 kDa si doua lantuti grele (Heavy — H) identice, cu GM de aprox. 50 kDa. Fiecare lant usor este legat de un lant greu prin intermediul unei legaturi disulfidice inter-lant, o legatura covalenta foarte puternica, la care se adauga a combinatie de legaturi ne-covalente cum ar fi legaturi hidrofobe, legaturi de hidrogen ete. Intre cele doua lanturi grele se gasesc legaturi similare. Studii enzimatice Intelegerea structurii acestei molecule a fost posibila ca urmare a experimentelor de digestie enzimatica. Rodney Porter si Gerard Edelman au fost rasplatiti cu premiul Nobel in 1972. Pentru inceput, fractia y a serului a fost separata intr-o fractie cu greutate moleculara crescuta si una scazuta, Ambii s-au concentrat asupra fractiei cu GM scazuta, Astfel, Porter a clivat ‘molecula pentru o perioada scurta de timp cu papaina si a separat doua fragmente. Desi are, in general, o activitate proteolitica nespecifica si ar putea sa cliveze intreaga molecula de IgG, tratamentul de scurta durata conduce doar fa clivarea legaturilor mai susceptibile. In urma acestui tratament au fost obtinute doua fragmente identice cu 0 GM de 45 kDa care isi pastreaza activitatea de legare a antigenului si care au fost denumite Fab (fragment antigen binding) si un fragment de 50 kDa denumit Fe (fragment crystallizable) deoarece, in urma pastrarii peste noapte la temperatura scazuta, cristalizeaza. Disulfide bonds Fab), Hehain Pepsin digestion | Fe ters Papain ier ‘Mercaptoethanol aan SH L chain ae SH Fe SH HchainAlfred Nissonof a utilizat pentru digestie pepsina, cu care a separat un fragment de 100 kDa compus din doua fragmente Fab si care a fost denumit F(ab’):. Spre deosebire de fragmentele Fab, F(ab’)2 era capabil sa precipite antigenele. In urma scindarii cu pepsina nu a putut fi separat un fragment de tipul Fc, deoarece acesta a fost digerat in multiple fragmente. Edelman a disociat molecula prin reducerea legaturilor disulfidice inter-lant. Porter a redus si el molecula cu mercaptoetanol si a alchilat-o, un tratament chimic care reduce ireversibil legaturile disulfidice. Apoi, proba a fost analizata prin cromatografie pe 0 coloana care separa moleculele in functie de marimea lor si au fost identificate astfel doua lanturi de 50 kDa si doua lanturi de 25 kDa, denumite H si L. Ramanea de facut legatura dintre rezultatele scindarii enzimatice si lanturile obtinute prin distrugerea legaturilor disulfidice. Tot Porter este cel care imunizeaza capre, fie cu fragmente Fab umane, fie cu fragmente Fe. Anticorpii anti-Fab s-au dovedit capabili sa reactioneze atat cu lanturile H cat si L, in timp ce anticorpii anti Fc nu recunoasteau decat lanturile H. Aceasta observatie a condus la concluzia ca fragmentele Fab constau dintr-o portiune de lant greu si lant usor, in timp ce fragmentul Fe contine doar componente ale lantului grew. In urma acestor rezultate, Edelman si Porter au propus modelul care a devenit atat de cunoscut, cel al moleculei alcatuite din doua lanturi H identice si doua lanturi L identice, unite prin legaturi disulfidice. Studii de seeventiere Debutul a fost foarte dificil datorita faptului ca nu existau cantitati suficiente de proteina perfect omogena. Secventierea a devenit posibila doar atunci cand au fost descoperite mieloamele, o malignitate a plasmocitelor. Daca in mod normal 0 astfel de celula reprezinta un stadiu final de diferentiere, un plasmocit malign este o celula care scapa mecanismelor de control si, ca atare, se poate divide in continuare fara sa fie nevoie de o stimulare antigenica. Anticorpii produsi de aceste celule maligne sunt, din punct de vedere structural, identici cu cei normali; sunt denumiti insa proteine mielomatoase pentru a se preciza sursa lor. La un pacient cu mielom, cca, 95% dintre anticorpii serici pot fi reprezentati de proteina mielomatoasa. La multi pacienti, celulele miclomatoase secreta de asemenea lanturi usoare in exces — descoperite initial in urina acestor pacienti si denumite proteine Bence-Jones (dupa medicul american care le-a evidentiat). Miclomul poate apare nu doar la om ci si la animale, de ex. la soareci, atat in mod spontan cat si indus prin injectarea de ulei mineral (mineral oil) in cavitatea peritoneala. Clonele de plasmocite maligne care se dezvolta sunt denumite plasmocitoame si sunt denumite MOPC (mineral oil plasma cells). Secventierea lanturilor usoare data ce compararea secventelor de aa ale diferitelor proteine Bence-Jones, provenite de la diversi indivizi a fost posibila, s-a constatat ca existau diferente importante intre ele la nivelul jumatatii situate catre capatul N-terminal. Aceasta regiune a fost denumita ca atare ,regiune variabila”. In schimb, portiunea situata catre capatul C-terminal, a fost denumita regiune constanta, avand doar doua tipuri de secvente de baza, ceea ce a condus Ia identificarea a doua tipuri de lantuiri usoare: k si 2. La om, cca 60% dintre lanturile L sunt de tip k, in timp ce la soarece cca 95% dintre lanturile L sunt k. O anumita molecula de Ac nu le poate contine pe amandoua, fie ambele sunt de tip k, fie de tip 2. Seeventele de aa ale lanturilor 4 prezinta cateva diferente minore, la nivelul catorva aa, pe bbaza caror sunt impartite in subtipuri: la sorece sunt 3, ar la om sunt 4, Secventierea lanturilor H Pentru studiul lanturilor H, proteinele miclomatoase au fost reduse cu mercaptoetanol si alchilate, iar apoi lanturile H au fost separate prin filtrare pe gel intr-o solutie de denaturare.Cand a fost comparata secventa in aa, a aparut un patter similar ca cel al lanturilor L: partea N-terminala, formata tot din cca 110 aa prezenta o variatie importanta a secventei si a fost denumita regiune variabila. Restul lantului prezenta 5 tipuri de secventa de baza, corespunzatoare a 5 tipuri de regiuni constante ale lanturilor grele (jt, 8, y, €, «). Fiecare din aceste tipuri de lanturi grele defineste un «isotip». Lungimea regiunii constante este de cca 330 aa pentru 8, y si a si de cca 440 aa pentru p si ¢. Lanturile grele ale unei anumite molecule de anticorp determina clasa acelui anticorp. Fiecare clasa poate folosi oricare tip de lant L. © singura molecula de anticorp prezinta doua lanturi H identice si doua lanturi L identice, Diferente minore ale secventei de aa ale lanturilor grele @ si y a condus la impartirea suplimentara in subclase. La om exista doua subclase de lanturi o. si 4 subclase de lanturr y. @ Heavy chain Light chain w.7.0.8, or € work coo- coo- Structura Ig este determinata de organizarea primara, secundara, tertiara si cuaternara a proteinei. Structura primara — secventa liniara de aa, permite impartirea lanturilor in regiuni variabile si constante. Structura secundara este formata prin plierea (folding) lantului polipeptidic in straturi (foi) pliate. Lanturile sunt pliate intr-o structura tertiara care conduce la formarea de domenii globulare, care sunt conectate la domeniile invecinate prin continuarea lanturilor polipeptidice in afara foilor B pliate. In final, domeniile globulare ale domeniilor grele si usoare adjacente interactioneaza si creaza structura cuaternara, formand domenii functionale care permit, printre altele, Ig-nei sa lege specific un anumit Ag.Domenii Analizele de structura au demonstrat ca atat lanturile L cat si H contin o serie de unitati homologe de cca 70-110 aa, In cadrul fiecarei astfel de unitati, denumita domeniu, exista 0 legatura disulfidica intralant, care creaza o bucla de cca 60 aa. ) Secventele de aa ale domeniilor nu sunt identice dar sunt similare si genereaza o forma particulara in spatiu. Lanturile L contin un domeniu V si unul C; lanturile H contin un domeniu V si3 sau 4 domenii C, in funetie de clasa Ig-nei. Analiza cristalografica a aratat ca domeniile Ig-nelor se pliaza de o maniera caracteristica, conducand la o structura compacta. Aceasta consta din doua straturi opuse, alcatuite din foi 6 pliate, unite intre ele prin «bucle de conexiunen, avand diferite Iungimi. Foile B pliate din cadrul unui strat sunt stabilizate prin legaturi de hidrogen care leaga gruparile NH dintr-o foaie cu gruparile carbonil din foia adjacenta. Foile i pliate sunt caracterizate prin aa hidrofobi si hidrofili alterativi, ale caror catene laterale sunt dispuse perpendicular pe planul stratului. Aminoacizii hidrofobi sunt orientati catre interior, iar cei cei hidrofili catre exterior. Cele doua straturi opuse sunt stabilizate prin interactiuni hidrofobe si prin intermediul legaturii conservate disulfidice intralant.i strand arrangement Disulfide bond HV Fegions Aceasta alcatuire a domeniului globular contribuie la structura cuatemara, facilitand interatiunile necovalente dintre domenii, prin intermediul fetelor alcatuite din foi pliate. Astfel de interactiuni se formeaza intre straturi identice dintre domenii non-identice: Vi-Vix, C.-Cy sau identice: Cy2-Cr2, Crs-Cus- © Hinge region cpr Antigen-biiding site Antigeh-binding sce CCarbohydeateStructura domeniului globular permite de asemenea realizarea unor bucle de conexiune cu lungimi si secvente variable, aspect extrem de important pentru ca tocmai aceste segmente sunt cele care participa la realizarea paratopului Domeniile regiunii variabile Analiza comparativa a unei multitudini de lanturi a condus la realizarea asa numitelor diagrame Wu-Kabat. Acestea au evidentiat ca in cadrul regiunilor variabile, diferentele dintre lanturi se regasesc in fapt la nivelul unor secvente reduse ca intindere, care au fost denumite CDR (complementarity determining region) sau regiuni hiperV si reprezinta maximum 20% din totalul de cca 110 aa al domeniului V. Au fost identificate 3 astfel de regiuni hiperV, atat la nivelul lantului L cat si la cel H. Restul domeniului V prezinta o variatie mult mai redusa ~ aceste portiuni sunt denumite «regiuni cadru». Regiunile CDR sunt de fapt cele care contribuie efectiv la realizarea situsului de interactiune cu Ag-nul si se regasese la nivelul buclelor de conexiune dintre foile f pliate. Regiunile cadru se regasesc la nivelul foilor pliate si actioneaza ca un suport pentru cele 6 bucle. Daca dispunerea spatiala a foilor f pliate este aceeasi pentru toate domeniile, in schimb orientarea spatiala a buclelor difera de la Ig la Ig. Vi domain CDR1 CDR2 ‘CDR3 150, z, 100- 2 = = > 50 0 0 20 40 60 80 100 120 Residue position number Studiile de cristalografie au reusit de asemenea sa documenteze interactiunea dintre anticorpi si antigene dintre cele mai diverse, de la haptene si carbohidrati pana la acizi nucleici, peptide mici sau proteine mari globulare. In sistemul lizozim-anti-lizozim (proteina mare, globulara), s-a evidentiat ca suprafata de interactiune este relativ mare (intre 650-900 A), plata, cu cateva ondulatii. La nivelul unei astfel de suprafete pot lua contact intre 15 si 20 aa. In cazul anticorpilor care leaga antigene mai mici, situsul de legare este mai mic si seamana chiar cu un buzunar. Desi situsul de legare al Ig-nei (paratopul) este format atat din domeniul variabil al lantului HL cat si L, in cazul interactiunii cu anumite Ag pot fi utilizate preponderent CDR-urile lantului H sau din contra, ale lantului L.Studiile de cristalografie au reusit sa mai evidentieze un aspect foarte interesant. De ex., formarea unui complex intre neuraminidaza si anti-neuraminidaza conduce la 0 modificare a orientarii lanturilor laterale, atat ale epitopului cat si ale paratopului. Aceasta modificare conformationala (care nu reprezinta un exemplu izolat) conduce in ultima instanta la 0 mai buna potrivire intre cele doua strueturi. Chiar daca aceasta miscare nu este spectaculoasa, fiind in general de aproximativ 1 A, ea se dovedeste valoroasa din punct de vedere functional. Dupa cum precizam insa, modificarea conformationala nu priveste insa doar anticorpul ci si epitopul antigenului poate suferi acest gen de modificare. Regiunea balama Lanturile y, 8 si c prezinta o secventa peptidica extinsa intre domeniile Cy si Cyo, care nu prezinta homologie de structura cu celelalte domenii si care a fost denumita regiune «balamay. Este bogata in prolina si, ca atare, foarte flexibila, conferind mobilitate celor doua brate. Ca rezultat, Fab poate avea prezenta diferite unghiuri ale bratelor atunci cand trebuie sa se ataseze la un Ag. (a) NO} NO, DNP ligand ®—® ©,N 255 nrrrnrn <> NO; 25. Ag-Ab Trimer Datorita regiunii balama, fragmentul Fab si cel Fe se pot misca practic independent unul de celalalt. Aminoacizii importanti in regiunea balama sunt cisteina si prolina, Prolina ¢ cea care confera si aspectul conformational extins si care face ca regiunea balama sa fie totodata si foarte vulnerabila la atacul enzimatic: aici actioneaza atat papaina cat si pepsina, Cisteinele sunt responsabile pentru legaturile disulfidice dintre lanturile H, iar numarul de astfel de legaturi variaza de la o clasa la alta. Desi lanturile psi ¢ nu au o regiune balama propriu-zisa, prezinta in schimb un domeniu de 110 aa in plus care are caracteristici asemanatoare, desi functia acestui domeniu suplimentar nu a fost pe deplin elucidata, Domenii constante Spre deosebire de regiunea variabila, secventa in aa a regiunii constante demonstreaza 0 variabilitate redusa intre molecule. Este astfel usor de inteles ca varibilitatea este necesarapentru generarea repertoriului receptorilor si este cantonata la capatul N terminal al moleculei, in timp ce partea constanta, situata catre capatul C terminal al moleculei, este destinata altor functii, denumite generic ,biologice” Isotip Diferentele care apar Ia nivelul partii constante a moleculelor de Ig vor genera diferitele isotipuri sau clase. Aceste diferente afecteaza marimea, sarcina, solubilitatea si aspectele structurale ale unei particulare Ig, ceea ce mai departe va influenta compartimentul organismului catre care moleculele de Ig vor fi directionate si cum vor reactiona cu alte molecule, in special receptori. Lanturile usoare au 2 isotipuri, k si A. Diferentele de secventa intre cele doua tipuri de lanturi sunt importante, Pe de alta parte, diferente punctuale de aa au permis impartirea lanturilor umane in 6 subgrupe. Fiecare dintre lanturile usoare se poate asocia cu oricare lant greu, dar 0 anumita celula B nu poate exprima decat unul dintre cele 2 isotipuri. La om, cca 60% dintre limfocitele B produc lanturi k, in timp ce la soarece aproximativ 95% dintre limfocitele B utilizeaza acest isotip. La nivelul portiunii constante a lanturilor grele au fost identificate de asemenea diferente care au permis identificarea mai multor isotipuri sau clase. Cele 5 secvente majore de lanturi grele au fost desemnate cu literele 1, 3, 7, € si a si, in mod corespunzator, clasele de Ig au fost denumite IgM, IgD, IgG, IgE si IgA. La om, variatia suplimentara de la nivelul lanturilor 7 si a condus la identificarea de lanturi yl, y2, 73 si 14, respectiv al si a2 si astfel la a subclaselor IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, respectiv IgA1, IgA2. Lanturile grele 1 si contin cate 4 domenii constante, in timp ce celelalte contin doar cate 3. Totodata, IgM si IgE nu contin o regiune balama clasica si se bazeaza pentru flexibilitate pe interactiunea dintre domeniile Cr. IgD uman si IgGs au o regiune balama particular de lunga, eG «gD, Cooke, \ tinge ean (a) IgA Gimer) Ce IeM cpenamen) age rena Jehan ~