BÀI 1 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG

NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM

1.1. Các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước
Nước được dùng cho sản xuất, sinh hoạt và thực phẩm. Tùy theo mục đích sử dụng các
chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm soát sẽ thay đổi.
Đối với nước tự nhiên, nước sản xuất nông nghiệp và nước sinh hoạt cần phải đảm bảo
không bị nhiễm phẩm cần phải đảm bảo không bị nhiễm phẩm, không mang mầm bệnh
bằng cách kiểm nghiệm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân ví dụ như coliform, coliform
phân.
Đối với nước uống và các loại nước giải khát, ngoài các chỉ tiêu về vi sinh vật chỉ thị
như coliform, coliform phân, một số vi sinh vật gây bệnh khác cũng được yêu cầu kiểm
tra tùy thuộc vào nguy cơ gây nhiễm.
Sau đây là tiêu chuẩn về nước với các mục đích sử dụng khác nhau
1.1.1 Nước dùng cho mục đích sản xuất, sinh hoạt
Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn quôc gia
Việt Nam (TCVN 5942 -1995) quy định hai mức như sau : -Loại A dùng làm nguồn cấp
nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xửlý, giới hạn tốì đa sốcoliform cho phép là
5.000 MPN/100ml.
-Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa sốcoliform cho phép là 10.000
MPN/l00ml. Nước dùng cho nông nghiệp và nuôi thủy sản có quy định riêng.-Đối với
nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng vềvi sinh vật (TCVN 5944 -1995) đượcquy định là
coliform không được quá 3MPN/100ml, không cho phép có coliform phân.
1.1.2. Nước uống
Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu chuẩn
Nhà nước (TCVN 6096 -1995, TCVN 5042 -1994) quy định vềvi sinh vật của các dạng
nước này là như sau:
Nước uống đóng chai
STT Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép
Không đóng chai Đóng chai
4
1 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/ml) 5.10 102
2 E.Coli (CFU/1000ml) 3 0
3 Clostridium perfringens 0 0
4 Leuconostoc 0 0
3
5 Nấm men - nấm mốc, (CFU/ml) 10 0
 6 Staphylococcus aureus 0 0

Nước giải khát có cồn

STT Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép
Không đóng chai Đóng chai
1 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/ml) 103 102
2 E.Coli (CFU/1000ml) 3 0
3 Clostridium perfringens 0 0
4 Vi khuẩn gây đục (quan sát bằng mắt) 0 0
2
5 Nấm men - nấm mốc, (CFU/ml) 10 0
6 S. aureus/ Vi khuẩn gây bệnh đường 0 0
ruột

1.2 Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y tế bao
gồm các chỉ tiêu sau: tổng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E. coỉi, Staphylococcus aureus,
Salmonella, Vibrio parahaemoỉyticus, Bacillus cereus, Streptococcus -faecalis,
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng sô' nấm
men, nấm mốc ...
Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi theo nhóm và chủng loại thực
phẩm. Các mặt hàng thủy sản chế biến xuất khẩu được quy định bởi tiêu chuẩn quôc gia
(TCVN) và tiêu chuẩn của ngành và của thị trường xuất khẩu. Các chỉ tiêu thường được
quan tâm là: tổng vi khuẩn hiếu khí, Conforms, Coliforms phân, E. coli,• Staphylococcus
aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio choỉerae, Vibrio parahaemolyticus, tổng
sô" nấm men, nấm mốc, Clostridia, Listeria monocytogenes
BÀI 2 :PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU
2.1. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu nước
2.1.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối nước cần
kiểm nghiệm.
- Bình thu mẫu có thể là loại dùng một lần hoặc nhiều lần. Trường hợp dùng bình chứa
dùng nhiều lần, chất liệu của bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo
ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật.
 - Khi cần thiết phải bồ sung tác chất vô trùng để trung hòa các dư lượng chất diệt khuẩn
hiện diện trong mẫu nước. Tác chất trung hòa này phải không ảnh hưởng đến sức sống
hoặc sự tăng trưởng của vi sinh vật.
- Tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu mẫu, bảo quản và vận chuyến mẫu.
Trường hợp nước mặt:
Mẫu nước được thu vào bình thủy tinh dung tích 100 ÷ 1000ml đã khử trùng. Lưu ý
không để mẫu nước bị nhiễm bởi tay hay bởi dây sử dụng khi thu mẫu. Để thu các mẫu
nước ở độ sâu nhất định người ta dùng bình thu mẫu chuyên dụng. Trường hợp này người
ta thả bình thu mẫu xuống độ sâu cần thiết, dùng dây mở nắp bình rồi thu mẫu. Để có
được mẫu có tính đại diện cần chọn nơi nước chảy (giữa dòng) và độ sâu 20 ÷ 30cm đế
thu mẫu. Thông thường cần thu mẫu tại nhiều điểm từ thượng nguồn xuống cửa sông.
Trường hợp nước ao hồ, để có số liệu về sự phân bô bề mặt của vi sinh vật, tùy kích
thước của ao hồ, cần chọn từ 5 đến 10 điếm cách nhau những khoảng thích hợp. Đế có số
liệu phân bố theo chiều sâu, thông thường người ta lấy một mẫu ở đáy ao hồ và sau đó
thu các mẫu theo một khoáng cách nhất định từ điểm đáy.
Trường hợp nước ngầm:
Dùng bơm để thu mẫu. Đối với hầu hết các mẫu nước, cần chừa một khoảng không khí
đủ lớn giữa mặt nước và nắp bình. Do chủng loại và mật độ vi sinh vật trong nước thay
đổi rất nhiều theo bề mặt, độ sâu và chất lượng nước nên cần đánh giá chất lượng. Khi
thu mâu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu khác nhau, cần chọn 5 đến 10 địa điểm trở
lên. Trường hợp này cần lưu ý đến các yếu tố như độ sâu, thành phần đất, khoảng cách từ
nguồn ô nhiễm.Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần
thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu...)
Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu. Do việc phân tích thường
được tiến hành ờ tại phòng thí nghiệm nên cần vận chuyển mẫu từ nơi thu mẫu về phòng
thí nghiệm. Trường hợp nàv cán báo quán mẫu ở nhiệt độ dưới 10°c bằng nước đá hoặc
đá khô trong khi vận chuyên. Trường hợp không thực hiện được việc phân tích ngay thì
cần bao quán mẫu ở 0 ÷ 5°C trong tủ lạnh và liên phân tích trong vòng từ 6 ÷ 12 giờ.
2.1.2. Chuẩn bị mẫu
Trong đa số các trường hợp, mẫu nước không cần được xử lý gì dặc biệt trước khi phân
tích vi sinh vật. Khi cần thiết, mẫu cần được pha loãng thập phân để được các độ pha
loãng cần thiết bằng nước cất, nước muối sinh lý hay môi trường lỏng vô trùng.
2.2. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm
2.2.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm
 Dựa vào tiêu chuẩn quy định, người phân tích cần có kế hoạch lấy mẫu thích hợp. Kế
hoạch này bao gồm các thông số là khối lượng (5, 10, 20, 25g hay nhiều hơn) và số lượng
mẫu cần phân tích. Các thông số này thay đổi tùy thuộc vào mức độ nguy hiểm của từng
loại thực phẩm khi có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có mối nguy
hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay là thực
phẩm dành cho đối tượng có độ mẫn cảm cao như người già, trẻ em...
Kết quả phân tích, định lượng phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp và quy trình thu
mẫu. Do vậy quy trình và phương pháp thu mẫu thường được quy định cho từng trường
hợp cụ thể để mẫu thu phản ánh đúng tình trạng sản phẩm cần phân tích. Trong các nhà
máy sản xuất, chế biến thực phẩm, về nguyên tắc mẫu cần được thu tại nhiều thời điểm
và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, tránh việc thu chỉ tại 1 thời điểm, 1 vị
trí hay công đoạn. Tuy có thể tập trung thu mẫu tại công đoạn thành phẩm, nhưng tốt nhất
là thu mẫu tại một vài công đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất
Dụng cụ thu, chứa mẫu
- Thực phẩm đông lạnh: sử dụng các ống khoan tay, các dao vô trùng để tách thành lượng
mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo... đế cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý tránh
thu các mảng băng.
- Thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức: chọn lấy các gói lớn từ đó lây ra các bao nhỏ
hơn.
Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc sô lượng các chỉ tiêu cần phân
tích nhưng ít nhất là khoảng 100 ÷ 250g. Mẫu cần đảm bảo tính đại diện: thu gộp mẫu tại
nhiều vị trí trên nguyên liệu hay thành phẩm.
- Mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến: thu mẫu tại nhiều vị trí trong
cùng một công đoạn. Đôi với các loại mẫu như thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu
là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định
hay cắt lát với bề dày 2 ÷ 3mm đế thu mẫu. Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa
có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng
thủy tinh đề chứa mẫu vì dễ vỡ.
Vận chuyển và bảo quản mẫu
Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo quản
mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt
quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển
vào trong tủ đông và được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu
phải được bảo quản ở -20°c cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản
đông, thì có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 ÷ 4°c nhưng không được quá 36 giờ.
Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có
thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu
▪ Giải đông mẫu trước khi phân tích
Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích.
Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong
các dụng cụ chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm,
không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 ÷
5°C trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45°C trong 15 phút.
Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và ỉàm
đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu.
▪ Đồng nhất mẫu
Do sự phân bố không đồng đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm
đồng nhất trước khi phân tích.
- Mẫu lỏng: được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích.
- Mẫu rắn: được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng trong điều kiện vô trùng.
▪ Cân mẫu
Cân chính xác một lượng mẫu xác định tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số
cho phép là ± 0,l g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các
bao nhựa vô trùng.
BÀI 3: PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
3.1. Định nghĩa và nguyên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện
có sự hiện diện của ôxi phân tử.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên
môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là
sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn
vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực
phẩm.
Quy trình phân tích bao gồm các bước:
▪ Cân mẫu,
▪ Đồng nhất mẫu,
▪ Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân,
▪ Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa
petri bằng phương pháp hộp trải (spread plate) hay hộp đổ (pour plate)
▪ Ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định.
Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh
vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình
chế biến, bảo quản sản phẩm.
3.2. Môi trường và hóa chất
-Môi trường sử dụng là Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2. Ngoài môi trường trên,
còn có thể sử dụng các môi trường khác như Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar.
-Môi trường được phân phối vào trong các bình thủy tinh hay trong các ống nghiệm và
hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
- Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng để pha loãng mẫu chứa
8,5g NaCl và 1g pepton trong 1000ml nước. Dung dịch này được hấp khử trùng và được
phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào trong các ống nghiệm vô trùng.
3.3. Quy trình phân tích
3.3.1 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
- Cân mẫu: dùng các dụng cụ đã được khử trùng cân chính xác l0g (hay 25g) tùy vào đặc
điểm mẫu cho vào túi PE.
- Đồng nhất mẫu: Đối với mẫu dạng rắn. Tất cả thao tác tiếp theo cần phải tiến hành
trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90ml (hay 225ml) dung dịch pha
loãng SPW. Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập
mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút.
- Dịch mẫu đồng nhất được pha loãng vào ống nghiệm chứa 9mL dung dịch pha loãng
đên độ pha loãng cần thiết. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung
(vortex) hoặc dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 ÷ 10 lần.
Lưu ý: nếu pipet hoặc đầu tip pipetman nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác (chạm
tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa...), cần phải thay pipet hoặc đầu
tip vô trùng khác.
3.3.2 Cấy mẫu
Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 ÷ 250 tế bào vi sinh vật trong lmL
để cấy lên đĩa petri. Dùng pipet vô trùng hoặc pipet man chuyến lmL dịch mẫu pha loãng
đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2 ÷ 3 đĩa
(tức là thực hiện 2 ÷ 3 lần lặp lại). Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 ÷ 15mL môi trường
PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45°C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách
xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 ÷ 5 lần ngay sau khi đổ
môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các
đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± l°C trong 72 giờ.
3.3.3 Tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 ÷
250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong l g hay l mL mẫu được tính như
sau:
CFU CFU N
A( hay )=
g ml n1 .V . f 1 +…+ ni . V . f i

Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong lg hay lmL mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa
f: độ pha loãng tương ứng
*Kết quả thí nghiệm:
Ở nồng độ pha loãng 10-7:
Đĩa 1: 232
Đĩa 2: 217
232+217 CFU
A= =2,245.109 ( )
2.1 .10−7
ml

*Nhận xét:
-Có sự sai số của kết quả do ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài cũng như các thao tác
khi thí nghiệm chưa chuẩn xác.
-Các nồng độ pha loãng ở 10-5 và 10-6 bị nhiễm VSV nên không thể đếm được.
-Các nồng độ pha loãng ở 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 có số khuẩn lạc quá dày đặc nên không thể
đếm được.
Hình ảnh nhóm thu được