DNA Tools and

Biotechnology

1
DNA Extraction
Tách chiết DNA
 DNA Extraction
• Trong y học, việc thu nhận DNA từ tế
bào là bước tạo ra nguyên liệu cho nghiên
cứu hoặc xét nghiệm

• Nguyên tắc tách chiết và tinh sạch DNA,

RNA có thể khác nhau tùy thuộc vào tính
chất, cấu trúc củng từng loại tế bào
nhưng đều tuân theo quy trình chung:
 DNA Extraction
1. Thu thập lượng tế bào cần
thiết

2. Lần lượt loại bỏ các thành

phần của tế bào như vách (nếu
có), màng TB, màng nhân (nếu
có), các protein,…

3. Tách DNA/RNA khỏi hỗn hợp

dịch tế bào bằng các hóa chất
gây kết tủa.
 Phương pháp Phenol:Chloroform
(Organic extraction)
Bước 1: Phá màng tế bào
• Dùng phương pháp vật lý như nghiền tế bào, mô hoặc
phương pháp hóa học như dùng hỗn hợp chất tẩy
(Sodium Dodecyl Sulfate – SDS) và proteinase
(thường dùng Proteinase K)

• Màng tế bào (và màng nhân ở eukaryote) sẽ bị phá

hủy và giải phóng các nội dung bên trong bao gồm
nhiễm sắc thể và môi trường.

• Các chất tẩy và proteinase còn có tác dụng thủy phân

các protein liên kết với DNA. Sau khi phá màng, hỗn
hợp được ly tâm để loại bỏ các mảnh vỡ của màng.
 Phương pháp Phenol:Chloroform
Bước 2: Loại bỏ Protein
• Hỗn hợp hóa chất phenol:chloroform được thêm vào để
tách protein khỏi DNA.
• Sau khi ly tâm, hỗn hợp mẫu và phenol:chloroform sẽ chia
làm 2 pha là pha nước (có chứa DNA) và pha phenol +
chloroform. Dịch nổi gồm axit nucleic và nước được hút
ra và tiếp tục phân hủy RNA bằng RNAse.
• Nằm giữa hai pha là lớp protein bị biến tính màu trắng
đục
Bước 3: Kết tủa DNA
Thường dùng ethanol tuyệt đối trong môi trường có nồng
độ Na+ cao, nhiệt độ thấp. Tỷ lệ ethanol : mẫu khoảng 2,5:1.
Kết tủa trong isopropanol, tỷ lệ 1:1 (không cần sự có mặt
của muối).Mẫu DNA sau khi kết tủa sẽ được rửa trong
ethanol 70% để loại bỏ muối, sau đó thu nhận lại và sấy khô
 Phương pháp Phenol:Chloroform
Bước 4: Bảo quản DNA.
• Tủa DNA được hoà trong nước (không có nuclease)
hoặc trong đệm TE (Tris-EDTA có tác dụng ức chế
DNase) ở nồng độ DNA mong muốn
• Mẫu DNA thường được giữ ở nhiệt độ +4oC hoặc -20oC

Một số lưu ý thêm:

• Do tế bào chứa rất nhiều RNA nên khi tách chiết DNA
bằng hóa chất, người ta thường sử dụng Rnase để loại
bỏ RNA trong mẫu
• Isoamyl alcohol đôi khi được thêm vào để giảm tạo bọt
và ổn định lớp protein kết tụ (coagulation protein)
(thường ở tỷ lệ 24 phần chloroform với 1 phần isoamyl
alcohol)
Cutting DNA
 Cutting DNA
• Restriction enzymes (enzyme cắt
giới) cut DNA at specific
sequences
• Useful to divide DNA into
manageable fragments

Restriction site
 DNA gel
electrophoresis
(Điện di nucleic
acid qua gel)
 Electrophoresis
• Điện di qua gel agarose hay
polyacrylamide là kỹ thuật dùng trong
phân tách và phân tích các đại phân
tử DNA, RNA và protein.

• Phương pháp này thường được sử

dụng để tách các phân tử nucleic
acid nguyên vẹn, các phân đoạn DNA
tạo thành sau khi phân tử DNA
nguyên bị cắt bằng Enzyme cắt giới
hoặc sản phẩm PCR.
12
 Electrophoresis
• Về nguyên tắc, điện di hoạt động dựa
trên sự tích điện của các phân tử.
• Nucleic acid là phân tử tích điện âm,
khi đặt trong điện trừong, phân tử
nucleic acid sẽ di chuyển về phía cực
dương.
• Việc điện di phân tách các phân tử
nucleic acid kích thước khác nhau sẽ
được thực hiện qua một môi trường
thạch (gel)
13
 Electrophoresis
• DNA can be
separated based on
size and charge
• The phosphate
groups are negatively
charged
• DNA is placed in a
gel and electricity is
run through
14
 Electrophoresis
• Gel được pha chế từ agarose, polyacrylamide
hoặc hỗn hợp agarose-polyacrylamide, khi đông
lại sẽ tạo thành mạng lưới các lỗ.

• Khi di chuyển từ cực âm về cực dương, phân

tử nucleic acid phải len lỏi qua các lỗ đó nên
kích thước phân tử càng nhỏ thì di chuyển
càng nhanh.

• Độ rộng hoặc mật độ lỗ trong gel (phụ thuộc

vào nồng độ agarose hay acrylamide) ảnh hưởng
đến khả năng phân tách các phân tử. Gel 40%
polyacrylamide thường dùng để phân tách các
phân tử DNA có kích thước từ 1 -300 bp. 15
 Hiện vết nucleic acid
trên gel sau khi điện di
• Để có thể thấy được vị trí của nucleic
acid trên bản gel sau khi điện di, người
ta sẽ ngâm bản gel trong hợp chất có
thể gắn với DNA hay RNA (buffer đệm)

• Hóa chất thường dùng là ethidium

bromide (EtBr) có khả năng gắn xen vào
giữa các base của nucleic acid và phát
quang dưới tia tử ngoại.

16
 Hiện vết nucleic acid
trên gel sau khi điện di
• EtBr là thuốc nhuộm huỳnh quang có thể
nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi
kép. DNA nhuộm EtBr được nhận biết
bằng tia cực tím

• EtBr là một chất độc có khả năng gây

đột biến mạnh. Một số thuốc nhuộm
không gây đột biến được phát minh sau
này như: SYBR®Gold, SYBR®Green, and
SYBR®Safe
17
 Hiện vết nucleic acid
trên gel sau khi điện di
• Để ước lượng kích thước và định lượng
tương đối nucleic acid trên gel, người ta
sử dụng các chất đánh dấu trọng luợng
phân tử (molecular-weight size marker –
MWM).

• Đối với DNA, thường sử dụng ”thang

DNA” (DNA ladder), một hỗn hợp nhiều
trình tự DNA đã biết kích thước và hàm
lượng.
18
 Electrophoresis
• Negative DNA moves toward
the positive end
• Smaller fragments move
farther and faster
Electrophoresis

20
Khi một gel được
nhuộm bằng thuốc
nhuộm gắn DNA
và được đặt dưới
ánh sáng tia cực
tím, các đoạn
DNA sẽ phát
sáng, cho phép
chúng ta thấy
DNA hiện diện ở
các vị trí khác
nhau dọc theo
chiều dài của gel