MB/2019

Gruppövning biokemisk metodik; arbete med proteiner

Studera materialet som beskriver reningen av enzymet glutamatdehydrogenas och
besvara följande frågor.

1. I instruktionen står att alla steg ska utföras vi 4 °C. Förklara varför.
Svar: Vid homogeniseringen frigörs olika proteolytiska enzym. Kyla gör dessa
mindre aktiva därför utförs reningen vid låg temp.
2. Det första steget i reningen av enzymet är homogenisering av vävnaden. Vilken
metod används? Ledtråd; studera vad som finns under ”materials”.
Svar: Både hjärnvävnad och lever är ”mjuka” vävnader så det räcker att använda
en kniv-mixer för att finfördela dem. Bufferten som används (se nästa fråga) har
dessutom låg jonstyrka och det gör att cellerna sprängs (samma princip som ni
använder på lab 2 för att lysera röda blodkroppar).
3. Beskriv hur du tillverkar bufferten som används vid homogeniseringen; 4 mM
natriumfosfat pH 7,4 med 0,5 mM EDTA och 0,1 mM PMSF (dessa två salter
tillsätts för att inhibera proteolytiska enzymer). Du har stamlösningar av
NaH2PO4 och Na2HPO4 som båda har koncentrationen 0,1 M. Molmassan för
EDTA är 292,24 g/mol och PMSF har molmassan 174,19 g/mol. Använd värdet
pKa=6,8 för natriumdivätefosfat.
Ledtråd: gör först en mindre volym 0,1 M buffert med rätt pH, sedan räknar du ut
hur mycket du behöver av denna buffert, tillsätter EDTA och PMSF och späder till
1L.
Svar: För att tillverka denna buffert gör du först en mindre volym 0,1 M buffert
med rätt pH, sedan räknar du ut hur mycket du behöver av denna buffert,
tillsätter EDTA och PMSF späder till 1L. Se vidare nedan:
Du kan räkna ut hur mycket du ska ta av respektive stamlösning för att få pH 7,4
genom att använda buffertformeln; pH=pKa+lg([A-]/[HA]); pKa för NaH2PO4 är
6,8 (se lärobok eller tabell; vissa tabeller anger värdet 7,2 men 6,8 stämmer
bättre med verkligheten).
I detta fall blir det alltså 7,4=6,8+lg([A-]/[HA]); Genom att flytta pH och pKa till
samma sida får du 0,6=lg([A-]/[HA]); vilket är samma sak som [A-]/[HA]=4. Om
de två stamlösningarna har samma koncentration så ska du alltså ta 4x mL av A-
(saltet av syran) och blanda med 1x mL HA (syran).
Blanda t.ex. 80 ml A- (Na2HPO4) och 20 ml HA (NaH2PO4) för att få 0,1 L buffert
med pH 7,4. Du kan också blanda 32 ml 0,1 M Na2HPO4 med 8 ml 0,1 M NaH2PO4
för att få exakt den volym som du senare behöver för att erhålla 1L buffert
(förhållandet är 4/1 i båda fallen).

Om stamlösningarna hade haft olika koncentration hade man varit tvungen att
beräkna antal mol i den slutliga lösningen och sedan ta ut 4 x mol av saltet av
syran ([A-]) och x mol av syran ([HA]). Samma beräkningsmetod används om
man väger upp ”syran” och ”saltet av syran” i fast form för att göra en buffert.

1
 MB/2019

Kontrollera att pH blir rätt efter omblandning (pH-meter och magnetomrörare

behövs). Justera eventuellt med tillsats av någon av stamlösningarna. Eftersom
båda lösningarna är 0,1 M kommer blandningen också att vara 0,1 M med
avseende på fosfat.

Använd formeln c1v1=c2v2 för att beräkna hur mycket du behöver av 0,1 M buffert
för att erhålla 1L med koncentrationen 4 mM (0,1 x v1 = 0,004 x 1 ger svaret v1 =
0,04 dvs 40 ml). Tillsätt 0,15 g EDTA (292,24 g/mol x 0,5 mmol/L = 146 mg) och
0,02 g PMSF (174,19 g/mol x 0,1 mmol/L = 17 mg).

Tag alltså 40 ml 0,1 M buffert pH 7,4 (släng resten om du har gjort 100 ml),
tillsätt 0,15 g EDTA och 0,02 g PMSF och späd till exakt 1 L.

4. Nästa steg är att sätta till ammoniumsulfat till homogenatet. Detta görs i två steg
(se beskrivning av reningen). Beskriv vad som händer vid dessa steg. Var hamnar
enzymet i respektive steg? Vad kallas denna reningsmetod?
Svar: I den första fällningen är enzymet kvar i ovanlösningen och i den andra fälls
enzymet ut. Detta är ett exempel på fraktionerad (reversibel) saltutfällning.
5. Vilken mättnadsgrad motsvarar tillsatsen av 113 g/L ammoniumsulfat?
Svar: 20%; oftast används nedanstående tabell ”tvärt om”; dvs. du vet vilken
%mättnad som du vill uppnå och tar reda på vilken mängd ammoniumsulfat som
behövs.
6. Vilken mättnadsgrad motsvarar tillsatsen av ytterligare 188 g/L?
Svar: Gå in på raden 20% ”starting percent saturation” och följ den till höger. Då
ser du att 188 g motsvarar 50% mättnad. Tabellen tar hänsyn till ändringen av
volym vid tillsats av saltet.

2
 *The % saturation can be adjusted either to precipitate a target molecule or to precipitate contaminants.

The quantity of ammonium sulphate required to reach a given degree of saturation varies
according to temperature. Table 14 shows the quantities required at +20 °C. MB/2019
Table 14. Quantities of ammonium sulphate required to reach given degrees of saturation at +20 °C.
Final percent saturation to be obtained
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Starting percent Amount of ammonium sulphate to add (grams) per liter of solution at +20 °C
saturation
0 113 144 176 208 242 277 314 351 390 430 472 516 561 608 657 708 761
5 85 115 146 179 212 246 282 319 358 397 439 481 526 572 621 671 723
10 57 86 117 149 182 216 251 287 325 364 405 447 491 537 584 634 685
15 28 58 88 119 151 185 219 255 293 331 371 413 456 501 548 596 647
20 0 29 59 89 121 154 188 223 260 298 337 378 421 465 511 559 609
25 0 29 60 91 123 157 191 228 265 304 344 386 429 475 522 571
30 0 30 61 92 125 160 195 232 270 309 351 393 438 485 533
35 0 30 62 94 128 163 199 236 275 316 358 402 447 495
40 0 31 63 96 130 166 202 241 281 322 365 410 457
45 0 31 64 98 132 169 206 245 286 329 373 419
50 0 32 65 99 135 172 210 250 292 335 381
55 0 33 66 101 138 175 215 256 298 343
60 0 33 67 103 140 179 219 261 305
65 0 34 69 105 143 183 224 267
70 0 34 70 107 146 186 228
75 0 35 72 110 149 190
80 0 36 73 112 152
85 0 37 75 114
90 0 37 76
95 0 38


7. Fällningen som bildas ska centrifugeras 30 min. vid 4 °C vid 14000g. Antag att du
har en kylcentrifug Sorvall RC-5 som material-listan föreskriver. Vilken hastighet
ska centrifugen ha om du använder en GSA-rotor respektive en SE-12-rotor?
Ledtråd; radien för rotorer finns i tabell A2C i utdelat material.
Svar: Med hjälp av nomogram kan man uppskatta hastigheterna; GSA-rotor ca
9500 rpm (r=145 mm), SE-12-rotor ca 12000 rpm (r=93 mm).
Man kan också beräkna hastigheten med formeln RCF=1,12•10-6•rpm2•r (r i
132
mm). Då blir rpm=Ö(14000/(1,12•10-6•r)) vilket ger 9285 rpm (GSA) respektive
11593 rpm (SE-12).
8. Beskriv tre saker man ska tänka på vid centrifugering med (kyl-)centrifug.
Svar: se föreläsning och kursbok
9. Därefter ska materialet dialyseras. Beskriv principen för dialys.
Svar: se föreläsning och kursbok
10. Beskriv hur du tillverkar 5 L dialysbuffert genom att utgå från NaH2PO4 (119.98
g/mol) och ställa pH med hjälp av en 1 M NaOH-lösning. Koncentrationen ska
vara 20 mM och pH 7,4. Tips: när man ska göra stora volymer av en buffert så är
det praktiskt att göra en mer koncentrerad buffert som man sedan späder till rätt
koncentration.
Svar: 1L är praktiskt att hantera och för att få rätt slutvolym (5 L) så behöver
bufferten ha 5 ggr högre koncentration; dvs. 0,10 M. Väg upp 12,0 g NaH2PO4 och
lös i 900 ml avjonat vatten (loppa + magnetomrörare). Kalibrera pH-metern (pH
7 och 4). Justera pH till 7,4 genom att försiktigt sätta till 1 M NaOH med en
pasteurpipett. Om du sätter till för mycket NaOH så får du börja om från början.
Justera volymen till 1 L. Späd 0,2 L buffert till 1L med avjonat vatten när den ska

3
 MB/2019

användas; pH kan ändras en aning vid utspädningen om det avjonade vattnet har
lågt pH (inte alltför ovanligt). Om det är viktigt med exakt rätt pH så är det bättre
att göra flera mindre satser med buffert genom att t.ex. lösa 2,4 g NaH2PO4 i 800
ml avjonat vatten, ställa pH och späda till 1 L. Detta är ett exempel på att man kan
göra en buffert genom att utgå från syraformen och tillsätta en stark bas för att få
en viss mängd av saltet av syran (bas-formen), vilket ger en buffert. Observera att
det inte går att sätta till syra om man kommer för högt i pH med denna metod; då
blir koncentrationen och jonstyrkan fel.
11. Nästa steg är jonbyteskromatografi med DEAE-cellulosa. Beskriv vilken typ av
jonbytare detta är. Är jonbytaren positivt eller negativt laddad?
Svar: detta är en svag anjonbytare; den är positivt laddad vid från pH 5 till 9 (dvs.
runt neutralt pH). En svag jonbytare kan användas inom ett begränsat pH-
område. En stark jonbytare är positivt laddad inom ett större intervall (extra
upplysning som ej behövs som svar på frågan!).
12. Glutamatdehydrogenas har en isolektrisk punkt (pI) på 5,2. Bufferten som
gjordes till dialysen används som mobil fas (kromatografibuffert) vid jonbytes-
kromatiografin (se fråga 10). Har enzymet en positiv eller negativ nettoladdning
vid det pH som används?
Svar: Bufferten har pH 7.4 (se fråga 10). Eftersom pH är över pI så är enzymet
negativt laddat och kommer därför att fastna på anjonbytaren (som är positivt
laddad vid detta pH).
13. Enzymet frigörs från jonbytaren genom att öka koncentrationen i fosfatbufferten
gradvis från 20 mM till 200 mM, båda har pH 7,4. Du har kvar 0,5 M
natriumfosfatbuffert pH 7,4 sedan tidigare. Hur ska du späda denna för att få 1 L
200 mM fosfatbuffert?
Svar: 400 ml 0,5 M (500 mM) buffert späds till 1 L. Använd formeln c1 v1 = c2 v2 i
vårt exempel blir det 500 x v1 = 200 x 1 (svaret erhålls i L).
14. Därefter måste du överföra enzymet till en buffert som passar för nästa
reningssteg (affinitetskromatografi). Detta görs med hjälp av gelfiltrering.
Beskriv principen för denna metod när den används för ”buffertbyte”.
Svar: Vid denna typ av gelfiltrering används en gel med små porer så att
salt/buffert-molekylerna kan komma in i gelkornen, men inte proteinerna (”size
exclusion chromatography”, SEC). Kolonnen jämnviktas först med den nya
bufferten (Tris-buffert i detta fall, se nedan). En liten volym proteinlösning (löst i
fosfatbuffert) tillsätts och får sjunka in i gelen. Därefter fyller man på med mera
Tris-buffert. Proteinerna passerar mellan gelkornen och kommer att gå snabbare
genom kolonnen än fosfatbufferten. Detta gör att proteinet kommer att eluera i
bufferten som kolonnen var jämnviktad med (Tris-buffert). Fosfat-bufferten
kommer senare. Se även föreläsning och kursbok.
15. Du måste också göra buffert till gelfiltreringen; den ska ha följande
sammansättning: 100 mM Tris-HCl (Tris-Base 121.14 g/mol), pH 7,15 vid 4 °C, 1
mM KH2PO4 (136.086 g/mol), 0,1 mM EDTA (292,24 gram/mol). Beskriv hur du
tillverkar 1 L av denna buffert.
Svar: Tris-HCl tillverkas genom att lösa upp rätt mängd Tris-base och därefter
justera pH med utspädd HCl (0,5 M t.ex.). Väg upp 12,11 g Tris-base och lös i 800

4
 MB/2019

ml avjonat vatten (4 °C). Kalibrera en pH-meter (pH 7 och 10) med lösningar som
har temperaturen 4 °C. Placera bufferten på en magnetomrörare, lägg i en
magnetloppa, och starta en långsam omrörning. Justera pH till 7,15 med utspädd
HCl när all Tris är löst. Om du sätter till för mycket HCl så får du börja om från
början. Tillsätt 0,14 g KH2PO4 och 0,03 g EDTA till bufferten. Späd till 1 L och
blanda noga. (Man kan bortse från den buffrande effekten av KH2PO4 eftersom
halten är försumbar i förhållande till Tris).
16. Varför är det viktigt att ange temperaturen på Tris-bufferten?
Svar: en Trisbuffert har olika pH beroende på temperatur (gäller ej andra
buffertar!).
17. Sista steget i reningsproceduren är affinitetskromatografi med GTP-Sepharose.
Beskriv principen för denna metod. GTP (guanosin 5´-trifosfat) är en allosterisk
inhibitor till glutamatdehydrogenas.
Svar: Enzymet binder selektivt till kolonnen eftersom den innehåller en gel med
inhibitorn GTP. Enzymet frigörs i detta exempel med en KCl-gradient (dvs ökad
jonstyrka). Det hade också varit möjligt att använda specifik eluering genom att
tillsätta inhibitorn i mobilfasen och därmed konkurrera ut bindningen till
kolonnen. Se även föreläsning och kursbok (affinitetskromatografi).
18. Nu är reningen klar och du vill bestämma proteinkoncentrationen på det som du
renat fram. Detta gör du både med Bradford-metoden och A280-metoden. Du gör
en standardserie med BSA till Bradfordbestämningen genom att blanda kända
mängder av en BSA-lösning med Bradfordreagens och sedan mäter du
absorbansen vid 595 nm; se nästa sida. Gör en standardkurva med dessa värden
och ta fram räta linjens ekvation.
Svar: y=0,04x+0,64
19. När standardkurvan är klar så späder du ditt upprenade enzym med
Bradfordreagens och mäter absorbansen vid 595 nm (se nästa sida). Använd räta
linjens ekvation från föregående uppgift för att beräkna proteinkoncentrationen
på ditt upprenade enzym uttryckt i mg/mL.
Svar: Medelvärdet på absorbansen vid 595 nm när provet är spätt 1000 ggr
(1+999) är 1,002. Lös ut x från räta linjens ekvation (se föregående uppgift):
x=(1,002-0,64)/0,04 =9,05 µg/ml. Detta är koncentrationen av den utspädda
lösningen. Spädningsfaktorn är 1000 och provet har alltså koncentrationen 9,05
mg/ml. Proverna i tabellen som har en lägre spädningsfaktor har en absorbans
över 1,5 och dessa värden kan inte användas för att beräkna koncentrationen i
provet.
20. Därefter späder du ditt upprenade enzym i vatten och mäter absorbansen vid
280 nm (se nästa sida). Du har gjort en teoretisk uppskattning av absorptions-
faktorn och funnit att Abs 0,1% är 0,96 mg-1 ml cm-1. Vilken koncentration har din
lösning uttryckt i mg/ml beräknat med A280-metoden? Ledtråd: Abs 0,1% = 1
g/L =1 mg/ml. Om man antar att vatten har densiteten 1 så är detta samma sak
som 1mg/1g=0,001 g/g; i procent blir det 100x0,001=0,1%

Svar: A = e • c • l och c=A/(e• l)

e=0,96 mg-1 ml cm-1 (=0,96 ml/(mg cm).

5
 MB/2019

Absorbansen är 0,198 (medelvärde)

Spädningsfaktor är 50 ggr (20 + 980; använd c1v1=c1v2 för att komma fram till
detta eller härled direkt från 1000/20).
c=0,198/(0,96•1)=0,206 mg/ml
Spädningsfaktorn är 50 vilket ger 50•0,206=10,3 mg/ml.
Du kan också beräkna koncentrationen när provet är spätt 200 ggr (5+995) men
denna bestämning är mera osäker eftersom spädningsfaktorn är högre. Värdet
vid denna spädning blir c=0,0525/(0,96•1)=0,0547 mg/ml, dvs. 10,9 mg/ml när
man tar hänsyn till spädningen.

Resultat från Bradford och A280

standard; koncentration i kyvetten Renat protein spädning i kyvetten med

BSA μg/ml A595 Bradfordreagens vatten
0 0,603 A595 A280
0 0,603 1 μL+999 μL 0,999 0,010
0 0,603 1 μL+999 μL 1,005 0,011
1 0,675 5 μL+995 μL 1,988 0,051
1 0,664 5 μL+995 μL 1,999 0,054
1 0,662 20 μL+980 μL 1,999 0,195
5 0,900 20 μL+980 μL 1,999 0,201
5 0,878
5 0,883
10 1,069
10 1,062
10 1,062
15 1,254
15 1,257
15 1,279
20 1,443
20 1,444
20 1,430
25 1,651
25 1,631
25 1,638

21. Ange tre saker man ska tänka på när man gör en spektrofotometrisk bestämning.
Svar: se föreläsning och kursbok
22. Ange en metod som kan användas för att bestämma om enzymet har blivit rent
(dvs. inga andra proteiner är närvarande).
Svar: SDS-PAGE är en bra metod där små mängder av andra proteiner kan
detekteras, särskilt om silverfärgning används. Det finns också andra alternativ
som t.ex. isoelektrisk fokusering eller bestämning av den specifika aktiviteten.

6
 MB/2019

23. Beskriv principen för hur man bestämmer om enzymet är aktivt (inga detaljer
behövs, bara grundprincipen).
Svar: Enzymassay; man mäter hur enzymet arbetar genom att detektera
ökningen av produkt eller minskningen av substrat. Viktigt att ha rätt
förhållanden (pH, salthalt, temperatur) så att enzymet kan fungera optimalt. Ofta
används spektrofotometriska metoder där ökningen eller minskningen av
absorbansen vid en viss våglängd registreras (vilket motsvarar bildning av
produkt eller minskning av substrat). Om aktiviteten divideras med
proteinmängden får man den specifika aktiviteten, vilket är ett mått på enzymets
renhet (se även föregående fråga).