Activarea limfocitelor area limfocitelor T Activarea limfocitelor T naive se realizeaza ca urmare a unei succesiuni bine stabilite de evenimente, iar un singur semnal de activare nu va fi suficient pentru a declansa proliferarea si ulterior diferentierea acestor celule, Pentru inceput, vor fi prezentate conditiile de activare ale limfocitelor Th. 1. Primul semnal de activare, semnalul fiziologic, este reprezentat de catre Ag. Acesta este reprezentat, in fapt, de un fragment peptidic, rezultat din procesarea antigenelor exogene si prezentat in cupa MHC II de pe suprafata unui APC. Singurul APC profesional care poate activa in mod eficient limfocitele Th naive este reprezentat de DC mature, In plus, este nevoie de o interactiune sustinuta intre complexele MHC I/Ag si un numar suficient de molecule TCR. Pentru ca o astfel de interactiune sa poata avea insa loc in mod eficient, este nevoie ca cele doua celule sa fie mentinute in contact si, intr-o prima etapa, acest rol este jucat de moleculele de adeziune. Importanta actiunii moleculelor de adeziune (prezentate mai jos) in mentinerea contactului dintre cele doua celule devine cu atat mai evidenta cu cat datele experimentale atesta ca este necesara 0 semnalizare sustinuta de pana la 30 h pentru a obtine activarea completa a limfocitelor Th naive', In plus, va fi nevoie de legarea a 8 000-30 000 de molecule TCR la cca 50-100 complexe MHC. IAM Teall loam ene endo BIAIBT-2 coe Interfata de contact dintre limfocitele T si APC este denumita sinapsa imunologica sau SMAC (supramolecular activation complex). Limfocitele T incep sa se ,,catere” pe suprafata APC- ului si modificarile scheletului de actina initiate de moleculele de adeziune, vor fi ulterior amplificate cu ajutorul moleculelor co-stimulatoare (la care ne vom referi ulterior). " Stimularea tranzitorie a TCR nu va conduce la activarea ci la inducerea anergiei limfocitelor T.LFA-1 este o integrina, adica o molecula de adeziune care favorizeaza contactul intre celule sau intre celule si matricea extracelulara. LFA-1 se poate lega la moleculele ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) si ICAM-3 (CD50) Moleculele ICAM fac parte din superfamilia Ig-nelor. ‘Nivelul de expresie al ICAM-1 este amplificat de citokine pro-inflamatorii. Logica cresterii numarului de molecule ICAM-1 pe suprafata APC-urilor este aceea de a incetini limfocitele T care exprima LFA-I exact in zona in care ar fi nevoie de o scanare a prezentei antigenului. Legarea LFA-I/ICAM-1 este amplificata dupa semnalizarea prin TCR, stabilizand suplimentar contactul dintre limfocitul T si celula partener. CD2 (LFA-2) este de asemenea un membru al superfamiliei Ig-nelor si este exprimat precoce pe suprafata timocitelor. Functioneaza ca o molecula de adeziune intercelulara, legand cu mare afinitate LFA-3, care apartine de asemenea superfamiliei Ig-nelor si este exprimata pe diverse tipuri celulare, inclusiv APC-uri. Legarea dintre CD2 si LFA-3 stabilizeaza celulele partener astfel incat acestea sa formeze un conjugat (Th-APC sau Te-celula tinta). Formarea conjugatului ofera un timp suplimentar TCR-ului sa scaneze peptidele prezentate de MHC. In plus, in cazul limfocitelor B, legarea LFA-3 de catre CD2 determina cresterea expresiei molecule: CD40 (despre care vom arata ca joaca un rol de co-stimulare in cazul limfocitelor B). Experimente efectuate in anii °90 au aratat ca declansarea unui semnal de catre un limfocit T naiy este posibila atunci cand minimum 3 molecule TCR sunt aduse impreuna, determinand obtinerea unei structuri stabile TCR/CDR/MHC-peptid. Acest model de activare a fost denumit modelul de ,oligomerizare”. Procesul incepe insa practic pe suprafata APC-urilor, cu dimerizarea moleculelor de MHC I, care astfel vor impune legarea a doua molecule de TCR, care apoi vor oligomeriza, proces realizat cu ajutorul domeniilor V«. Ulterior, s-a aratat ca numeroase molecule TCR pot fi angajate succesiv de catre relativ putine complexe MHC-Ag, generand in acest fel o succesiune sustinuta de semnale necesare pentru activarea limfocitelor T naive. S-a estimat astfel ca aproximativ 18 000 - 20 000 de molecule TCR sunt de obicei declansate de catre aproximativ 100 de complexe MHC-Ag, ceea ce arata ca fiecare MHC poate interactiona suecesiv cu aproximativ 180 - 200 de molecule TCR distincte de pe suprafata acelui limfocit T*, ® Moleculele TCR care au fost angajate se asociaza cu agregate fosfolipidice bistratificate (rafts), cu care formeaza astfel platforme pentru recrutarea (si deci aducerea impreuna) si activarea de molecule aditionalePe de alta parte, necesitatea ca o anumita molecula MHC sa poata stimula atat de multe molecule TCR implica faptul ca MHC-Ag trebuie sa se si desprinda foarte repede de TCR ‘odata ce semnalul initial de fosforilare a fost furnizat. Aceasta balanta ,,on-off” este deci foarte importanta pentru activare. Daca legarea peptidului antigenic este slaba, disocierea se face mai rapid decat in cazul agonistului uzual si activarea nu se mai produce. Sistemul furnizeaza insa si un paradox, deoarece aceasta inseamna ca un peptid agonist care se disociaza foarte incet, refuzand sa ,elibereze” TCR-ul in timp util, va face ca acel complex MHC-Ag sa nu poata fi folosit in continuare de un numar adecvat de molecule TCR pentru a obtine semnalizarea in serie descrisa mai sus. Moleculele TCR de pe suprafata intregului limfocit T se deplaseaza catre polul de interactiune cu celula partener. In mod similar, pe suprafata APC-ului se realizeaza concentrarea moleculelor MHC I catre zona de membrana care participa la formarea SMAC. In procesul de legare intervin de asemenea si moleculele co-receptor. In cazul limfocitelor Th, moleculele CD4 se leaga la domeniul 82 al MHC Il. Se crede ca efectul este, in primul rand, unul de crestere a aviditatii de legare si astfel de descrestere a vitezei de desprindere a TCR- ului de MHC-Ag. In plus insa, fiecare dintre moleculele co-receptor este asociata, la partea intracelulara, cu protein tirozin kinaze (PTK) din familia src. 2. Semnalul co-stimulator Activarea completa a limfocitelor T va necesita mai departe si semnale co-stimulatorii. Cea ‘mai importanta pereche de molecule din acest punct de vedere este cea formata de CD28 de Pe suprafata limfocitelor si B-7 de pe suprafata APC-urilor. Legarea CD28 este critica pentru tivarea limfocitelor naive, caci, in absenta co-stimularii, angajarea TCR va conduce la apoptoza sau anergie. CD28 este un homodimer, membru al superfamiliei Ig-nelor, exprimat constitutiv pe limfocitele activate sau in repaus, pe aproape toate limfocitele Th si pe aproximativ jumatate dintre limfocitele Tc umane. Odata cu angajarea TCR, expresia CD28 este amplificata rapid, iar celulele ies din faza Go si intra in ciclul celular. In final, efectele legarii CD28 se vor reflecta in secretia de citokine, precum si a receptotilor pentru aceste citokine. Nu in ultimul rand, CD28 induce expresia unor alte molecule co-stimulatorii sau reglatoare, cum ar fi ICOS, 4-IBB si CTLA-4, precum si a moleculei CD40-L, foarte importanta pentru interactiunea dintre limfocitele T si B. (CD28 se leaga cu afinitate moderata la doi liganzi denumiti B7-1 (CD80) si B7-2 (CD86), intre aceste doua molecule existand 0 homologie de structura de doar 25%. Expresia amandurora este amplificata pe suprafata APC-urilor ca urmare a interactiunii cu limfocite T, dar cu kinetici diferite: B7-2 creste rapid si expresia poate fi sustinuta timp de 96 de ore, in timp ce B7-1 apare doar dupa 48 de ore si rezista aproximativ 72 de ore. Ca urmare a interactiunii CD40-CD40L, pe suprafata limfocitelor B va fi amplificata expresia ambelor molecule, in timp ce pe suprafata DC aceasta interactiune (la care se adauga IFNy si GM- CSF) conduce la cresterea B7-1. B7-1 si 2 au functii partial redundante: co-stimulare a limfocitelor T in procesul de proliferare si secretie de IL-2 si IFNy. Angajarea B7-2 va conduce insa la inducerea secretiei de IL-4 intr- © masura semnificativ mai mare decat B7-1, iar aceasta citokina va induce diferentierea limfocitelor Th in limfocite efector Thy. De asemenea, B7-2 va determina cresterea secretiei de limfotoxina @ (cu efecte similare ale TNF — tumor necrosis factor), in timp ce B7-1 favorizeaza secretia de GM-CSF. necesare activarii, Intregul complex membranar format din TCR-ul stimulat de antigen, CD3, molecule de adeziune, molecule co-stimulatorii si alte molecule de semnalizare asociate acestor rafts” formeaza imunosom-ul”,ICOS (inducible costimulator) are o structura si functii similare cu cele ale CD28, dar recent s-a descoperit ca ligandul ICOS (ICOS L), desi asemanator cu moleculele B7, nu poate fi legat nici de CD28, nici de CTLA-4, ci doar de ICOS. Asa cum ii spune numele, ICOS este insa exprimat doar dupa co-stimularea prin CD28. De asemenea, in timp ce CD28 conduce la cresterea productiei de IL-2, ICOS va determina cresterea sintezei de IL-10, 0 citokina importanta pentru diferenticrea limfocitelor B. In paralel, stabilizeaza mARN-ul pentru CDAO0L (asa cum CD28 stabilizeaza mARN-ul pentru IL-2). Se crede ca ICOS este necesar pentru promovarea secretiei de IL-4 si astfel pentru definitivarea diferentierii limfocitelor Th CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated molecule 4°) este un homodimer care are 0 omologie de structura de cea 75% cu CD28, in schimb prezinta o afinitate de legare pentru moleculele B7 de 10-20 de ori mai mare. CTLA-4 nu este exprimat constitutiv ci va apare pe suprafata limfocitelor T dupa legarea TCR. Se crede ca afinitatea crescuta a CTLA-4 pentru B7 face in asa fel incat practic dislocuieste CD28 si blocheaza semnalul activator declansat de aceasta, blocand astfel diviziunea celulara in faza tranzitiei de la stadiul G, la stadiul S. In plus, CTLA-4 poate recruta tirozin-fosfataza SHP-2 la nivel membranar, iar aceasta enzima se leaga la un motiv ITIM (inhibitor) al cozii intracitoplasmatice a CTLA~4, ceea ce va reversa activarea limfocitelor T printr-o cascada de evenimente pe care 0 vom prezenta ulterior. Expresia CTLA-4 este controlata atent, pentru ca este important ca molecula sa nu fie exprimata prematur. Majoritatea acestor molecule sunt retinute in compartimentul Golgi al limfocitului in repaus, iar 1a 2 ore de la legarea TCR-ului, moleculele CTLA-4 sunt reorientate catre interfata cu APC-ul, continuand sa se acumuleze in vezicule pana la 6 ore de la legarea TCR-ului. Iesirea din acest compartiment se va face doar la 48-72 h de la evenimentul activator. oe —@ =sety 187 Family Ligands (0028 Famty Recepers 4 ay ee =: [ Ceeon FT = [ae waaay peo ey ania aes Pre (so) rae PDL-I se leaga la PD-1, exprimata pe limfocite T activate, limfocite B si celulele mieloide. Legarea PD-1 de pe suprafata limfocitelor T conduce la un semnal care blocheaza productia de IL-2 mediata de TCR si astfel blocheaza proliferarea limfocitelor T. Legarea PDL-1 de pe suprafata monocitelor de catre PD-1 de pe suprafata limfocitelor CD4+ activate conduce la secretia de IL-10 de catre monocit CD4OL este un membru al superfamiliei TNFR (receptor pentru TNF). Legarea la molecula CD40 de pe suprafata APC-urilor reprezinta o etapa importanta de pregatire a limfocitelor 3 In ciuda numelui, molecula este exprimata atat de limfocitele Th cat si de cele Te. “ TInhibitorii de PD-1 (Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab) si CTLA~4 (Ipilimumab) constituie subiectii a ‘multiple trialuri clinice, aflate in plina desfasurare, cu rezultate extrem de incurajatoar.naive pentru activare. Tot din familia TNFR mai mentionam moleculele 4-1BB si OX40, cu rol in co-stimularea limfocitelor T. CD27 este un homodimer exprimat de majoritatea limfocitelor Th si Te resting din sangele periferic. Consecinta a activarii antigenice, expresia CD27 este amplificata, Ligandul lui CD27 este CD70, exprimat atat de limfocitele T cat si de limfocitele B ca raspuns la stimularea antigenica. Interactiunea dintre aceste doua molecule pare sa favorizeze procesul proliferativ, fara o influenta majora insa asupra secretiei de IL-2. Se crede astfel ca rotul lui CD27 in activarea limfocitelor T naive este minor, in schimb este important pentru generarea de limfocite T cu memorie, 3. Semnalul 3: citokine Odata ce limfocitul T a primit primele doua semnale activatoare poate acum progresa catre transcriptia a sute de gene necesare pentru a sustine procesele de proliferare si diferentiere. Din punct de vedere al proliferarii, aceste gene au fost clasificate in functie de cat de repede apar produsii lor dupa angajarea TCR. Produsii genelor imediate pot fi detectati in mai putin de 30 de minute, in general, aceste gene codand pentru componenti ai factorilor de transcriptie nucleara, necesari pentru stimularea transcriptiei unor gene precoce sau tardive implicate in proliferare. Produsii genelor precoce sunt detectati in 30 min — 24 h de la stimularea TCR, ineluzand aici IL-2, dar si IL-3, IL-4, IL-5, IFNy, chemokine, factori de crestere, Produsii genelor tardive sunt exprimati dupa 48 h de la stimularea TCR si codeaza pentru noi molecule de adeziune (care permit migrarea in tesuturi) sau factori citotoxici si alte molecule necesare pentru functia efectorie a limfocitelor T. Limfocitele T activate trebuie mai intai sa prolifereze pentru a se putea diferentia in celule cu memorie si celule efector, astfel incat inducerea secretiei de citokine care sustin diviziunea celulara si supravietuirea, precum si expresia receptorilor pentru aceste citokine este critica pentru raspunsul imun. O prima astfel de citokina este IL-2, dar si o serie de alte citokine (in special IL-15°) contribuie la expansiumea clonala a limfocitelor T activate, IL-2 R de mare afinitate este un heterotrimer, format din lanturile a, B si 7. Majoritatea limfocitelor T mature exprima heterodimerul fy. Dupa receptionarea primelor 2 semnale activatorii, expresia IL-2 Ra este stimulata, ceea ce conduce la asamblarea receptorului de mare afinitate. In cazul limfocitelor Th, actiunea IL-2 este una autocrina, absenta citokinei conducand Ia apoptoza, cea ce arata ca in vivo este nevoie de o prezenta continua, sustinuta, a acestei citokine (sau a unei citokine compensatorii). Astfel, limfocitul respectiv poate progresa in ciclul cetular si va prolifera, Transcriptia IL-2 este controlata pe mai multe niveluri. Regiunea enhancer a promotorului genei contine mai multe motive de legare, destinate unor factori transcriptional diferiti (NFAT, NF-KB, AP-1, Oct-I) si transcriptia genei depinde de care astfel de factor transcriptional si care motiv structural vor fi implicate. Calea de semnalizare intracelulara declansata de legarea TCR Rezultatul anagajarii unui numar suficient de molecule TCR si a formarii SMAC este eprezentat de recrutarea de proteine cu rol de transducere a semnalului si activarea unor domenii cu rol de semnalizare din cadrul acestor molecule. In fapt, este vorba despre multiple cai de semnalizare care sunt declansate prin legarea TCR, cai ce se vor interpatrunde (cross- *IL-15 R prezinta doua lanturi in comun cu IL-2 R, precum si o cale de semnalizare comuna.talk si feed-back) apoi cu cele declansate de moleculele co-receptor si co-stimulatorii, La acestea se adauga si moleculele ,adaptor”, proteine non-enzimatice, localizate la nivelul agregatelor fosfo-lipidice (rafts) care permit unor diferite molecule cu rol in transducerea semnalului sa interactioneze fizic intre ele. “ed pore ‘ytokine production ‘Activation of Transcription Factsis [1 Adeptors — ED Enzymes (Transcription factors. Exchangs factors Lanturile CD3 nu prezinta proprietati catalitice intrinseci, in schimb contin motive ITAM si astfel servesc ca substrat pentru fosforilarea aa de tirozina de catre protein titozin kinaze de tip sre cum ar fi Ick si fn. In conditii de repaus, aceste kinaze sunt mentinute inactive ca urmare a faptului ca sunt ele insele fosforilate la nivelul unui anumit particular reziduu de tirozina de la capatul C-terminal. La cateva minute de la legarea TCR, la complexul TCRICD3 se asociaza si molecula co-receptor, la randul ei asociata cu kinaza /ek inactiva, care astfel formeaza un agregat cu TCR si rafts”. In mod similar, fvn fosforilat este recrutat la nivelul lanturilor ¢ ale CD3. Activarea celor 2 kinaze va fi efectuata de catre molecula CD45, o fosfataza cu dimensiuni mari, molecula exprimata pe suprafata tuturor leucocitelor®. © CD45 poate fi exprimata in mai multe isoforme (care rezulta prin splicing alternativ), cu dimensiuni care variaza intre 180 si 220 kDa, in functie de starea de activare a celulei. Isoforma CD4SRO are o greutate moleculara mica, fiind codata de o gena din cate lipsese exonii 4, 5 si 6, la care se adauga un nivel scazut deOdata defosforilate, Ick si fyn se vor activa si vor fosforila mai departe tirozine de la nivelul motivelor ITAM, proces denumit de unii autori ,activarea motivelor ITAM"” si care permite in continuare recrutarea tirozin kinazei ZAP-70 (zeta associated protein 70). ZAP-70 este inrudita cu kinaza syk exprimata de catre limfocitele B, dar este exprimata de catre limfocitele T’. Odata ce ZAP-70 este legata la complexul de semnalizare, kinazele sre o vor fosforila in continuare, activandu-i astfel activitatea catalitica si permitand-i, intr-o prima instanta, sa se autofosforileze. Ulterior, ZAP-70 va determina fosforilarea unor molecule ce fac parte dintr- un complex denumit adaptor si care vor furniza legaturile esentiale catre molecule intermediare ce transduc semnalul TCR si determina reorganizarea citoscheletului de actina. Una dintre cele mai importante molecule care interactioneaza cu ZAP-70 se numeste Vav1, cel putin pentru ca are in componenta un domeniu care se leaga la citoscheletul de actina, Dupa legarea TCR, Vavl si ZAP-70 activate, precum si CD3¢ fosforilate se asociaza cu citoscheletul, determinand coalescenta raft-urilor si asamblarea SMAC. © alta enzima importanta activata de catre ZAP-70 este fosfolipaza C-y1 (PLC-/l). Recrutarea unui set intreg de molecule adaptor® va permite in final fosforilarea unor tirozine si activarea PLC~y1, care astfel va putea hidroliza un lipid membranar denumit phosphatidyl inositol 4,5 dipshosphate (PIP2) in mesagerii secundari inositol 1,4,5-triposphate (IP3) si 1,2 diacylglycerol (DAG). 1P3 intracelular se leaga la un canal de calciu, determinand eliberarea Ca®™ din depozitele intracelulare din ER, Calciul mobilizat se va lega si va activa o proteina ubiquitara denumita calmodulina, In prezenta unor cantitati crescute de Ca’, complexul calmodulina-Ca”* va activa mai departe o serin/threonin fosfataza denumita calcineurina, Odata activata, calcineurina isi va exercita functia si va defosforila forma citoplasmatica, inactiva, a unor membri ai familiei NFAT, in special NFATe — citoplasmatic. NFAT¢ defosforilat va putea acum sa traverseze membrana nucleara si sa se lege la factorul transcriptional nuclear AP-1, cu care sa formeze-o entitate denumita NFATn — nuclear. Acesta este capabil sa interactioneze cu motive specifice prezente la nivelul promotorilor unor gene precoce, necesare pentru activarea limfocitului T°. Ca’* actioneaza si asupra DAG, care astfel va activa o serin/threonin kinaza numita protein kinaza C (PKC). Una dintre isoformele acesteia (PKC8) va fi recrutata la nivelul raft-urilor si va declansa o cascada de fosforilari ce vor culmina cu activarea factorului transcriptional NF- kB. Acesta este necesar pentru activarea inductiei maximale a transcriptiei de IL-2. Fosforilarea de catre ZAP-70 a proteinei adaptor LAT determina in continuare recrutarea unei kinaze denumita phosphatydil inositol-3 kinaza (PI3K) la nivelul membranei celulei T. PI3K fosforileaza PIP2 si il converteste in phosphatidyl inositol 3,4,5-triphosphate (PIP3), ceea ce conduce la scaderea productici de mesageri secundari (DAG si IP3). Astfel, PI3K inhiba activarea PLC-j1. Totodata, PI3K va actiona asupra altor doua cai implicate in activarea limfocitului T: calea de semnalizare prin p38 si calea SAPK/JNK (stress activated protein Kinase/e-jun N terminal kinase). Prin actiunea sa de fosforilare, PI3K va conduce in final la activarea factorului de transcriptie c-jun, cu rol in activarea transcriptiei uneui set de gene pro- licozilare, Aceasta isoforma este observata in stad tardive de activare si este utilizata pentru a distinge limfocitele T cu memorie. Se pare ca CD45SRO se asociaza mai puternice eu CDA si CD8, ceca ce afecteaza eficienta fosforilari lek si fyn. Ligandul lui CD45 nu este eunoscut inca (daca exista vreun ligand), dat importanta acestui marker pan-leucocitar este subliniata de faptul ea inactivarea CD45 conduce nu doar la blocarea activariilimfocitelor T mature, dar sia dezvoltari timice. ZAP-10 este mentinuta inactiva in limfocitele T resting de catre o trozin fosfataza denumita SHP-1 si care contine un domeniu SH2 similar eu al ZAP-70. * La ZAP-70 se leaga SLP76, apoi GADS si LAT. La aceasta se leagn PLC-y1, iar kinazaitk (din familia Tee inazelor) se leaga la SLP76. Itk va activa PLC-y1 prin fosforilarea tirozinci * NFATa este apoi refosforilata de catre o kinaza din nucleu, GSK3, ceea ce conduce la disocierea NFATe de AAP-I si exportul NFATe inapoi in citoplasma. Ciclosporina A, un imunosupresor, ihiba defosforlarea NEATe si astfel bloch eaza activarea limfocitelor T.inflamatorii, printre care TNF si selectina E. Este foarte posibil ca recrutarea si activarea PI3K sa fie determinate de legarea CD28. Ras este o proteina mica, monomerica, asociata fetei citoplasmatice a membranei celulare si care leaga guanina, Activitatea sa este astfel controlata de statusul de fosforilare a nucleotidelor, de care este responsabil o serie de proteine cunoscute sub numele de GEF (nucleotide exchange factors). Ras-GDP este inactiv si este necesara interventia GEF pentru conversia ras-GDP in ras-GTP. Fosforilarea LAT de catre ZAP-70 conduce la activarea unei astfel de de GEF si mai departe la activarea ras, care va declansa o cascada de serin/threonin MAPK kinaze, ce includ raf, MEK si ERK. Aceasta cascada conduce Ia fosforilarea si activarea a mai multor factori transcriptionali, printre care c-mye si c-fos. Activarea acestor factori conduce la initierea transcriptiei unor noi gene. Angajarea CD28 pare sa scada pragul semnalului necesar pentru activarea limfocitelor T, prin scaderea numarului de molecule TCR care trebuie agregate in SMAC. Experimental s-a aratat astfel ca numarul moleculelor TCR poate sa scada de la un necesar de 8 000 pana la doar 1000-5000, in cazul utilizarii co-stimularii, In prezenta co-stimularii, un limfocit T devine angajat pentru co-stimulare in cca 6 ore, in timp ce in absenta ei are nevoie de cca 30 h. Legarea CD28 la B7 declanseaza fosforilarea reziduurilor de tirozina de la nivelul cozii intracitoplasmatice a CD28 probabil de catre Ick si/sau fn, ceea ce mai departe conduce la recrutarea PI3K, care va genera PIP; si alti mediatori fosfolipidici. CD28 determina de asemenea hiperfosforilarea Vavl. Se va produce o reorganizare a citoscheletului de actina mediata de molecula rac si agregarea raft-urile membranare in jurul complexului TCR/CD3. Aceste raft-uri contin elemente ale cailor ras/MAPK si SAPK/JNK, care vor conduce la activarea factorilor nucleari de transcriptie c-fos si c-jun, care se vor combina pentru a forma AP-1, AP-1 se leaga la anumite motive din promoiorul genei IL-2, determinand stabilizarea mARN-ului IL-2, precum si cresterea expresici genci anti-apoptotice bel-xL. In plus, se crede ca angajarea CD28 contribuie la o reducerea expresiei IKB si astfel la inlaturarea unui reglator negativ cheie al NF-kB. Semnalizarea prin NF-kB contribuie la expresia a numeroase citokine, inclusiv IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, MIP-a sau a receptorilor pentru IL-2, IL-12, a CXCRS. Nu in ultimul rand, nu trebuie uitat ca CD28 contribuie la expresia de alte molecule co- stimulatorii. Molecula CTLA-4 reverseaza activarea limfocitelor T prin defosforilarea CD3¢ si posibil a Ick, fun, ZAP-70, Vav1Il, _Activarea limfocitelor B Odata ce un limfocit B matur naiv ajunge in periferie va supravietui cateva zile, dupa care va intra in apoptoza, Singura sansa de salvare e reprezentata de contactul cu antigenul, mai precis spus de activarea limfocitului. In plus, soarta limfocitelor B va depinde si de natura antigenului pe care il intalneste. Daca antigenul este T dependent si limfocitul B este activat cu succes de catre limfocitul Th cu care interactioneaza, atunci urmeaza proliferarea si diferentierea limfocitului B, astfel incat sa devina capabil sa efectueze hipermutatii somatice si comutarea de clasa. Vor fi produse atat plasmocite cat si celule cu memorie si va fi obtinut un raspuns imun umoral. Daca antigenul intalnit este unul T independent, vor fi generate plasmocite, dar nu se va produce comutare de clasa, astfel incat plasmocitele vor secreta anticorpi de clasa M si nu vor apare celule cu memorie. Daca receptorul celulei B se leaga la un auto-Ag (care nu a fost intalnit in maduva osoasa, in cursul procesului de selectie negativa), acel limfocit B va fi fie deletat prin apoptoza, fie i se va induce o stare de anergie. In mod similar limfocitelor Th, activarea limfocitelor B de catre un antigen T dependent va necesita 3 semnale: 1. legarea antigenului, 2. receptionarea semnalelor co-stimulatorii si 3. receptionarea citokinelor secretate de limfocitele Th. © Amtigen bing © cytokine hep | Activated Beall | call clonal ‘expansion and Dclbea ag Net ws 4 Mulivalentantigen —®—-Phosphete| Semnalul co-activator Daca limfocitele receptioneaza semnalul 1 dar nu si semnalul co-stimulator, devin anergice sau intra in apoptoza. Daca insa sunt fumizate ambele semnale, limfocitele vor deveni capabile sa accepte semnalul 3 (citokinele secretate de limfocitele Th). Doar o celula pe deplin activata va putea progresa catre proliferare si diferentiere si mai departe catre functia efectorie. Inainte insa sa receptioneze semnalul co-stimulator, limfocitul B trebuie sa adere stabil la suprafata limfocitului Th activat de catre antigen. Aceste interactiuni asigura ca cele doua celule sa fie mentinute impreuna suficient de mult timp pentru a obtine activarea completa si reciproca. Cel mai important contact co-stimulator pentru activarea limfocitului B este furnizat de interactiunea dintre molecula CD40 de pe suprafata celulelor B si CD40L de pe suprafata limfocitelor T. CD40 este o glicoproteina exprimata la un nivel inalt pe suprafata celulelor B mature naive, dar nu si pe plasmocite, in timp ce CD40L va fi exprimat doar pe suprafata limfocitelor Th activate. Dpdv structural, CD40 este un membru al superfamiliei TNFR, iar portiunea intracitoplasmatica este asociata cu cu proteinele de semnalizare TRAF2 si TRAF3 (TNFR-associated factor), care, la randul lor, interactioneaza cu factorul transcriptional NF- kB, Interactiunea CD40-CD40L este esentiala la om nu doar pentru activare cat si pentru comutarea de clasa si pentru formarea centrilor germinal. Deficienta in CD40L va conduce la © imunodeficienta in care exista 0 hiperproductie de IgM.Semnalul 3 Legarea antigenului la suficient de multe molecule BCR, CD40 declanseaza inductia expresiei de receptori pentru citokine, in particular IL-4R. Fara legarea acestor citokine cheie, limfocitele B vor suferi o proliferare extrem de limitata. In timp ce unele citokine necesare pentru activarea limfocitelor B sunt secretate de catre macrofage sau DC din vecinatate, majoritatea sunt produse insa de catre limfocitele Th stimulate de catre Ag si care sunt in contact cu limfocitele B. La scurta vreme dupa interventia moleculelor de adeziune si a celor co-stimulatoare, aparatul Golgi este reorganizat in interiorul limfocitelor Th, astfel incat sa ajunga in proximitatea polului de interactiune cu limfocitele B. Eliberarea citokinelor devine astfel mai precisa, mai directionata catre limfocitul B, ceea ce conduce la cresterea eficientei in furnizarea semnalului 3. O astfel de rearanjare a aparatului Golgi nu este observata daca limfocitele B si Th vin in contact in absenta stimularii antigenice. Legarea antigenului specific de catre un numar suficient de molecule BCR de pe suprafata unui limfocit B matur, naiv sau a a unui limfocit B cu memorie, pregateste celula pentru a depasi stadiul Go a ciclului celular catre stadiul G, al blastului. In multe (dar nu in toate) cazuri, legarea IL-4 este evenimentul principal care declanseaza intrarea in acest stadiu. Expunerea continua la IL-4 impinge celula B mai departe in faza $ si induce replicarea ADN- ului, ca etapa premergatoare diviziunii celulare. In aceasta etapa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 si ‘TGF pot actiona pentru inducerea proliferarii limfocitelor B. In timp ce nici o citokina nu este suficienta (in mod individual) pentru activarea celulei B, pe de alta parte, nici una dintre ele nu este esentiala, | % | ecelpt ot signa 3 f o | ‘na penton wats | net0,70F ae Lames, 1 10, TRB O606 --Pe masura ce limfocitele B continua sa se divida, actiunea altor citokine devine importanta pentru inducerea diferentierii celulelor activate in celule cu memorie sau plasmablasti, precursorii imediati ai plasmocitelor. La om, IL-2 si IL-6 induc diferentierea catre plasmocit. Trebuie subliniat ca limfocitele B nu numai ca receptioneaza citokine, dar au si o capacitate limitata de secretie. IL-6 si TNF secretate de catre acestea pot creste efecienta activarii limfocitelor Th, cea ce in schimb creste productia de citokine esentiale pentru sustinerea proliferarii si diferentierii limfocitelor B. B-cell coreceptor cad — eee Antigen CD19 TAPA-L (CD81) \ sy Syk Sp G@Dkinase ~ ab @ N yn? Sre kinases Fyn? Others?