JURNAL ANALIS FARMASI

Volume 2, No. 3 Juli 2017 Hal 214-220

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA

PEMISAHAN AMBROKSOL HCL DALAM SEDIAAN OBAT SIRUP
MEREK X

METHODS VALIDATION FOR LIQUID CHROMATOGRAPHY HIGH

PERFORMANCE ON AMBROXOL HCL SEPARATION IN SYRUP MEDICATION
MERK X

Ade Maria Ulfa1, Diah Astika Winahyu1, Resmawati1

ABSTRACT
Ambroxol HCl was an active metabolit of bromhexin. This substance was
commonly found in expectorant cough mediecine as a mucolythic agent that decreases
the viscosity of mucus. Validation methods by United States Pharmacopeia (USP)
conducted to ensure that analutical methods are accurate, specific, reproducible and
resistant to the range of analytes to be analyzed. The parameters used in this method
validation are linearity, selectivity, accuracy, and precision. The HPLC condition used
was the reversed phase with the OSD column (C18) with a wevelength of 310 nm and
the phase of motion of methanol : phosphate buffer (8:2 v/v), flow rate 1,0 mL/min
with volume injection 4 µg/mL in the validation method of ambroxol HCl shows the
linearity value which is r = 0,996, selectivity of standard solution 6,542 and sample
7,044 not eligible because the retention time difference range is greater than ± 5% ,
precision in the can 1,69 (%RSD) meet the requirements is ± 2% while on the test
the accuracy of the levels obtained are 75-79 % did not meet requirements is 97-103
%. If any of these parameters didn’t meet requirements then re-validation might be
due to conditions of synthesis of the drug, composition and changes in analytical
procedures, other possibilities may also be due to vvarriations in the mobile phase. If
re-validation was not be used for the determination.

Keywords : HPLC, ambroxsol HCl syrup, validation methods

ABSTRAK
Ambroksol HCl merupakan metabolit aktif dari bromheksin. Zat ini banyak
ditemukan pada obat batuk ekspektoran sebagai agen mukolitik yang berfungsi
menurunkan viskositas mucus. Validasi metode menurut United States Pharmacopeia
(USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel,
dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Parameter yang digunakan pada
validasi metode kali ini yaitu linearitas, selektivitas, akurasi, dan presisi. Kondisi KCKT
yang digunakan adalah fase terbalik dengan kolom ODS (C18) dengan panjang
gelombang 310 nm dan fase gerak metanol:bufer fosfat (8:2 v/v), laju alir 1,0
mL/min dengan volume penyuntikan 4µg/mL. Pada validasi metode ambroksol HCl
memperlihatkan nilai lineritas yang baik r = 0,996, selektivitas larutan standar 6,542
dan sampel 7,044 tidak memenuhi persyaratan karena rentang perbedaan waktu
retensi lebih dari ±5%, presisi yang didapat 1,69 (%RSD) memenuhi persyaratan
yaitu ±2%, sedangkan pada uji akurasi kadar yang didapat yaitu 75-79 % tidak
memenuhi persyaratan yaitu 97-103%. Jika salah satu dari parameter tersebut tidak
memenuhi persyaratan maka diperlukan validasi ulang, terjadinya kesalahan pada
saat validasi bisa disebabkan karena kondisi perubahan sintesis bahan aktif obat,
perubahan komposisi obat dan perubahan prosedur analisis, kemungkinan lain juga
bisa dikarenakan variasi fase gerak yang berbeda. Jika tidak dilakukan validasi ulang
maka validasi metode tidak bisa digunakan untuk penetapan kadar.

Kata kunci: HPLC, ambroxsol HCl sediaan sirup, validasi metode

1) Dosen Akademi Analis Farmasi Dan Makanan Putra Indonesia Lampung

Ade Maria Ulfa, Diah Astika Winahyu, Resmawati

PENDAHULUAN mengeluarkan zat-zat asing ( kuman,

Obat adalah zat aktif berasal debu dan sebagainya ) dan dahak dari
dari tumbuhan, hewan, maupun sintetis batang tenggorokan. Maka, jenis batuk
yang dalam dosis tertentu dapat ini tidak boleh ditekan. Batuk non
digunakan untuk rehabilitasi, terapi, produktif bersifat kering tanpa adanya
dan diagnosa terhadap suatu keadaan dahak, misalnya pada batuk rejan atau
penyakit pada manusia maupun hewan. memang pengeluarannya memang
Namun zat aktif tersebut tidak dapat tidak mungkin. Batuk jenis ini tidak ada
dipergunakan begitu saja sebagai obat, manfaatnya, maka haruslah dihentikan.
terlebih dahulu harus dibuat dalam Penggolangan Obat Batuk
bentuk sediaan pil, tablet, kapsul,salep, (DepKes RI,2000) Antitisif berfungsi
supositoria, suspensi, dan sirup untuk menghambat atau menekan
(DepKes RI, 1989). pusat batuk serta meningkatkan
Menurut Syamsuni (2006) ambang rangsang sehingga akan
mengungkap bahwa bentuk sediaan mengurangi iritasi. Secara umum
obat dapat terbagi menjadi Bentuk berdasarkan tempat kerja obat,
padat yaitu serbuk, tablet, pil, kapsul, antitusif dibagi yaitu antitusif yang
supositoria. Bentuk setengah padat bekerja di perifer dan antitusif yang
yaitu salep/unguentum, krim, pasta, bekerja di sentral. Antitusif yang
gel/jelly, occulenta. Bentuk cair/larutan bekerja di sentral dibagi atas golongan
yaitu potio, sirup, eliksir, obat tetes, narkotik dan non narkotik. Contohnya :
gargarisma, cylsima, lotio epithema, Kodein, DMP, noskapin dan uap
injeksi, infuse intravena, douche dan menthol. (Depkes RI, 2000).
mixture. Bentuk gas yaitu Mukolitik sering diresepkan
inhalasi/spray/aerosol. Sirup adalah untuk mempercepat ekspektorasi
sedian cair berupa larutan yang dengan mengurangi viskositas sputum
mengandung sukrosa kecuali pada batuk bronkitis. Meskipun
dinyatakan lain, kadar sukrosa demikian, beberapa pasien
C12H22O11 tidak kurang dari 64% dan mendapatkan keuntungan dari
tidak lebih dari 66,0%. Kecuali mukolitik walaupun sputumnya tidak
dinyatakan lain pada, pembuatan sirup kental. Inhalasi uap dengan drainase
dari simplisia untuk persediaan postural merupakan terapi ekspektoran
ditambahkan metal paraben 0,25% b/v yang baik pada bronkitis kronis. Agen
atau pengawet lain yang cocok mukolitik yang terdapat di pasaran
(DepKes RI, 1979). adalah bromheksin HCl, ambroksol HCl,
Jenis obat yang diberikan dan asetilsistein (DepKes RI, 2000).
dalam bentuk sirup ada yang terdapat Ekspektoran merupakan obat
dalam obat batuk. Ini tidak berarti yang dapat merangsang pengeluaran
bahwa jenis obat-obat lainnya tidak dahak dari saluran pernafasan
ada yang diformula menjadi sirup, (ekspektorasi). Mekanisme kerjanya
tentu saja banyak macam zat-zat obat diduga berdasarkan stimulasi mukosa
dapat ditemukan dalam bentuk sirup lambung dan selanjutnya secara refleks
dalam compendia resmi dan diantara merangsang sekresi kelenjar saluran
produk-produk dagang yang banyak pernafasan lewat nervus vagus,
(Anief, 2007). sehingga menurunkan viskositas dan
Batuk adalah suatu refleks mempermudah pengeluaran dahak.
fisiologi pada keadaan sehat maupun Banyak zat aktif yang ada di dalam
sakit dan dapat ditimbulkan oleh obat batuk ekspektoran, salah satu zat
berbagai penyebab. Refleks batuk aktif yang banyak ditemukan dalam
lazimnya diakibatkan oleh rangsangan obat batuk ekspektoran adalah
dari selaput lendir saluran pernafasan, ambroksol HCl, gueifenesin, ammonium
yang terletak dibeberapa bagian dari klorida, ammonium karbonat. (Tjay dan
tenggorokan. Terdapat beberapa jenis Rahardja, 2002).
batuk, menurut Tjay dan Rahardja Ambroksol HCl merupakan suatu
(2002) jenis-jenis batuk adalah Batuk metabolit bromheksin yang memiliki
produktif merupakan suatu mekanisme mekanisme kerja yang sama dengan
perlindungan dengan fungsi bromheksin. Ambroksol HCl yaitu obat

2 Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017

 Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Pada Pemisahan
Ambroksol HCL Dalam Sediaan Obat Sirup Merek X

yang berfungsi untuk mengencerkan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

dahak yang berfungsi menurunkan atau KCKT atau biasa juga disebut
viskositas mucus melalui pemutusan HPLC (High Perfomance Liquid
serat-serat mukopolisakarida sehingga Chromarography) dikembangkan pada
lendir mudah dikeluarkan lewat akhir tahun 1960-an dan awal tahun
bantuan batuk. Ambroksol HCl 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan
umumnya digunakan untuk mengatasi teknik pemisahan yang diterima secara
gangguan pernafasan akibat produksi luas untuk analisis dan pemurnian
dahak yang berlebihan. (Estuningtyas, senyawa dalam suatu sampel pada
2008). jumlah bidang.
Validasi metode menurut United
Sifat Fisika Kimia States Pharmacopeia (USP) dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis
akurat, spesifik, reprodusibel, dan
tahan pada kisaran analit yang akan
dianalisis. Validasi metode analisis
bertujuan untuk memastikan dan
mengkonfirmasi bahwa metode analisis
tersebut sudah sesuai dan memenuhi
persyaratan (Gandjar dan Rohman,
2012).
Gambar 1. Struktur Kimia Ambroksol Akurasi merupakan ukuran yang
HCl menunjukan derajat kedekatan hasil
Sumber (Krishnaiah et al, 2014). analis dengan kadar analit yang
sebenarnya. Akurasi dinyatakan
Kromatografi adalah teknik sebagai persen perolehan kembali
pemisahan campuran didasarkan atas (recovery) analit yang ditambahkan.
perbedaan distribusi dari komponen- Akurasi dapat ditentukan melalui dua
komponen campuran tersebut diantara cara yaitu metode simulasi dan metode
dua fase, yaitu fase diam (padat atau penambahan baku.
cair) dan fase gerak (cair atau gas). Presisi merupakan ukuran yang
Berdasarkan fase gerak yang menujukan derajat kesesuaian antara
digunakan, kromatografi dibedakan hasil individual, diukur melalui
menjadi dua golongan besar yaitu gas penyebaran hasil individual dari rata-
chromatography dan liquid rata jika prosedur diterapkan secara
chromatography. berulang pada sampel-sampel yang
diambil dari campuran yang homogen.
Tabel 1. Presisi diukur sebagai simpangan baku
Polaritas dan Jenis Pelarut (Harmita, atau simpangan baku relatif. Presisi
2014) dapat dinyatakan sebagai repeatability
(keterulangan). Repeatability adalah
Konstanta keseksamaan metode jika dilakukan
Jenis Pelarut
Dielektrik berulang kali oleh analis yang sama
2,023 Sikloheksana pada kondisi sama dan dalam interval
Karbon waktu yang pendek. Kriteria presisi
1,238 tetraklorida, diberikan jika memberikan simpangan
toluena baku relatif (RSD) 2%
Benzana, Selektivitas adalah kemampuan
2,284
diklorometana untuk mengukur zat tertentu secara
4,34 Etil eter cermat dan seksama untuk melihat ada
4,806 Klorofom tidaknya komponen lain yang mungkin
Etil asetat, terdapat dalam matriks sampel.
6,02 Selektivitas seringkali dinyatakan
ammonium asetat
20,70 Aseton sebagai derajat penyimpangan (degree
24,30 Etanol of bias). Penyimpangan merupakan
33,62 Metanol selisih dari hasil uji sampel, jika
81,3 Buffer phospat komponen-komponen lain tidak dapat

Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017 3

Ade Maria Ulfa, Diah Astika Winahyu, Resmawati

diidentifikasi atau tidak dapat Larutkan dengan fase gerak, kocok

diperoleh, maka selektivitas dapat hingga homogen dan dicukupkan
ditunjukan dengan cara melihat waktu sampai garis maksimum. Maka
retensi pada sampel dan dilihat dengan diperoleh konsentrasi 10 µg/mL, 20
tingkat kemurniannya (Riyadi, 2009). µg/mL, 40 µg/mL, 60 µg/mL, 80
Linieritas menunjukan µg/mL, 100 µg/mL.
kemampuan suatu metode analisis
untuk memperoleh hasil pengujian Kurva linieritas
yang sesuai dengan konsentrasi analit Diinjeksikan larutan dari kurva
dalam sampel pada kisaran konsentrasi kalibrasi menggunakan syringe dengan
tertentu. Pada uji linieritas didapatkan volume 4µl ke sistem KCKT dengan laju
kurva kalibrasi dari larutan standar alir 1.0 ml/menit dengan menggunakan
yang telah diketahui konsentrasinya kolom C18 dan dideteksi pada panjang
(Emer & Miller, 2005). gelombang 310 nm. Selanjutnya dari
luas area yang diperoleh dibuat kurva
PROSEDUR PENELITIAN kalibrasi linieritas, kemudian dihitung
Pembuatan Larutan Buffer Fosfat persamaan regresinya.
(10 mM)
Timbang 0,78 gram NaH2PO4 Selektivitas
masukan ke dalam labu ukur 1000 ml Selektivitas metode ini
yang sudah berisi air ±500 ml, ditentukan untuk menganalisis larutan
tambahkan H3PO4 sebanyak 0,34 ml standar obat dan larutan sampel dari
larutkan dengan aquadest sampai batas ambroksol HCl. Puncak kemurnian
tera. ambroksol HCl dinilai untuk larutan
standar dan larutan sampel dan umtuk
Pembuatan Fase Gerak melihat waktu retensi pada larutan
Methanol : buffer posphat (10 standar dengan larutan sampel.
mM) dengan perbandingan 8:2 v/v
dicampurkan secara homogen dengan Akurasi
bantuan pengaduk magnet. Campuran Keakuratan metode ini
kemudian disaring dengan filter ditentukan dengan menghitung %
membran PTFE 0,2 µm. recovery dari larutan sampel ambroksol
HCl dengan penambahan larutan
Pembuatan Larutan Standar standar. Kemudian untuk pra larutan
Ambroksol HCl (100 ppm) sampel diukur dengan voleme injeksi 4
Timbang 10 mg baku ambroksol µL. Jumlah ambroksol HCl diperkirakan
HCl BPEP (Baku Pembanding Europen dengan menerapkan nilai-nilai yang
Pharmacopeia) larutkan dengan fase diperoleh dari persamaan regresi pada
gerak di dalam labu ukur 100 mL kurva kalibrasi.
sampai batas tera.
Presisi
Pembuatan Larutan Sampel Ketepatan instrumen diperiksa
1,0 ml sirup ambroksol HCl dengan menyuntikan enam larutan
kemudian dimasukkan ke dalam labu standar campuran ambroksol HCl (40
ukur 10 mL dan dilarutkan dengan µg/mL) dibawah kondisi kromatogram
fase gerak sampai batas tera, saring yang sama dan pengukuran luas
dengan kertas Whattman no. 41, puncak, waktu retensi dan faktor
kemudian larutan sampel dipipet 1,0 tailing. Persentasi relatif standar
mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 deviasi (RSD) atau koefesien variasi
mL dan larutkan dengan fase gerak tidak boleh lebih dari 2%.
sampai batas tera.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Kurva Kalibrasi Panjang Gelombang Larutan
Larutan standar ambroksol HCl Standar Ambroksol HCl
dipipet sejumlah 2,5 mL, 5 mL, 10 mL, Pada panjang gelombang
15 mL, 20 mL dan 25 mL dan maksimum Ambroksol HCl yaitu 310
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL. nm dengan waktu retensi 6,542 (tR)

4 Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017

 Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Pada Pemisahan
Ambroksol HCL Dalam Sediaan Obat Sirup Merek X

dan dapat dilihat dari kromatogram di r = koefisien kolerasi

bawah ini. R2 = koefisien determinasi

Berdasarkan hasil kurva

kalibrasi, diperoleh persamaan y =
18664x + 20300, sedangkan nilai r =
0,996. Nilai r merupakan koefisien
korelasi. Syarat diterimanya nilai
koefisien korelasi adalah jika nilai r
mendekati 1 (FDA,2001).
Gambar 1. Kromatogram Standar Selektivitas
Ambroksol HCL Selektivitas kemampuan untuk
mengukur target analit dengan
Hasil Pengujian Baku Ambroksol keberadaan komponen-komponen lain
HCl dalam matrik sampel tanpa
mengganggu hasil analisis.
Tabel 2.
Hasil Larutan Standar Ambroksol HCl

Konsentrasi Luas
No.
(µg/ml) Puncak
1. 10 184457
2. 20 385926
3. 40 780172
4. 60 1160898 Gambar 3. Ambroksol HCl Standar 100
5. 80 1563925 µg/mL
6. 100 1832380

Validasi Metode
Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas

2000000
f(x) = 18664.39 x + 20299.68
1500000 R² = 1

1000000 Gambar 4. Sirup Ambroksol HCl

500000
Berdasarkan Table 3 pada uji
0 selektivitas dibawah menunjukan hasil
0 20 40 60 80 100 120 pada waktu retensi yang tidak presisi,
Konsentrasi (µg/ml)
karena peak ambroksol HCl pada
larutan standar dan larutan sampel
didapatkan waktu retensi yang melebihi
Gambar 2. Kurva Kalibrasi dan Uji persyaratan yaitu ±5%, dimana larutan
Linieritas standar ambroksol HCl berada di waktu
retensi 6,542 menit dan larutan sampel
Keterangan : sirup ambroksol HCl berada di waktu
a = slope (kemiringan) retensi 7,044 menit.
b = intercept (titik perpotongan)
y = absorbansi larutan sampel
x = kadar larutan standar

Tabel 3.

Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017 5

Ade Maria Ulfa, Diah Astika Winahyu, Resmawati

Data Larutan Standar dan Larutan Sampel

Peak# Konsentrasi Luas Area Waktu Retensi

Larutan Standar 96,995 1832380 6,542
Larutan Sampel 19,639 286925 7,048

Akurasi
Tabel 4.
Rata-rata perolehan kembali pada kadar 40 µg/mL

Kadar
Recover
Data Area Teruku
y%
r
39471
1 20,06 79,41
8
38692
2 19,64 75,2
5

Hasil perhitungan menunjukan digunakan memberikan data yang tidak

bahwa perolehan kembali antara 75- memenuhi persyarat yaitu 97-103%.
79% sehingga metode analisis yang

Presisi
Tabel 5.
Hail pengukuran presisi

Kadar %
Dat Rata
Area Teruk SD RS
a -rata
ur D
75583
1 39,41
3
77300
2 40,33
1
78632
3 41,04
7 40,1 0,6 1,6
76683 5 7 9
4 40,00
5
75569
5 39,40
3
78017
6 40,71
2

Pada hasil pengukuran persyaratan yaitu ±2%. Pada uji

uji presisi didapatkan nilai SD
sebesar 0,67 dan %RSD 1,69.
Pada uji presisi didaptakan nilai
%RSD memenuhi persyaratan
yaitu ±2%.
KESIMPULAN DAN SARAN
Validasi metode yang dilakukan
memberikan hasil lineritas yang kuat
yaitu r = 0,996 pada rentang 10–100
µg/mL. Pada uji presisi didapatkan nilai
% RSD 1,69 telah memenuhi
selektivitas waktu retensi yang didapat
pada larutan standar yaitu 6,542 dan
larutan sampel 7,044 tidak memenuhi
persyaratan karena melebihi rentang
yang telah ditetapkan yaitu ±5%, dan
uji akurasi didapatkan % recovery
antara 75-79% tidak memenuhi
persyaratan yaitu 97-103%. Bagi
peneliti selanjutnya di sarankan untuk
melakukan validasi ulang dengan
metode yang sama dan dengan
parameter yang lainnya agar metode

6 Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017

 Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Pada Pemisahan
Ambroksol HCL Dalam Sediaan Obat Sirup Merek X

uji yang dihasilkan lebih valid. Variase 5. Departemen Kesehatan Republik

fase gerak sangat penting dalam Indonesia, 2000.
metode analisis sehingga pada InformasiObatNasional Indonesia
penelitian selanjutnya diharapkan bisa (IONI), Direktorat Jendral
memlih fase gerak lebih yang tepat Pengawasan Obat dan Makanan,
untuk mendapatkan hasil yang baik. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta.
DAFTAR PUSTAKA 6. Departemen KesehatanRepublik
1. [AOAC] Association of Analytic Indonesia, 2009, Undang-Undang
Chemists. 2002. AOAC Republik Indonesia Nomor 36
Internasional Methods Committee Tahun 2009 Tentang Kesehatan
Guidelines for Validation of 7. Depkes RI. 1989. TheValidation of
Qualitative and Quantitative Food Analytical Used in the Examination
Microbiological Official Methods of of Pharmaceutical Materials. WHO
Analysis. Tehnical Report Series.
2. Anief, Moh. 1994. Farmasetika. 8. Depkes RI 1979. Farmakope
GadjahMada University Press, Indonesia, Edisi III, Departemen
Yogyakarta. Kesehatan Republik Indonesia,
3. Anief, Moh. 2007. Farmasetika. Jakarta.
GadjahMada University Press, 9. Ermer, J dan Miller, J.H.McB,
Yogyakarta. (2005). Method Validation in
4. Ari Estuningtyas, Azalia Arif. 2008. Pharmaceutical Analysis. A Giude
Obat Lokal In. Farmakologi dan to Best Pratice. Weinheim : Wiley-
Terapi. Edisi V. Jakarta : Balai Vch Verlag GmbH dan Co. KGaA.
Fakultas Kedokteran Universitas Halaman 253.
Indonesia . Hal 517-41

Jurnal Analis Farmasi Volume 2 No. 3 Juli 2017 7