Aplikasi Pemeriksaan

RT-PCR SARS CoV 2

Basti Andriyoko
Pokja Molekuler
PDS PatKLIn

Image from:WHO web

Pokok Bahasan

Pengambilan spesimen: Swab, Media

Transport, Prosedur

BSL : Risk group, Design, Sarana,

APD

Real time PCR: Alat, Reagen,

interpretasi
Pengambilan spesimen
Swab: Plastic applicator stick,
Nylon,dacron,rayon tip
Nasofaring swab

orofaring swab

Hindari penggunaan material organik

Kualitas Swab mempengaruhi hasil PCR
Cek sertifikasi : FDA, CE, ISO
 Media Transport
UTM/VTM :
ITM (Inactivated Transport Media)
Paten Inactivate microbial viability
à Mengurangi potensi biohazard
Preserved RNA and DNA in the sample
Buatan sendiri
https://www.cdc.gov/coronavirus/20
19-ncov/downloads/Viral-Transport-
Medium.pdf
https://www.who.int/ihr/publications Lain-lain: PBS / Saline steril
/Annex8.pdf?ua=1

Bila Paten Cek sertifikasi : FDA, CE, ISO

Prosedur Pengambilan spesimen
APD: aerosol-generating procedures
Apus nasofaring

Safety procedures
Apus orofaring

WHO.Laboratory testing for 2019 Novel Coronavirus in suspected human cases.2020

Principles of Biosafety (containment)
To reduce or eliminate exposure of lab workers, other persons,
and the outside environment to potentially hazardous agents.

Three elements of safe containment of microorganisms

Standard
Good laboratory practices
Safety equipment Facility design
and technique
• Control access to the laboratory • BSC • BSL
• Wash hands • Eyewash / shower
• No food / drink • Fire extinguisher
• Wear PPE à risk assessment • First aid kit
• Disinfect work areas before & after use
• Dispose all solid waste material in a
biohazard bag and autoclave it
• Treat all microorganisms as potential
pathogens U.S. Department of Health and Human Services,CDC,NIH. Biosafety in
• etc. Microbiological and Biomedical Laboratories. 2009
Risk Group Classification

Classified SARS-CoV-2 as a risk group 3 biological agent

Containment Levels

Due to the ongoing public health

emergency, limited diagnostic work such as
non-propagative diagnostic laboratory work
(for example, sequencing, nucleic acid
amplification test [NAAT]) can be carried out
at containment level 2 (Biosafety Level 2-
BSL2).
www.hsa.ie
 à risk assessment

Sarana yg perlu diperhatikan terkait
SARS CoV 2:
• BSC : Minimal Class II A
• Autoclave : pengolahan limbah
• Untuk pengaturan udara à Portable
Hepafilter
BSL 2
Ventilation system
• Mechanical ventilation systems that
provide an inward flow of air without
recirculation to spaces outside the
laboratory

www.CDC.Gov/24-7
WHO. Laboratory biosafety manual. 2004
PCR Lab

Rachel Lee. Molecular Laboratory Design. 2015

PCR in small Lab
• In a small lab the entire procedure of PCR can be done in a single
room.
• The areas may be demarcated or physically separated by creating
partitions.
• Whether PCR is done in separate rooms or separate areas in a single
room the flow of work should remain uni-directional.

http://grcpk.com/wp-content/uploads/2014/10/12.-Setting-up-PCR-Lab.pdf
Sarana yg perlu diperhatikan

BSC : Minimal Class II A Autoclave :

pengolahan limbah

Portable Hepafilter/plasma ion generator à Untuk pengaturan udara bila

diperlukan

Semua harus terpelihara dan terkalibrasi

Memilih Portable Hepafilter
• Target ACH (Air Change per Hour): 6-12
• Hitung Berapa m3/jam atau CFM (cubic feet per minute) untuk
menentukan
Panjang ruang x Lebar ruang x Tinggi ruang x target ACH = m3/jam
CFM = m3/jam x 0,588
Contoh:
4m x 4m x 3,5m x 10 ACH = 560 m3/jam
CFM = 560 x 0,588 = 329 CFM

à Cari alat portable hepafilter yang memiliki cakupan spesifikasi berkisar di

angka 560 m3/jam atau 329 CFM
APD saat proses PCR risk group 3
• Saat penyiapan master mix
Didalam laminar flow lebih baik
Gunakan APD standar: Jas lab, sarung tangan, masker bedah

• Saat pengolahan sampel

Dilakukan di dalam BSC
Gunakan APD : minimal menggunakan N95, Gown, Sarung tangan, face shield

• Saat PCR
Sampel sudah dalam bentuk RNA à aman
Gunakan APD standar: Jas lab, sarung tangan, masker bedah

Pastikan ganti APD setiap pindah ruangan

 Alat PCR Alat ekstraksi
otomatis
Hal hal yang harus diperhatikan:
• Umumnya close system
• Alat PCR à Real time PCR
• Consumable
• Open system atau close system
à reagen bantuan baiknya open system • Lama ekstraksi?
• Alat PCR Single channel atau multi channel • Masalah bila kualitas
à sebaiknya multi channel, karena reagen sampel/vtm kurang baik
sudah banyak yang multiplex
• Consumable
à stok lancar atau tidak
• Load pemeriksaan

Alat harus diujikan terlebih dahulu

Reagen RT-PCR SARS CoV 2
• Menggunakan minimal 2 target gen spesifik untuk SARS CoV 2 yang
berbeda (multiplex) + kontrol + reagen ekstraksi (manual)
Target Gen Kontrol
E (Envelope) E Positif
N (Nucleocapsid) N, N1,N2
Negatif
Orf (open reading frame) Orf1, orf1ab,
Kontrol ekstraksi
orf1a, orf1b,
RdRp

Gen E umumnya digunakan untuk skrining

sedangkan gen N dan orf untuk konfirmasi.
Reagen harus diujikan terlebih dahulu
Relative positions of amplicon targets on the SARS coronavirus and the 2019 novel coronavirus genome
E: envelope protein gene; M: membrane protein gene; N: nucleocapsid protein gene; ORF: open reading frame;
RdRp: RNA-dependent RNA polymerase gene; S: spike protein gene.

Corman VM et al. Euro Surveill. 2020 Jan 23; 25(3): 2000045.

Contoh daftar alat/institusi lainnya dapat dilihat
pada link https://www.fda.gov/emergency-use-
authorization#2019-ncov

Alat/Perusahaan/Institusi Gen
Abbott m2000rt N, RdRp
CDC N1,N2
Cepheid GeneXpert E, N2
Roche Cobas 6800/8800 E, orf1
Allplex 2019-nCoV Seegene E, RrRp, N
nCov Real Time Detection SD Biosensor E, RdRp
Interpretasi
Cut off untuk seluruh target:

Saat interpretasi pastikan untuk melihat grafik PCR dan riwayat pasien
Hasil Interpretasi
Seluruh target gen terdeteksi Positif SARS CoV 2
Seluruh target gen tidak terdeteksi Negatif SARS CoV 2
Tidak semua target gen terdeteksi, contoh: Probable/Inconclusive
Dari 2 target hanya 1 gen yang terdeteksi
Dari 3 target hanya 1 atau 2 gen yang terdeteksi
• Atau sesuai petunjuk Kit
• Beberapa Kit: 1 target terdeteksi (kecuali gen E saja) : Positif
Interpretasi
Interpretasi Ket
Positif SARS CoV 2 Sertakan nilai CT, dapat menjadi panduan saat follow up
waktu pengambilan sampel follow up 7-10 hari, setelah hasil
negatif dapat diulang segera setelah hasil keluar.

Negatif SARS CoV 2 Ulang bila perlu sesuai status pasien

Probable/Inconclusive -Pasien baru: Ulang dengan sampel baru

-Pada pasien FU menunjukkan load virus sedikit
(tetap dianggap positif) ulang dengan sampel baru sampai dua
kali negatif.
Penyebab inconclusive: Load virus sedikit, masalah di reaksi PCR
(contoh:Penguapan), mutasi.
 CT value

Semakin tinggi nilai CT à semakin rendah load kuman

Dengan cut off 40 siklus: Semakin mendekati 40 à semakin rendah load kuman
GeneXpert Xpert Xpress SARS-CoV-2
Proses pengolahan specimen dilakukan di
dalam BSC :
1. Pastikan tutup VTM rapat.
Homogenisasi dengan membolak balik
perlahan VTM (+ 5 kali).
2. Transfer sampel dengan menggunakan
pipet yang telah disediakanà
masukkan ke dalam catridge.
3. Tutup catridge dengan rapat.
4. Swab catridge dengan alkohol swab
(kecuali bagian segitiga dibelakang),
sebelum keluar dari BSC.
Patients in convalescence should also be regularly tested for infectivity assessment,
and all the discharged patients should be homequarantined for at least 14 days.
Saran
• Gunakan ITM à mengurangi risiko biohazard
• Gunakan BSC minimal class II A à Prinsip containment
• Gunakan APD sesuai risk assessment
• Gunakan hepafilter portable atau plasma generator untuk mengatur
aliran udara, mengurangi kontaminasi dan risiko biohazard.
• Kerjasama dengan instansi lain, jejaring (terkait sarana, SDM, dll)
Pastikan : Aman untuk petugas yang bekerja di dalam dan aman untuk
orang yang ada di luar ruangan.
Pustaka
• Risk group classification SARS CoV 2:
https://www.hsa.ie/eng/topics/biological_agents/biological_agents_i
ntroduction/classification_of_biological_agents/interim_statement_c
ovid_19_virus.pdf
• Molecular Laboratory Design:
https://www.aphl.org/programs/newborn_screening/Documents/20
15_Molecular-Workshop/Molecular-Laboratory-Design-QAQC-
Considerations.pdf
TERIMA KASIH