— ae Deoartamento di Fa Escuela Nacional de Gionce mentos con principios activos quimicame: medicamentos comunes 0 convencionales INrropeecton ‘Tradicionalmente 1a cecnolo- gia farmacéutica y el disco de medicamentos se han circuns- crito, en las instituciones de ensefianza superior, a Ia tecno- logia y al disefio de medica- ‘nte puros, los cuales se consideran como los Sin embargo, la realidad del consumo de inedi- mentos a lee cae eeblacion incluye, de manera muy significativa, otros tipos de wears aclee au0s cuales tradicionalmente no se les ha dado la misma importa, por conside- firlos menos o no efectivos. Entre ellos se incluye » le fitomedicamentos y a los productos homeopiticos. Encimilay los cuales se encuentran en un espacio entre los productos denominados nutracéuticos, los medicamentos y los alimentos, Alconjunto de productos antes mencionados s¢ les eonoce con el término genérico de productos naturales para la salud. La situacién legal de tales medicamentos no es totalmente clara en todos los paises, En algunos paises como Canadé se reficre a {os productos naturales para la salud como aquellos que se fabrican, se venden y se usin para A. Fl diagnéstico, tratamiento, mitigacin o prevencién de enfermedades, desordenes o estados sicos no normeles y sus sintomas en humans productos herbolarios 0 cunstancia se encuentran 5B, Restaurar o correyirfunciones orggnicas en los humans, C. Mantener 0 promover la salud o de otra manera, modificar las funciones orgénias en los humanos, Caracteristicas que se atvibuyen de ig todos los productos farmacéuticos convencionales. Aunque estos términos también podrfan confundirse con los ali- ‘mentos convencionales y con los alimentos funcivnales, estos deben mantenerse separados, sin formar parte de los productos naturales para la salud. al manera paraPértipos » PROTEINAS ¥ PRODUCTOS MOLOGICOS UTILYZADOS COMO FAR MACOS El interés en los péptidos y proteinas ‘muy importante en la de década de 19 sl Déptidos en fase sélida, Esce ineerée Ja Hegada de Ia teen: como firmacos aumenté de manera 60 debido al desarrollo de la sinvesie Se renueva en la década de 1970 con ‘ologie del DNA recombinante (rDNA), {cali sobre un ribosome, desde un gap “imino terminal hacia el carbonilo terminal Len "ibosomas son grinuloscitoplisiniens eosen RNIN cn donde se snteciean as potas ew Ellas. Un cjermpl or Lealan lo seria ta sine ina y L-leucine sis del dipgptido L-alanil-L-leusina, el eu eg formado Dé beides se realira en slucin oen fase sla, las ventajas de una mavor failidad de fest, dene Ja facildad de producie Péptides con rasgos. quimicos no Usuales, equiere de pocos o ningin derivado de aminoicido proregide, utili2a esquemas de purificacian de ‘mayor simpleza en la etapa final as come la disponibiidad de une gran ‘antidad de protacdlos sintéticos 1a técnica de fae sida comprende |: Sjacion de un aminodcido, raming Protegido de las cadenaslaterales,« UR Soporte polimético. s6lido, EL {ET¥po que protege al grupo amino se ‘tira (desproteccién). Cualquier sal del componente amino se converte » amina libre por la reacvisn con une base orgénica debi! (neuteaizaciony Se aiciona un exceso (2 a 6 equiva, lentes) del siguiente aminadeido que © desea hacer reaecionar con ef Srupo amino, en presencia de un Fesctivo activante, para formar el pri- qirt enlace de amida (acoplamiento), Hl solvente y ls reactivos sobrannes e Separen por fltracin del compen insoluble péptido-resina. El procece, Se repite tantas veces como sea nen satio para completar la secuencia final del Péptido. EI complejo pepeides jenna 6 trata con un reactivo regu larmente en solucién, por ejemplo fcido fluothidrico, para separar el Péptido del soporte de resina y para Femover los grupos que protegen lye cadenas laterals, la sintesis de péptidos en fase s6li- ds tendefa las ventajos de rapier, automatizacidn, esencialmente sig Problems de solubilidad de inte ‘mediarios durante el proceso sint ‘ico y la posibilidad de poder mane. jr la sintesis de péptidos grandes, Se considers que los métodos de sin- fesis de péptidos en solucisn serian ‘mis convenientes para sustancias coeean Desprotecién a Ciclo de la sintesis de péptidos en fase s6lida a menos de 10 residuos o cuando el residuo terminal carboxfi- 0 no es adecuado para la sintesis en fase sdlida, como cuan- o éste tiene un aldehido, una amida compleja 0 un alcohol, centre otros. El uso de las metodologfas de fase sdida serfa de mayor ventaja cuando se pretenda la obtencitn de péptidos ‘muy grandes o varios anslogos. Existen otros dos métodos para obtener péptides, el uso de las enzimas y el wo del DNA recombinante (DNA) y los anticuerpos monoclonales, La biotecnologia incluye una coleccién de ténicas hiolgicas que srven, entre otras cost, para duplicar sustancias que se encwentran en la naturaleza Ener las téonicas usilizadas en la bioteenologia se encuentra 4a tecnologia del DNA recombinantey lade os anticuerpos ‘monoclonaes La sintesis enzimética de péptidos utiliza las enzimas pro- toliticas para catalizar la formacién de enlaces peptidicos La sintesis enzimatica se ha utlizado para obtener produc. tos como fa quimotripsina, la tripsina, la subtilisina, la apaina y la pepsina entre otros. Entre las ventajas de los métodos enzimaticus se encontrarfan el que las enzimas son estereoespecificas, lo cual evitaria la racemizacién del producto final; el que los aminodcidos iniciales puedan ser Facémicos, escogiendo en casi todos los casos las enzimas s6lo los isémeros L, dando por resultado péptidos dptica- ‘mente puros. Otra de les ventajas es que las rcacciones enzimaticas podrian levarse a cabo bajo condiciones acio- sas cercanas a un pH neutro. Por el método enzimitico Fegularmente no se necesitaria proteger los grupos funcio- *% « oo nales de las cadenas laterales debido a que les ‘enzima eatalizan sélo reacciones de grupos Geamino y carboxilicos. Algunas desventajas de los métodos enzimticos serfan el que la reaceién {que forma el enlace peptidico debe ser optinsieae acon una enrima especifica; el que la seleccivin de la enzima para la formacién de un enlace pep- tidico especifico es eritiea asf coma lo seria la ppureza de a enzima. También jugatian un papel critico en esta metodologta las condiciones de PH, las concentraciones en la reaceién asi como las solubilidades de los productos y los reactivos ‘estas condiciones deben optimizarse para cada ‘nueva reaccién, En términos generale, se consi ddera que la sintesis de péptidos con enrimas tex dria siempre limitaciones, Las ténicas del DNA recombinante (-DNA)y l 4e las anticuerpos monoclonales (Mab) se desarrollo en la <écada de 1970. Ea el ato 2000 se consideraba que los firma. os obtenidos con estas téenicas y que xe encontraban en el ‘mercado eran 48 de un total de los 61 productos de origen biologieo. La tecnologia del WDNA es un proceso en el cual genes bhamanos (DNA) se identifican, para insertar uno de ellos en ‘el DNA de una bacteria (plismide). Fste plésmido se coloca fn células no humanas, por ejemplo en una baceeriacotno coli la cua al fabricar sus proteinas tipiea producird tam bign las proteinas humanas desde el gene humano, Los “Mabs son proteinas que se producen en las células plasmati- «as del organismo, como una respuesta ala presencia de sus- ‘anciasextrafias, Los Mabs se adhieren a as sustancas extra fas para nevtralizarlas. Fl primer proxiueto comezcial de la bioteenologfa fue la insolina humana recombinante, La tecnologia del r-DNA comprende 5 pasos, la identifica cién de la protefna, el aislamiento del gene, la elonacién y expresin, el escalamiento de la manufactur y el asegura- tmiento de la calidad. ‘La identificacion de la proteina comprende él encontrar una proteina responsable de algiin efecto bioldgico en el cuerpo humano que tenga potencial para fines terapéuticus. Se requiereaislar la proteina de su medio normal, por ejemplo Ae los fluidos biolégicos o de las eélulas. Se determina la ‘estructura de Ia proteina incluyendo Ia secuencia de aminod- idos, la glicosilacién 0 contenido de carbohidratos, los £uPruentes disulfuro y posiblemente también su eontiguracién tridimensional Fr aislamicnto del gene se efiere al aistamiento del gene humano responsable de la proteina. Esto conlleva a uno de 1. Si conocemos la secuencia completa de aminoseidos de |s proteina y conocemos os. 64 tipletes de cido mucleice ‘due codifican para los 20 diferentes aminoseidos, entonces Podremos construir muchas combinaciones de aquellos ciigos de tiplete que pueden ser representaciones gene cas de la proteina eseogida, Estas construcciones genética se denominan genes, uno de los cuales sed identifieado como el gene con capacidad para pr, ducir la proteina escogida. Un triplet 0 cod es una seenens cia tres nuclestdos consecutivos que es pate del digo Benético y que especifiea a un aminoscido en particular on una proteina o a aquel aminoscido que inicia o termina la sintevs de una proteina tvs capaces de encontrar I eétula humana que pro- duce Ia proteina escogida, entonces podremos deseubris 0 deselare! RNA mensajero(en-RNA) que es responsable del Proceso de translaciin para produce la proteina escogid ‘na enzima viral, una tanscriptaza, es capar de crear el DNA complementario escogido o gene, de étemt-RNA especifn, 3. Orraalteratva seria comnar el geaoma humano comple- 10 y womando muestras de dcico nucleico buscar cual de ellas @ det DNA reconnbinance Escalamiento del proceso —p @ Aseguramiento de la calidad Elcuarto paso de la reenologia de rDNA es el escalamicmnun de! proceso de manafactara. Kste comprende cuatro fasce clinéeulo, la fermentacién, la purifcacion y la fornnalacn 1a fise de inoculo comprende el uso de celulas hijas de Ie élula huésped (banco maestro de eélulas de trabajo), la Cuales se sacan de su almacén en vn congelador a 70°C. Las ‘clulas hijas se dejan crecer en un medio especitico, aurnea. fando de tama el lote o tamafo de los matraces, euidarndes ‘que se desarrollen de acuerdo a las caracteristicas normale de su erecimiento, EI medio de crecimiento es una merdla “specitica de minerales y compuestos que facilitan la viabil isd dea ecula i eer y facilican también su capacidad paraproducir proteinas. La fase de fer ‘mentacién o cultivo de elalas com prende Ia inoculacién de miles de recipientes o de grandes fermentado- res con las células del inoculo y con medio de crecimiento, Las células hhuésped producen entonces las pro- teas, intracelularmente sison bacte- tas y extracelularmente si son células de mamfferos. Posteriormente. se Purifican las protefnas, Las eélulas de bacterias se separan y se centrifugan para sacar fuera de las células a las proteinas, procediendo entonces a la extraccién de la proteina escogida dese la mezela compleja de proteinas aque se obtiene. La extraccién o sepa- racién puede incluir procesos como la HPLC. En el caso de las eélulas de mamifero, las proteinas formadas se colectan periédicamente, reempla zando el medio de cultivo, La extrac- ci6n o separacién de la protefna esco- sida es igual que con las protefnas de ccélulas bacterianas, Finalmente, la protefna se formula en un vehfeulo, sto es, se agregan fluidos, estabiliza- ddores y minerales para obtener una fecha ‘de caducidad dptima 0 del ‘mayor tiempo posible. Generalmente no se utilizan conservadores en este tipo de preparacién, debido a su reac- tividad con las peotesnas EL quinto paso eel control de calidad para el producto final y para los com pponentes y procesos, a través de todo el ciclo de manufactura, Las proteinas son materiales complejos, su prepera- cidn cambién lo es. Esta complejidad cleva las posibilidades de contamina- én, de degradacién y de aleeracisn. de las proteinas que se fabrican. La dogradacién puede ocurrir debido a ‘muchas circunstancias entre las que podemos mencionar la precipitacién, Ja agregacién y el enlazamiento trans- versal entre enlaces disulfuro de las proteinas. Las protefnas también ppodrian sufir reacciones de oxidacién, de reduccién, de prateoliss y varias otras mas. La contaminacién puede ser el resultado de los misimos proce: 508 que ocurren en los firmaeos qui- micamente paros, por ejemplo, conta ‘minaciGn microbiana y contaminaeién guimica. Sin embargo, aqui podsian ocurrit también contaminaciones a través del material genético empleado, ebidas a la incorporacién de DNA foneogénico 0 viral 0 de DNA con alteraciones. El control de la calidad debe asegurar la integridad del pro- ducto final a través de una serie de pruebas que com- prenden al material genético como los plésmidos y los genes, ala proteina en su totalidad, al Enzimary producto final y al feces de proceso de manu- ieee facrura, Para el material genético se harfan pruebas como el. aniliss cariotpico, el tami- scheonty zado oncogénico, la ‘stabilidad del gene y Ia posible infec- cién del DNA Ene las varias prucbas que se hacen @ fa proteina se encucntran la secuencia de smino‘cidos, los mapas péptidicos, 1a cromatografia de liquidos de alta presiéa, el radioinmunoensayo y el bioensayo, Para la validacién del pro- ‘eso se revisarian la productividad o rendimiento de la obtencién de pro- el desafio de la protena y el blo- queo o supresién de endotoxinas. En cl producto final se analizaria la pro- tein, se verficaria una posible conta minacién del DNA y se probaria la estabilidad, incluyendo prucbas. de congelainiento y descongelamiento. Los firmacos que se pueden obtener se clasfican en regularmente en yru- pos como el de las hormonas (pe. la insulina - diabetes), interferones(p. ¢ el interferdn alfa - hepatitis C), facto tes de crecimiento e interleukinas (p. «la epoetina alfa - anemia), anticu os monoclonales (p. e. el rasta ‘mab ~ cincer de seno), envimas y fac tores de coagulacidn (p. cla alteplase ~ infarwo al miocardio agudo}. Otros productos varios no se agrupan parti= ‘cularmente por no ser homoxéncos centre ellos mismos (p.e. la vacuna de fa hepatitis B), Hormonas Factores de interleakinas Andiuerpos smanoclonales FORMULACION DF MEDICAMEN: TOS CON PHPTIDOS, PROTEINS ¥ PRODUCTOS BLOLOGICOS La primera etapa propiamente farma- Ccutica del desarrollo de un medica- ‘mento con firmacos de origen biol6- gico es la misma que para cualquier Imedicamento convencional, esto es, la preformulacidn. En este caso la pre- formulacién comprende la abtencién de una imagen de la proteina que se desea convertir en medicamento 0 forma farmacéutica. Esco con el fin de ‘dentifcar la proteina misma y de esta-blecer posibles condiciones de proce- samiento y de estabilidad del producto a largo plazo. La informacién que se obtiene en la preformulacién nos indi- catia si la moléeula muestra ciertas tendencias a la degradacién, Adem nos indicaria que posibles excipientes se pueden © se deben uiilizar, de acuerdo a compatibilidad, alas neces dades «lel producto y a Ia estabilidad deseada de la formulacién, La primers parte del estudio de pre- formalacién sive para caracteriar la molécula que define a nuestro firma- co, En esta pate se sari infoema- «én como el peso molecular, el punto isocléetrieo, el estado de agregacisn, su hdrofobicidad, su solubilidad y su remperacura de fusién o desnacvral zacién, Dela misma manera es conve- niente conocer s el material biologico ¢s molecularmente homogéneo 0 su srado de heterogeneidad. Para poder aveeder a la determinaciin de tales caractersticas es de primera nevesidad clestablecer Ia metodologis analiiea apropiado a tales fines. ‘La estructura primaria o secuencia de aminofeidos de una protefna recor binante puede derivarse de l secucn- cia del dcido nucleico del gene en el vector de expresida. Sin embargo, en a mayoria de los casos la verificacién de la secvencia de amino‘cidos de la proteinase realiza por mapeo de pép- tidos yearacterizacién (Gecuenciacién) de los peptides aislados por andlisis de espectroscopia de masas. Los métodos para evalua I estructura secundaria son, en primera instancia, fsicos, por ejemplo el dicrofsmo cizeu- Jar Exceptuando fa glicina, los aminod~ ciddos som asimétricos debido ala pre- sencia de un étomo de earbono con quiralidad, Las propiedades 6pricas de los polipéptidos son debidas alos cen 10s asimétzicos de los aminoicides que les consticayen. Por ésta razdn interactéan diferente con la luz polai- zada circularmente hacia laizquierda © hacia la derecha. Kl dicroismo circular ces una téenica que mide fa absorcién desigual ce la luz polarizada circular mente hacia la inquierda 0 hacia la derecha. Usilizando lux del lejano uleravioleta (€250 nim), con espectros- copia de dicroismo circular, se puede predecir la estructura secundaria de una protefna expresada en téeminos de porcentaje de estructura a-helioidal, de estructura B-de hoja plegada o de estructura ordenada al azar. Debido a la sensibilidad de las sefales para derectar cambios en los ambientes de los aminaicidos aromsticos (Tip, Tyr y Pho), los cambios en la estructura ter- ciaria de as proteinas se pueden obser var uilizando el dicrofsmo cireular de uz del cereano ultraviolet (240-320 1m) El espectro del diroismo del cer- cano ultravioleta se usa como huella dlctilar de la estrucrura tora Los métodos antes mencionadlos muchos otros més se aplican a dife- rentes protefnas, aunque la seleccién y el enfoque que se les da dependen sabiidad a con plazo feet de la agiacion ‘Congelamiento-descongelamiento Solventesorginicor de las propiedades espeeiticas de cada proteina. Sin embargo, la prueba final 0 de evaluaci6n auténtica de las pro- piedades de las proteinas solo puede ser su actividad biolégica. Los ensayos de potencia requieren se semejar 0 mimetizar una asetividad bioldgics ‘specifica por lo que son esp para cada protefna. Los méwnlos de ensayo i vio, en animales, s¢ han desarrollado como parte de a evalua- cidn de las proteinas, para medir su “yerdadera” actividad biologica, incluyendo la farmacodinamia cel producto. De esta manera, el bioenss- yo de una hormona del crecimiento hhumano (hGH) solo se mediria efecti- vamente con la ganancia en peso de ratas hipofisectomizadas a las cuales se les ha administrado la hormone. Debido a la complejidad de lus fir ‘macos proteicos, es necesario estable- cer toda una serie de métndos anait cos que sean capai los cambios que vcurren en las estructuras primarias, secundatias, ‘erciarias y cuaternarias de las protei- ras, Fn Ja preforinulacisin lo que se bbusca es basicamente los cambios en carga eléctriea, en tamatio molecular es de diseriminar [ecm [Sarin tengtntn > > oyen el estado de agregacién, ademis de las caracteristicas de apariencia y en su actividad funcional o biolégics En la etapa de preformulacién es conveniente saber los efectos que podrian causar sobre las proteinas cambios fisicos como el congelamien- to y descongelamiento, Esto es de particular importancia al principio del desarrollo del producto, cuando aun no se han desarrollado métodos de conservacién y cuando aun no se ‘maneja todo el tiempo los productos fen un dren aséptica. La alternativa para Ia conservacién seria la congela- cién del producto, para limitar el ere- cimiento microbiano, En Ia preformulacién es conveniente conducir algunas pruebas de compati- bilidlad con diferentes solventes. Estos studios nos servirian en Ia seleccién Ade los métodos analiticos, en el esta- blecimiento de métodos preparativos de téenicas de cromatografia y en la eterminacidn de las condiciones de proceso durante la fase de incorpora- ‘in de la proteina en wna matriz de Tiberacign del firmaco, La medicién de la vemperatura de fusién o dlesnaturalizacién de la pro- para determinar la compatibilidad que hay de la proteina con posibles exci pientes de Ia formulacién, Una tipo particular de di los conservadares. Conforme mayor sea la temperatura de fusidn o desna- turaligacién mayor se espera que sea cl tiempo de caducidad. hos excipientes son La identificacion de los mecanistnos de degradacién es también parte de Ia preformulacién. El mecanismo de degradacién se podria identificar de dos maneras: Ia identificacidn de los productos de degradacién o Ia iden tificacin de los productos secundarios de la degradacién, En esta etapa se utili- zan métodos no tan especificos. Por ejemplo, en lugar de usar un métevdo espe~ fico para una reaccién de deaminaciin, se podria utilizar un método para rmedir la evolacién de amoniaco. La evoluecién de amoniaco podria correlacio~ narse con tun mévodo especifico de deaminacisn. Las protefnas difieren de las moléculas pequetas utilizadas como firmacos on varios aspectos. Sin embargo, uno de los principales aspectos de diferencia es la ‘complejidad de la estructura de las proveinas. La gran especifcidad de la actividad de las proteinas se deriva de todos los niveles de organizacién de sus estructuras, primaria, secundari, terciara y cuaternaria. La eficacia de las proteinas se eneuen- tra ligada de manera muy importante a su estructura tridimensional. Por esta +azén, uno de los principales aspectos a cuidar durance su formulacién es la conser vacin de su integridad estructural durante todo el proceso de manufactura y hasta que el firmaco es liberado, desde su forma de dosificacién, al lugar donde debe actuar. La naturaleza mas 0 menos frigil de las proteinas se puede dafar con cier- ‘3 facilidad durante el proceso de fabricacién de Ia forma farmacéutica, reducien- do su actividad 0 incluso produciendo efectos adversos vomo el que se vuelvan inmunogénicas. Una ver fabrieada la forma farmacéutica, se debe considerar ta bign que esta se puede encontrar durante un periodo de tiempo prolungado en condiciones que le pueden ser desfavorables in vito, por ejemplo, cuando se erate de-un sistema de liberacién prolongada, Kn el caso de un sistema de liberacién prolongada, la formulacién pucde complicarse dado un sitio de liberacidn. Sf 9 de células producto provoca una reaccién de cuerpo extrafio, la eonventrae fagociticas y de enzimas proteolticas puede provocar que las protefnas, un encon= trindose encapsulas, puedan ser degradadas al irse liberando, Esto poslia reducit la biodisponibitiad de la proteina administra, La estailidad cle una proteins involuera, entre tras reacciones, oxidacion y In pérdida de la estructura conformacional. La deamninacisn evel resul= tado de la hidrisis del écido aspéitico y del en protefnas que se encuentran en solucién y se ve minimizada cuando la formula sparagina. Esta reaccién es comin ida se encuentra en estado sélido. La oxidacidn es una reaecidu de deyradacion de mayor complejidad que la deaminacién. Fsta involuers tanto a materiales reaecio- ‘nantes asf como a materiales que funeionan conto eatalinidores. En este e180, es ce ‘considerarse durante fa formulacién la presencia de ciertos grupos funcionales que pouirian ser oxidados a través de la catilisis con metales peste, por perdxides, por aexivucion fotoguimia oa tavés de un solvente arginico 0 inclusive por reacciin én excipiente que se haya utilizado. Los problemas de estabilidad de la acional se refieren ala formacién de agregados de proveinas estructura confor que s+ encuentran disueltos si son pequedias © que son insolubles si son grandes. [La agregacién de las proceinas se relaciona con una distninucién de su actividad 0 ‘untento en su iamunogenicidad, La presencia de estados de agregacién de ls proteinas se ve favorecido por la exposiciin a clevadas fuerzas de corte durante lag cerfases liquido-aire, liquide-sélido y aun liquide-Hquido, La agrezacicn se puede prevenir optimizando el pH, la temperatura y la fuerza idinieaUn parimetro eritico en la formula- cidn de proteinas es el desarrollo de métodos de analisis indicativos de la estabilidad. Fstos métodos deben ser capaces de verificar cualquier posible ddogradacién de manera precisa exacta, y simple. Por ejemplo, fa deamina- cidn puede verificarse a través del ‘enfoque isoeléctrico y con Ia croma- ‘ografia de intereambio iénico, Una alternativa seria la verificacién de la actividad bioligica de las proteinas y los estudies de farmacocinética, La oxidacién regularmente se puede determinar a través de la HPLC en fase reversa o por andisis de péptidos, La agregacién de las proteinas se puede ilentificar por eromatografia de exclusién por tamafo © por elec troforesis en gel de poliacrilamida- dodecilsulfato de sodio. sas técnicas son complementarias ya que propor- civnan diferentes respuestas, En los étodos analiticos es conveniente ¢} | | «stablecer la correlacin entre las diferentes técnicas de ensayo y los ensayo de actividad. Los ensayos de actividad de las protetnas nos permiten deserminat la boned de ls otras tcnicas de andliss, con el fin de establecer cuales técnieas nos Permiten hacer una predicci6n dela estabilidad y de que manera ls pérdidas de ‘estabilidad se relacionan con una pérdida de actividad En la formulacién de soluciones de proteinas, la optimicacidn de s9 estabili- dad incluye el estudio de factores como el pH, los iones del amortiguader, la concentracisn de sales, la concentracién de la protefina, la temperatura 3s como el efecto de los tensoactivos. También debe von- siderarse la posibilidad de adsorcién sobre las superti cies y Ia desnaturalizaciGn en las interfases. En este ipo de productos es necesario también considerar les alteraciones provocadas por ciclos de congelamiento- descongelamiento. Si la solucién de proteinas se admi. nistra en forma de aerosol debe considerarse la posibi lidad de degradacién por las fuerzas de corte ejercidas durante la atomizacién y en la interfase agua-aire Los productos que se encuentran en estado sélido y que contienen protefnas regularmente utilizan proteinas liofiizadss, con el fin de prolongar su establidad. Fn cl estudo sélido de las protefnas, los procesos de degradaciin se redueen considerablemente debido a la menor enwilidl de las moléculss protéicas, comparada con la movilidad en luna soluci6n, Las protefnas se encuentran vommunanente en estado amorfo después de su lioflizaciin. 1a reactividad We Jos materiales s6ldos depend de si el producto se eneu tra uns temperatura ambiente por ariba o par debaja de Ja temperatura de transicién vitrea, A temperacuras ariba de la temperatura de transcion vitres de las protel= bas lioflizadas existe una significativa mayor mowilidad molecular que cuando el material se encuentra a uate peratura por debajo de la transicin vitrea del slido, Una menor movilidad de las ‘moléculas significa una menor velocidad de degradacion, Por esta razén, la esta bilided de wna proteina depende del uso de la condiciones de proceso y deform lacién que produzcan un s6lido con menor morilidad molecular Existe una gran eantidad de medicamentos con protefnas que son implantados © inyectados por via inteamuscular 0 subeutanea, Los fluidos bialégicos se consideran un lugar adecuado para la degradacion de las proteinas » por lo tanto un problema que tiene que ser atendido. La temperatura de 37°C y cl pit neutro del cuerpo humano facilitan las reacciones de deaminacién, Por otro lado, Is temperatura junto con la humedad promueven la mosilidad molecular y con ello aceleran lus reacciones de degradacion. Es de consid arse tambicn que no solo se formula para la forma farmacéutica sino que tam~ bign debe formularse de manera tal que se minimice el daiio a los tejides y la inritacién, SiruaciGnes de inflamaciGn en el sitio de administracion de ta formafarmacéutica también colaboran 2 la degradacion de los péptidos y protefnas La formulacién de péptidos y proteinas debe hacerse tomando en cuenta les eacciones de los tejidos biologicos. El desarrollo de una formulacin depende de la via de administracin, del tipo de liberacién que se desea, del sitio de liberacién y del espacio temporal en que debe actuar. Por esta cireunstancia cada forma farmacéutica requiere de diferentes cexcipientes y procesos de manufactura. Un ejemplo podria ser la seleccién de excipientes para el desarrollo de una formulacién liofiizade Las formulaciones mas comunes de las proteinas incluirian: Escipientes pars jearaey is prec Diluenees slidos Excipientes de una formulacién liofilizada de proteinas atailizaores Agentes para Scone de fe “Tecokapso Crioprotectores Los diluyentes 0 excipientes que sirven para dar cuerpo ala matrz del iflizado son aquellos que proveen de una estructura para el producto lofilizadoy son de patic- Jar importancia en productos con una concentraciGn del firmaco menor al 1%, Los diluyentes, en este caso, forman el cuerpo o la matriz que contiene al farmaco, evi- tando pérdidas de potencia y uniformidad de ls unidades de dosis durante el proce- samniento. La concentracin total de sélidos en soluein en la loflizacién se encien- tra entre el 2 y el 30%, Se considera que sila eoncentracién de la solucién fuera mayor al 30% esto difcularfa la remoeién de agua durante la sublimacién, debido a la resistencia al flujo del agua en fase de vapor oftecida por la carga tan elevada de sélidos, Los xeipientesdiluentes eben combinar una clevada temperature de colap- so de la matiz del lioilizado, protecciin contra los eambios provocados por el con- gelamientoy el descongelamiento y una mayor estabiidad durante el almacenaje del producto o fecha de caduicidad. Ejemplos de ciluyentes slidos son el manitol, la lc- tora, la glicina el azucary el dextrano. Para el control del pH de las soluciones por liofiizar se usilizan amortiguadores de fosfatos, acetatos, carbonates, lactatos, ascorbatos ycitratos. Regularmente los amortiguadores deben mantenerse en bajas concentraciones ya que como es sabi- do, durante la fase de congelacidn de la lifilizacién aumentan su concentracién, solidifican o cristalizan, Estas circunstancias podrfan provocar un desplazamiento © corrimiento del pH y un aumento de concentracidn que date las proteinas en soluciéa si los amortiguadores se tusan en concentraciones el Algunos otros clectroliros se utilizan pare ajustar la tonicidad © presién dsmética de ls soluciones. Para una solucin parenteral, la cual se prepara Tiolizada, se considera una tonicidad fisiologica la obtenida con -260-295 milimoles/ltro. Sin embargo. se posirfan considerar aceptables desvia- ciones cuando el volumen a inyectar cs pequefio, Es de notarse que estas sales podeian funcionar como agentes deshidratantes cuando sv concentra ci6n en solucién se inerementa fuer temente durante la liofliraciGn. Esto cerearia una situacidn desfavorable para Ja estabilidad de las protesnas Los erioprotectores son substancias ‘que se utilizan para proteger a las pro- teinas de] efecto de concentraciones clevadas de sales asf como de corri= rmientos del pH durante la Hiofiliza~ ign, Este efecto protector se norarfa durante la etapa de congelamiento y tratamiento térmico, durante la etapa de secado primario y durante la etapa de secado secundario, Hl efecto esta- bilizante se considera que ocurre debido a la asoeinciin dle los eriopro teetores alas proteinas, Los criopro- tectores pueden aumentar la tempera~ ara de transicién vitrea de los productos Iiofilizados, lo cual aumen= tarla su estabilidad. Bjemplos de erio- protectores son ls polivinipirrolido- rn, el polietilenglicol y ef dextrano. “También se utilizan con el mismo fin aucares como la glucosa, la lactosa y cel azucar de caiia asi como aminodc: dos como a glicina, la arginina y la albumina del suero humano. Estabili- zadores diferentes a los erioprotecto- res nos ayudan a inerementar la fecha dé caducidad de los productos liofili- zados y pueden ser anuy variados y ‘con las misinas caracteristicas que se aplican a otras formas farmacéutica.Jpientes que se utiligen para modificar 1a temperatura de colapso podeian ser los mismos que se utilizan como diluentes. Para este fn las prote- {nas se combinan con materiales que por si mismos presentan temperaturas eleva- das de colapso de la matriz. que forma el lioflizado. La combinacién presenta una temperatora de colapso intermedia, la cual depende la naturaleza de las protef- nas, del agente usado como diluyente y de las cantidades relativas de ellos en la combinacién El desarrollo de una férmula liofilizada podria considerar hasta siete pasos. El primero de ellos seria la seleccidn de la Ftmula, la cual incluye diferentes exci- pientes ya antes mencionados. La con- centraci6n de la solucién en la wnidad de ddosis determina el volumen de ella que se Alebe procesar y con ello a seleceidn del cenvase que sea adecuado para ese vola- men (altura del sélide congelado no mayor de 2 em). La temperatura de colapso se determina por observacién en el microseopio de luna muestra congelada (p.e, -50°C), la cual se calienta progresivamente hasta colapsar. Tumbién podria usarse un liof- lizador, probando varias veces para observar a que temperatura colapsa la matriz. Esta tempera~ tura sirve de referencia para mantener el lioflizdor 2-5°C por debajo de ell, garantizando que la estructura no colap- se durante el secado. Pl tiempo de secado se puede determinar considerando, de tuna manera burda, que para que 1 mm de material congela- do sublime se requere de | hora. Posteriormente se ajusta- rin los tiempos del secado primar, para separarlo del total del tiempo de secado y determinar el seeado secundatio. Hi siempo de procesimiento para alcanzar el valor de humedad residual que se considere satistactoria para la estabilidad puede ser determinado por separacién de muestras a dife- rentes tiempos. A las muestras se les determina la humedad residual y con esto se fia el tiempo de procesamiento, Ml Desarrollo de una férmula liofilizada de proteinas Lecturas recomendadas: V.H La Lee. 1991, Pepide and prin drug delivery, Maree Dekles, New Yar: 4. Swarbriek, J. CBoylan,edtores. 2002. Broyclopedia of Phanas- chology, epunda edicin, Marcel Dekker, New York EJ. Med Dedder, New “York. ly editor. 2000. Protein formulation and delivery. Marcel t