République Tunisienne

Ministère de l’Agriculture, Ministère de l’Enseignement

des Ressources Hydrauliques Supérieur et de la Recherche
et de la Pêche Scientifique
***** *****
Institution de la Recherche et
de l’Enseignement Supérieur Université de Carthage
Agricoles

École Supérieure des Industries Alimentaires de Tunis

Compte rendu de travaux pratique de biochimie alimentaire N°1 :

Etude cinétique de l’hydrolyse enzymatique de l’amidon

Elaboré par : Yosra Nfissi

Ahlem Oueslati
 I. Intoduction :

1. Definition :
L'amidon est un glucide complexe (polysaccharide ou polyoside) composé de chaînes de
molécules de D-glucose. Il s'agit d'une molécule de réserve pour les végétaux supérieurs et un
élément courant de l'alimentation humaine.

2. Structure :
L'amidon est un mélange de deux homopolymères : l’amylose et l’amylopectine composés
d'unités D-anhydroglucopyranose (AGU) qui appartiennent à la famille
des polysaccharides (ou polyosides) de formule chimique générale (C6H10O5)n. Les unités
AGU sont liées entre elles par des liaisons α (1-4), en général caractéristiques des polyosides
de réserve (à l'exception de l'inuline) et des liaisons α (1-6) qui sont à l'origine de
ramifications dans la structure de la molécule. Ces deux homopolymères, qui diffèrent par
leur degré de branchement et leur degré de polymérisation sont :

 l'amylose : Elle représente 15 à 30% de la masse de l'amidon.

C'est un polymère linéaire de résidus glucose liés par une liaison α-(1,4)-D-
glucosidique. Cette longue chaîne prend la forme d'une hélice (6 résidus de glucose
par tour d'hélice), stabilisée par des liaisons hydrogène entre les groupements
hydroxyle et les molécules d'eau.

 l'amylopectine ou isoamylose : Elle représente 70 à 85% de la masse de l'amidon.

Elle diffère de l'amylose du fait qu'il s'agit d'un polymère ramifié :

- les glucoses des chaînes : liaison α-(1,4)-D-glucosidique

- branchements entre chaînes : liaison α-(1,6)-D-glucosidique

Figure 1 : structures de l’amylose et de l’amylopectine

 3. origine botanique :
L'amidon se trouve dans les organes de réserves de nombreuses plantes :

 les graines (en particulier la châtaigne, les céréales (blé, maïs, froment, etc.) et

les légumineuses
 les racines 
 les tubercules et rhizomes (pomme de terre, patate douce, manioc, etc.)
 les fruits (bananes, arbre à pain) où l'amidon a pour fonction de stimuler la dispersion des
graines

4. hydrolyse de l’amidon :

II. objectif :

l’estimation des paramètres cinétiques des amylases ( km et Vm ) doit être précédée par une
étude cinétique de l’hydrolyse de l’amidon par ces derniers en fonction de la concentration en
substrat.
On doit prouver que les amylases sont des enzymes obéissant à la loi de Michaélis Menten
donnée par l’equation :

Vi = Vm [S] / ( km+ [S] )

Le tracé de doules inverse de Linweaver et Burk nous permet d’obtenir l’equation suivante :

1/Vi = (Km/Vm)*(1/[S]) + (1/Vm)

III. Mode opératoire :

Matériels :
 Becher ml
 Plaque chauffante
 Fiole jaugée 100 ml
 Tubes à essai
 Spectrophotomètres

Préparation de la solution mère :

 Disperser 0.5g d’amidon dans un bécher de 250 ml
 Ajouter 20 ml d’eau distillée
 Ajouter 80ml d’eau distillée bouillante
 Mélanger un peu le mélange
 Faire une ébullition pendant 5 minutes
 Refroidir le mélange
 Disperser le mélange dans une fiole jaugée de 100 ml
  Compléter la fiole avec de l’eau distillée jusqu’à trait de jauge

Préparation de tube 0 ( Blanc) :

 Mettre dans le tube 2.45 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 1 :

 Mettre 0.02 ml de la solution mère
 Ajouter 2.43 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 2 :

 Mettre 0.04 ml de la solution mère
 Ajouter 2.41 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 3 :

 Mettre 0.08 ml de la solution mère
 Ajouter 2.37 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 4 :
 Mettre 0.12 ml de la solution mère
 Ajouter 2.33 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 5 :
 Mettre 0.16 ml de la solution mère
 Ajouter 2.29 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique

Préparation de tube 6 :
 Mettre 0.2 ml de la solution mère
 Ajouter 2.25 de tampon citrate
 Ajouter 0.05 du réactif I2/KI
 Ajouter 200 μl d’extrait enzymatique
 IV. Résultats et interprétations :

1) Tableau des densités :

DO

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 17 180

0
T1 0.261 0.236 0.224 0.21 0.208 0.203 0.19 0.197 0.19 0.194 0.19 0.110 0.19 0.191 0.19 0.190 0.189 0. 0.190
4 9 6 4 3 1 19
0
T2 0.518 0.422 0.361 0.30 0.280 0.251 0.23 0.219 0.20 0.201 0.19 0.192 0.18 0.186 0.18 0.182 0.181 0. 0.180
8 1 9 7 8 5 18
1
T3 0.714 0.596 0.510 0.44 0.399 0.342 0.31 0.271 0.25 0.226 0.20 0.188 0.16 0.157 0.14 0.134 0.126 0. 0.112
2 4 1 4 9 4 11
9
T4 0.764 0.607 0.520 0.45 0.419 0.378 0.35 0.325 0.30 0.290 0.27 0.265 0.25 0.250 0.24 0.236 0.231 0. 0.223
3 3 8 5 7 2 22
6
T5 1.21 1.01 0.83 0.71 0.605 0.522 0.47 0.414 0.36 0.314 0.28 0.246 0.22 0.197 0.17 0.086 0.086 0. 0.086
4 5 0 3 2 3 08
6
T6 1.74 1.64 1.46 1.35 1.263 1.161 1.07 1.013 0.94 0.903 0.86 0.811 0.77 0.734 0.69 0.664 0.628 0. 0.572
3 3 8 4 60
4

Chart Title
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6
0 10 20 30 40 50 60
70 80 90 100 110 120 130
140 150 160 170 180

Figure 2 :courbe Do=f(temps) pour chaque concentration en amidon

Lecture des densités optiques : DO1<DO2<DO3..

Avec la densité optique = est la quantité de lumière qui passe dans la solution pour
déterminerla concentration

2) Tableau des vitesses : détermination des vitesses initiales Vi :

Tubes Vi (m/s)
T1 Vi=-dS/dt=-((0.261-0.236)/(0-10))= 0.0025
T2 Vi=-dS/dt=-((0.518-0.422)/ (0-10))= 0.0096
T3 Vi=-dS/dt=-((0.714-0.596)/(0-10 ))= 0.0118
T4 Vi=-dS/dt=-((0.764-0.607)/(0-10)) = 0.0157
T5 Vi=-dS/dt=-((1.21-1.01)/ (0-10)) = 0.02
T6 Vi=-dS/dt=-((1.74-1.64) /(0-10)) = 0.01
3) Tableau des [S]i :

On a : CiVi = CfVf <-----> Cf=(CiVi)/Vf

[S]f= ( [Si]Vi )/Vf

Tubes [S]i
T1 [S]f = (5*0.02)/(0.02+2.43+0.05+0.2)=0.037
T2 [S]f= (5*0.04)/ (0.02+2.43+0.05+0.2)=0.074
T3 [S]f = (5*0.08)/ (0.02+2.43+0.05+0.2)=0.148
T4 [S]f = (5*0.12)/ (0.02+2.43+0.05+0.2)=0.222
T5 [S]f = (5*0.16)/ (0.02+2.43+0.05+0.2)=0.296
T6 [S]f = (5*0.2)/ (0.02+2.43+0.05+0.2)=0.370

4) Courbe Vi =f([S]i) :

Loi de Michaélienne et Menten :

Vi =Vm*[S] / km+ [S]

5) Courbe 1/Vi=f(1/[s]i)

6) Détermination de Km et Vmax :
1/Vmax = Vmax=
-1/Km= Km=