SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA 4-0), 137152 (1950) P.M. Torrino *, R. Votpato, G. Ametorrt **, G. Contain * * Istituto Sperimentale LauieroCaseario - Lodi (MI) s+ Istinto di Chimica Agraria Facolta di Agraria - Universita di Milano DETERMINAZIONE QUANTITATIVA HPLC DI ACIDO SORBICO E ACIDO BENZOICO NEI PRODOTTI LATTIERO-CASEARI SIMULTANEOUS HPLC ANALYSIS OF SORBIC AND BENZOIC ACIDS CONTENT IN DAIRY PRODUCTS SUMMARY ‘The use of suitable additives in dairy technologies is due to the ‘consumers, market and distribution requirements, ‘The sorbic acid and the benzoyl peroxide are generally added during cheecemaking as amimirobial and’ blanching adtves respectively “Technologicsl, legal and health problems connected to the use and to the presgnce of these compounds’ in foods have urged the study of analytical procedures to estimate their residual amount in dairy products. "The HPLC method suggested in this work determines contempora- neously the sorbic and benzoic acid in several dairy products by a fas, etsy and sensible way. : 0 investigation performed on a large variety of dairy products showed sorbie acid contents always below the legal. limit ‘On the contrary, the presence of the benzoic acid has been detected not only in the Provolone cheese samples, where it_ was permitted, but ‘also in most of the tested cheeses, where it shouldn't be found, This finding could prove that a benzoic acid presence in milk derive: tives could also come from a specific bacterial activity INTRODUZIONE La sempre maggiore estensione del mercato, non pit limitato alle zone tipiche di produzione, ha determinato la necesita di prolungare il periodo di138 P.M, TOPPINO, . VOLPATO, G. AMELOTTI, G. CONTARINT conservazione dei prodotti lattiero-caseari al termine del processo di matura- zione vero e proprio, per far fronte alle esigenze del sistema distributivo; questo ha comportato il ricorso all'utilizzazione di opportuni additivi da parte delle industrie trasformiatrici. Alle necessita proprie del settore distributivo si sono associate le richieste dei consumatori sempre pitt orientati all’acquisto di prodotti alimentari di qualita standard e con caratteristiche costanti di aroma, sapore, colore ¢ consistenza. Il concorso di questi fattori determina in taluni casi l'impiego di additivi con funzione particolare quali: coloranti (1), aromatizzanti (2), emulsionanti (3), gelificanti (5), antimicrobici (2), antiossidanti (4) e ad atti vita sbiancante (5). La presenza di residui di tali additivi nel prodotto fi pud comportare problemi di natura igienico-sanitaria e di natura legale, Tra gli additivi utilizzati nel settore lattiero-caseario, rivestono parti- colare importanza per V’attivita antimicrobica l'acido sorbico e per V’attivita sbiancante il perossido di benzoile. L’acido sorbico trova impiego soprattutto nella produzione di formaggi molli ad alto tenore di umiditd, grazie alla sua capacita di impedire la germi- nazione dei conidi (6) ¢ quindi la proliferazione del micelio fungino con conseguente deterioramento del prodotto. La legge italiana (2) tollera una concentrazione massima di acido sorbico di 1000 mg/Kg nei prodotti latticro-caseari ¢ di 2000 mg/Kg nel caglio, Liacido benzoico @ stato permesso in Italia per la conservazione del caglio fino ad un massimo dell’1% (7), mentre & stato utilizzato, come peros- sido di benzoile, per la produzione di Provolone destinato al mercato U.S.A. come agente sbiancante. In seguito (5) & stato consentito fino all’8-8-1987 anche in Italia a titolo sperimentale, date le notevoli difficolta di ordine logistico, dovute alla produzione di Provolone con o senza additivo a seconda del mercato di destinazione. IL Legislatore, come spesso accade, ha fissato nei decreti un limite massimo di concentrazione di acido benzoico residuo e di acido sorbico nel prodotto destinato al consumo, senza peraltro indicare un metodo per il dosaggio quantitativo. Di qui Pesigenza della messa a punto di una metodica analitica quantita- tiva affidabile e precisa che consenta all’autorita sanitaria la realizzazione dei controlli da effettuarsi sui prodotti destinati alla commercializzazione ¢ che permetta, anche al produttore, il dosaggio delle quantita opportune di additivo da utilizzare in funzione delle tecnologie di produzione adottate. La maggior parte dei ricercatori dedicatisi alla determinazione quantita- tiva degli acidi benzoico e sorbico, hanno utilizzato tre metodiche analitiche: spettrofotometrica (8-11), gascromatografica e HPLC (12-26).DETERMINAZIONE ACIDO SORBICO E BENZOICO 139 Scopo primario del seguente lavoro @ stato il perfezionamento della meto- dica HPLC, peraltro gia sperimentata (22-23), al fine di consentire la realiz- zazione di analisi quantitative del contenuto degli additivi sopracitati in qualsiasi tipo di prodotto lattiero-caseario, sperimentandone quindi l'applica- ione in molti prodotti presenti sul mercato italiano. MATERIALI E METODI Per quanto concerne la fase analitica relativa alla preparazione del campio- ne & stato seguito il procedimento riportato da Toppino e Coll. (12). Analisi strumentale Apparecchiatura HPLC. Il sistema HPLC utilizzato & costituito da: — pompe a pistoni Knauer modello CP 64; — camera termostatica Knauer; — rivelatore spettrofotometrico UV-VIS a larghezza d'onda variabile Spectra, Physics modello SP 8450; — precolonna Bio-Rad Cation —H+ 40x 4.6 mm; — colonna Bio-Rad Fast Acid Analysis 100x 7.8 mm; — fase mobile : H,SO, 0.01 N / CH,CN-95/5; — flusso 1.2 ml/m — lunghezza d’onda : UV 233nm; — temperatura della colonna: 65°C; — volume d’iniezione : 10 ul, Determinazione quantitativa ed elaborazione dei risultati Sono state preparate opportune miscele standard di ciascuno dei due additivi con concentrazioni crescenti da 0.005 a 0.2 mg/100 ml al fine di valutare Vaffidabjlita del metodo analitico in tutte le sue fasi. La relazione esistente tra altezza dei picchi cromatografici e concentra- zione degli additivi 2 stata calcolata col metodo della regressione lineare semplice. L’adeguatezza del modello teorico & stata valutata applicando l’analisi della varianza alla regressione per verificare eventuali deviazioni della lineari- t& a livello di probabilita di errore dell'1% e del 5%. E? stata quindi costruita la retta razione della risposta strumentale per ciascuno dei due additivi, e sono stati calcolati i limiti di rilevabilita dello strumento (27, 29). 1 dati relativi alle quantita di ciascun additivo, prima e dopo il procedi- mento di estrazione sia da materiale inerte (sodio solfato anidro) che da140 P.M, TOPPINO, R. VOLPATO, G. AMELOTTI, 6. CONTARINE matrice complessa (formaggio) sono stati sottoposti ad aneloga indagine stati- stica al fine di calcolare V'effettiva capaciti di recupero del metodo anali- tico proposto. Sono stati infine costruiti sia per l'acido benzoico che per il sorbico, gli esagoni di confidenza secondo il metodo di Mandel ¢ Linnig (28), che hanno permesso di valutare congiuntamente i limtii di confidenza sia del coefficiente di regressione che dell’intercetta delle rette di recupero calcolate per il metodo Gi estrazione. Campionamento Sono stati sottoposti ad analisi: campioni di formaggio di produzione nazionale ed estera, yogurt burri, tutti presenti sul mercato italiano. B’ stato inoltre analizzato del Grana padano prodotto presso ILC di Lodi a diversi periodi di maturazione, nonché alcuni sieroinnesti. RISULTATI E DISCUSSIONE Accuratezza del metodo analitico L’impiego della tecnica di separazione cromatografica a scambio ionic, ha consentito di ottenere risultati soddisfacenti, con buona selettivita dei picchi relativi ai due acidi considerati, tempi di analisi contenuti (10 minuti) e buona separazione dei composti interferenti presenti soprattutto in campioni di formaggio a lunga maturazione (Fig. 1). Le rette di calibrazione (Figg. 2-3) mostrano la buona linearit& di risposta strumentale ottenuta sia per V'acido sorbico che per Vacido benzoico. L’adeguatezza del modello lineare 2 stata confermata dall’analisi della varianza applicata alla regressione che non ha mostrato deviazioni significative dalla linearita. 1 limiti di rilevabilita calcolati per I’analisi strumentale risultano piuttosto buoni per entrambi gli acidi (sorbico 1.4 ppm, P = 1%; benzoico 2 ppm, P = 1%) e consentono valutazioni quantitative soddisfacenti anche per piccole quantita. L’applicazione del metodo della regressione lineare ai valori di acido sorbico e behzoico, rilevati per aggiunte crescenti dei due additivi sia a substra- to inerte (sodio solfato anidro) che a matrici complesse (formaggio standard), ha permesso di calcolare le rispettive equazioni di recupero (Fig. 4) i cui coefficienti di regressione non hanno mostrato differenze statisticamente significative per P = 19. La condizione di parallelismo delle due rette di recupero ha confermato la buona resa del sistema di estrazione per entrambi gli additivi. La necesita dell’utilizzo di tali equazioni al fine di una determinazioneFig. 1 - Analisi HPLC a scambio Fig. 1 - Ionic exchange HPLC of sorbic and benzoic acids. S = Sorbico / Sorbic. B = Bonzoico / Ben: . ico di acido sorbico e benzoico.ALTEZZE - HEIGHTS ° 0.08 o1 0.18 02 0.25 MQ / 100 ML Fig. 2 - Retta di calibrazione: acido benzoico. Fig. 2 - Calibration line: benzoic acid. ALTEZZE - HEIGHTS 00 4800 4000 3600 3000 2600 2000 1600 1000 500 ° ° 0.05 o4 0.18 02 0.28 MQ@/100 ML Fig. 3 - Retta di calibrazione: acido sorbico. Fig. 5 - Calibration line: sorbic acid.DETERMINAZIONE ACIDO SORBICO E BENZOICO M43 MG/100 ML rilevati - detected 0.36 08 + 0.26} benzolee (benzole) y+ 0.938 x + 0.00004 t 0.2} aorbico (sorblo) ys 0.846 x - 0.00009 : 0.15 j ot + - 0.08 %0 0.05 01086 0.2 0.26 03 MG/100 ML agglunti - added * benzolco - benzole + sorbico - sorbic Fig. 4 - Equazioni di recupero da matrice inerte ¢ formaggio. Fig. 4 - Recovery equations jrom inert material and cheese. precisa ed affidabile ¢ confermata dall’applicazione dei dati della regressione nella costruzione degli « esagoni di confidenza » secondo il metodo di Mandel ¢ Linnig che permettono una simultanea valutazione dei limiti di confidenza (P = 5%) dell'intercetta (b1) ¢ della pendenza (b0). (Figg. 5-6). Da tali figure, che sono la semplificazione matematica di un’ellisse, & possibile osservare infatti che il punto di coordinate 0,1, corrispondente ad un recupero del 100%, si trova al di fuori dell’area dell’esagono. Indagine sui prodotti lattiero-caseari , L’indagine sui prodotti lattiero-caseari presenti sul mercato italiano (tab. 1) ha indicato che, per quanto concerne l’acido sorbico, in nessun caso sono stati rilevati quantitativi superiori a quanto previsto dalla vigente legisla- zione. Dove se ne 2 rilevata una quantita importante, V’additivo @ risultato ‘opportunamente dichiarato in etichetta e quindi sostanzialmente conforme alle disposizioni di legge. Le piccole quantita non dichiarate rilevate in porzioni singole di prodotti fusi, sono probabilmente imputabili all'inclusione, nella miscela di fusione, i formaggi trattati in origine con acido sorbico. *1 PENDENZA - SLOPE 1.01 0.96 ost 0.86 0.008 -0.006 -0,004 -0.002 0 0,002 0.004 0.006 0.008 bO INTERCETTA - INTERCEP? Fig. 5 - Esagono di confidenza: benzoico. Fig. 5 - Confidence hexagon: benzoic acid. I PENDENZA ~ SLOPE 1 1.01 0.96 ost 0.86 0.006 0.004 0.002 ° 0.002 0.004 0.0c6 vO INTERCETTA ~ \NTERCE?T Fig. 6 - Esagono di confidenza: sor Fig. 6 - Confidence hexagon: sorbic acid.‘Tasetia 1 - LIVELLI DI ACIDO SORBICO E BENZOICO IN PRODOTT! LATTIE- RO-CASEARI. ‘Taste 1 - SORBIC AND BENZOIC CONTENT IN DAIRY PRODUCTS. Formaggi freschi Soft cheeses Formaggi vari Miscellaneous cheeses Crescenza Crescenza Crescenza Crescenza Crescenza ‘Crescenza Crescenza Crescenza Crescenza Crescenza Ricotta Ricotta Quark Quark Quark Mascarpone Tocca Caprino Caciotta Caciotta Caciotta Caciotta Caciotta Caciotta Caciotta Caciotta pec. mista Caciotta pec. mista Caciotta pecora Caciotta pecora Taleggio 42.6 48.5 assente assente 39.0 484.9 680.0 48.5 347.7 419.8 assente assente assente assente 418.6 assente asesnte 805.4 assente assente 982.8 assente assente assente 62.7 assente assente assente tracce assente 32 32 99 66 35 assente tracce 29 59 ita 144 88 Wa WW 19.9 tracce 99 22 Wa 21.0 Wal 16.6 WwW 65 29.9 11.0 te 15.5 50.9 44eee pm sorbico ppm benzoico pm sorbic ‘ppm benzoic Gece PA OPO ai pe Datta Taleggio assente 55 Taleggio assente 1 Robiola assente 55 Robiola assente 66 Italico 35 66 Formaggella assente 15.5 Friulana assente 1d Fontal assente 99 Fontal assente 99 Fontina tracce 88 Quartirolo assente 6.6 Rigatino assente 16.6 Crosta fiorita assente 66 Formaggi duri Hard cheeses Grana Padano assente 99 Grana Padano assente 12.2 Grana Padano assente 13.3 Parmigiano Reggiano assente WW Grattugiato assente 52.0 Grattugiato assente 1 Asiago assente 12.2 Asiago assente 1.1 Montasio assente 99 Sbrinz assente 88 Toscanello assente 18.8 Emmenthal grattugiato _assente 13.3 Pecorino Siciliano assente 1.4 Pecorino Siciliano assente 122 Pecorino Romano assente 26.5 Pecorino assente 19.9 Paste filate Pasta filata cheeses Provolone assente 88 + Provolone assente 116.2 + Provolone assente 137.2 + Provolone assente 49.8 + Provolone assente 17ppm sorbico ppm benzoico Ppm sorbic ppm benzoic Provolone assente 340.8 * Provolone assente 12.2 + Provolone assente 96.2 + Provolone dolce assente 1d Provola assente 88 Provola assente 99 Provola aff. assente tracce Burrino assente. 6.6 Caciocavallo assente 55 Caciocavallo aff. assente 98 Scamorza assente tracce Mozzarella assente 21 Formaggi stranieri Foreign cheeses Caprice De Dieux assente 55 Edam Olandese assente AL Crosta fiorita assente oe Camembert assente tracce Camembert tracce assente Camembert assente 66 Camembert assente 7 Gouda Tedesco assente Vd Edamer assente 88 Edelpiz erb. assente 22 Groviera Austriaco assente 177 Cantadou Francese assente 14.4 Bavaria erb. assente 44 Gouda Francese cH 177 Brit assente 22 Maasdam assente om Port Fleuri assente 55 Formaggi fusi Processed cheeses Fuso spicchi 34.3 88 Fuso spicchi 142 Wa Fuso spicchi TA 55 Fuso spicchi | 10.6 88ppm sorbico ppm benzocio Ppm sorbio ppm benzoio * Fuso spicchi a14 66 * Fuso fette 841.6 assente * Fuso fette 863.3 assente * Fuso fette 780.3 assente * Fuso fete 897.0 —_assente Fuso fette 780.3 21.0 Siero innesti per grana Grana cheese whey yeasts A assente 13.2 B assente 124 c assente 126 ‘Yogurt * Albicocea 162.1 122 Ciliegia assente 155 * Fragola 109.1 133 * Mirtilli 1199 122 * Ciliegia 135.6 11 Magro assente 25.4 Magro assente 13.3 Dessert al caffe assente Wad Burro Butter a assente b assente c assente d assente * Acido sorbico dichiarato in etichetta * Sorbic acid declared in label. + Perossido di benzoile dichiarato in etichetta, * Benzoyl peroxide declared in label. Per quanto riguarda V’acido benzoico, se ne & potuta registrare la presenza costante in quantita variabile tra 7 e 26 ppm, sia in formaggi fusi che in prodotti freschi e stagionati, Anche per quanto concerne i formaggi di provenienza estera si & eviden-13.2 121 126 122 155 133 122 1 25.4 133 Ma 22 33 55 Wa presenza : eviden- DETERMINAZIONE ACIDO SOREICO E HENZOICO 9 iala la presenza di quantiti motto variabili di tale additive ad eccezione di alcuni campioni di Camembert, nei quali l'acido benzoico 2 presente solo in tracce. La presenza di tali quantita di acido benzoico & giustificata in campioni di burro © di formaggio grattugiato, dove potrebbe essere rispettivamente imputabile all'impiego di panne di siero provenienti da lavorazioni di forma gio Provolone addizionato di perossido di benzoile ed alla presenza nella miscela grattugiata dello stesso formaggio. L'additivo, viceversa rinvenuto in campioni di yogurt (7-25 ppm) e in sieroinnesti utilizzati per la produzione i formaggio Grana Padano (12 ppm) fa ipotizzare la sua origine microbica, confermando quanto osservato da altri Autori (30). Per quanto concerne il Grana inoltre, nei diversi campioni con un periodo di stagionatura compreso tra 2 © 12 mesi e prodotti con caglio privo di acido benzoico, & stato ritrovato Vadditivo in quantita abbastanza costante durante tutto il periodo della matura- zione (Fig. 7), confermando percid la sua origine microbica. Per cid che riguarda il Provolone, i campioni prelevati, hanno mostrato contenuti in acido benzoico estremamente variabili, da un minimo di 7.7 ad un massimo di 340 ppm quale conseguenza delle diverse perdite in fase lavora- pom of! oT é 4 1 all B 124 | | 104 | | Ei ey | E ei 5 | E a / | 24 Fah 7 a 203 4 6 6 7 8 9 wo 4H MES! - MONTHS ES min Wi max Fig. 7 - Acido benzoico in ctmpioni di Grana Padano. Fig. 7 - Benzoic acid in Ghana cheeses.150 P.M, TOPPINO, R. VOLPATO, G. AMELOTTI, G. CONTARINE zione e di maturazione (31). Le quantita rilevate in campioni di formaggi a pasta filata diversi dal Provolone sono state sempre inferiori o uguali a 10 ppm (tab. 1). CONCLUSIONI Sulla base delle prove effettuate applicando la metodica HPLC all’analisi simultanea dell’acido sorbico e dell’acido benzoico nei prodotti lattiero-caseari, @ risultato opportuno utilizzare una colonna cromatografica operante a scambio ionico. L’efficienza di tale tipo di colonna ha consentito una buona separazione dei picchi relativi alle sostanze in analisi, sia tra di loro che da quelli di composti interferenti e permette Veffettuazione di analisi quantitative suffi- cientemente accurate anche per basse concentrazioni. Aloune prove effettuate in questo e nel precedente lavoro (31), utiliz- zando la metodica in fase inversa, suggerita da Stijve (22), hanno denotato, a fronte di una buona sensibilita, una scarsa selettivitA specie se in presenza i composti interferenti, come avviene nei formaggi a medio-lunga maturazione. E’ opportuno suggerire che Vinterpretazione quantitativa dei risultati debba essere effettuata previa realizzazione della curva di calibrazione relativa all'apparecchiatura in dotazione ¢ calcolando la percentuale di recupero dei due acidi considerati per il metodo di estrazione adottato. Lapplicazione della metodica anelitica sperimentata, ha permesso di effettuare uno screening relativamente al contenuto in acido sorbico e benzoico dei prodotti lattiero-caseari presenti sul mercato italiano. Per quanto riguarda l'acido sorbico non sono stati rilevati campioni con quantita superiori al limite di legge e comunque, come prevedibile, nella grande maggioranza dei formaggi I’additivo 2 risultato assente o presente in tracce. Inoltre, poiché l’acido sorbico & consentito nel caglio fino ad un massimo di 2000 ppm, si ritiene possa essere considerato non grave ritrovarne qualche ppm anche in formaggi non additivati. L’acido benzoico riscontrato in quantitativi compresi tra 2 e 26 ppm anche in prodotti non additivati, sembra doversi porre in relazione sia all’atti- vita metabolica svolta dai microrganismi, che all’utilizzo di caglio in cui tale additivo ® consentito come conservante fino ad un massimo dell’1%. Si ritiene quindi possibile rilevare nei formaggi non additivati, pronti al consumo, acido benzoico sia di origine microbica che tecnologica, anche in quantita pari a 30-40 ppm. Infine, in funzione di un possibile reimpiego del perossido di benzoile, come sbiancante della pasta del Provolone, le determi- nazioni relative sia al contenuto di acido benzoico residuo durante le varieaggi a uguali aseari, cambio azione elli di suffi- utiliz- rotato, esenza uzione. sultati slativa ro dei ss0 di zoico ai con nella ate in assimo ualche > ppm Pat ai tale pronti che in 0 del termi- varie DETERMINAZIONE ACIDO SORBICO E BENZOICO 351 fasi del processo tecnologico di tale formaggio (51), che al contenuto natural- mente presente in formaggi a pasta filata, possono consentire di valutare il quantitative massimo di sbiancante da utilizzare (10-11 mg/Kg di latte lavorato). RIASSUNTO La sempre maggior estensione del mercato lattiero-cascario, ha determi necessit di adeguare i prodotti alle molteplici esigenze del consumatore ¢ del sistema distributive. Si ® quindi diffusa lutilizzazione di opportuni additivi tra i quali, nel setlore lattierocaseario, per ativita antimicrobica V'acido sorbico e per l'attivith sbiancante, il perossido di benzoile. Risulta dunque di fondamentale importanza sia dal punto che da quello legale, avere a disposizione metodiche precise per la valutazione della presenza di tali additivi i metodo HPLC messo a punto nel presente lavoro, permetie la determinszione simultanea di acido benzoico e sorbico in tutti i prodotti latiero-cascari con un procedi- mento rapido e affidabile La successiva indagine conoscitiva effettuata su un‘ampia gamma di prodotti lattiero- cascari del mercato italiano, ha evidenziato Ia presenza di acido sorbico solamente Jn quei prodotti per i quali la legge ne consente Vaggiunta ¢ comunque sempre nei imiti_ stabil Viceversa la presenza di acido benzoico ® stata evidenziata non solo nei cam i Provolone, per i quali era ammessa alla data di campionamento V'aggiunta di perossido i benzoile, tha anche in quasi tutti i formaggi analizzati, confermando quanto eviden- isto da studi precedenti circa Vorigine microbica di tale composto. 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