How to Biotinylate with Reprodicible Results 
Introduction  • Binding assays almost always under‐
represent the number of biotin mole‐
The Biotin‐Streptavidin system continues to be  cules actually attached to the protein 
used in many protein‐based biological research   
applications including; ELISAs, immunoprecipita‐ How can these problems be solved?   
tion, Westen blotting, general immobilization and 
1) Control the amount of biotin on your 
detection, and many other biological procedures.  
protein for assay optimization 
Although pre‐biotinylated proteins are often avail‐
  
able from commercial sources, there are many in‐
In order to avoid over modification which 
stances when specialized proteins are not available 
often causes precipitation and or greatly 
in this form; thereby requiring the researcher to 
reduces activity you should select a di‐
biotinylate their own protein. 
rectly traceable biotinylation kit.  Such a 
However, there are many common problems and  kit would allow you to quickly determine 
other pitfalls associated with standard biotinyla‐ the amount of biotin incorporated into a 
tion procedures, for example;  protein before every assay.  Such tracea‐
  ble biotinylation would enable you to 
• A researcher is often uncertain a 
quickly determine the number of biotin 
reaction worked properly or even to 
molecules present on the protein and 
what degree 
• Over‐biotinylation often causes preci‐ thus allow a minimal amount of biotin‐ 
pitation and loss of protein   just enough to successfully complete an 
• Over‐biotinylation  often reduces pro‐ assay without disrupting activity or func‐
tein activity and/or function   tion.  A fast, reliable and easy to use me‐
  thod for determining the number of 
For this reason, streptavidin‐binding assays were  biotins attached to a protein would elimi‐
developed and used to quantify the degree of 
nate the desire to move on blindly to the 
protein biotinylation.  For example, two such as‐
says include the HABA and a FluoroReporterTM  next step of an often complicated down‐
streptavidin binding assay.  However, streptavidin  stream assay. 
binding assays suffer from numerous short‐  
comings:  2) Biotin quantification without expensive 
  equipment and additional costly assays. 
• High cost (laborious and time‐  
consuming) 
Many of the current methods for quanti‐
• Require expensive, often unavailable 
equipment (e.g. fluorimeter)  fying biotin on proteins require a second‐
• Require external protein calibration  ary assay such as the HABA or the 
curve  FluorReporterTM (Invitrogen) assay. The 
• Binding assays are destructive in na‐ former assay is a destructive assay that is 
ture and consume significant quanti‐ less sensitive and can consume up to 75 
ties of often precious protein  ug of the labeled protein in the assay.  It 
also requires an external streptavidin‐

www.solulink.com  © 2008 SoluLinK, Inc. 
Solulink  How to Biotinylate with Reproducible Results – November 2008 

based calibration curve.  The latter, Fluo‐ Although there are several products on the mar‐
roReporterTM assay, although more sensi‐ ket to address one or two of the solutions above, 
tive than the HABA assay, requires a  SoluLink offers the only comprehensive solution 
spectrofluorimeter or a fluorescent plate  to all these problems in a single reagent.  We also 
reader.  This assay also requires an exter‐ provide easy to use automated calculators that 
nal calibration curve.  The destructive na‐ avoid any need to manually calculate how much 
ture of the assays along with increased  reagent to use or time consuming calculations.  
labor cost and time diminish the general  SoluLinK also offers one‐on‐one technical support 
implementation of these assays.   Any  for any biotinylation project and/or other conju‐
method for circumventing these limita‐ gation support services.  Solving all these prob‐
tions could be quite beneficial to any  lems with the use of a single reagent can help you 
small company or research lab that wor‐ achieve your ultimate research goals while saving 
ries about the cost of such ancillary rea‐ you time, money, protein, and other valuable re‐
gents and assays.   sources while providing valuable process informa‐
  tion. 
3) Reproduce your results effectively.   
  Control the amount of biotin on the protein 
Quick and accurate quantification of the     
number of biotins incorporated in a pro‐ In order to address all of the common biotinyla‐
tein will allow you to quantify your reac‐ tion problems, Solulink has developed Chroma‐
tions each time you biotinylate. This  Link Biotin (Figure 1).  ChromaLink Biotin is a 
provides confidence in the quality of the  water‐soluble biotin labeling reagent with built‐in 
assay reagents being used.  It also permits  signal traceability that allows you to track and 
quantitative comparison to previous bio‐ rapidly calculate the exact number of biotins at‐
tinylation reactions.  Quantifying the bio‐ tached to a protein or antibody. The procedure 
tin MSR (biotin molar substitution ratio)  for labeling with ChromaLink Biotin is identical to 
after labeling would allow you move on to  biotinylating with any other NHS‐based biotinyla‐
the next step of a process or assay with  tion reagent.  The key to solving the common 
much greater confidence.  problems previously discussed revolve around the  
  unique, UV‐traceable chromophore embedded 
4) Choose a traceable biotin reagent with a   
“built‐in” signaling system.   
When you choose the right biotin rea‐  
gent, you will ensure tracking and identi‐  
fication of the entire labeling process,   
always ‘dialing in’ and quantifying the   
proper degree of biotin incorporation be‐  
fore every assay or process.   
 
Current biotinylation products on the market that   
can help solve these problems:    
 
 

Email: solulink@solulink.com  2 
Solulink  How to Biotinylate with Reproducible Results – November 2008 

   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
 
within the linker itself.  Following buffer exchange  Avoid Additional Costly Assays 
of the labeling reaction, the biotinylated protein is  In  order  to  illustrate  how  the  HABA  assay  (Pierce 
simply analyzed by measuring the A280 and A354  Chemical Co., Rockford, IL) often under reports the 
of the conjugate.  Inserting the absorbance values  number  of  incorporated  biotins  versus  the  Chro‐
into a ChromaLink Biotin calculator (provided)  maLink Biotin method, both assays for biotin incor‐
automatically calculates the final protein concen‐ poration were compared and results summarized in 
tration and the number of biotins incorporated!  Table 1.  Data in the table was generated by bioti‐
Biotin  quantification  using  a  simple  spectropho‐ nylating (500 ul @ 5 mg/ml) of a bovine IgG sample 
tometer and no other costly reagents   at 5, 10, and 15 mole equivalents using ChromaLink 
Biotin. 
Representative UV absorbance spectra of a biotiny‐
lated  antibody  using  ChromaLink  Biotin  can  be  As seen from the results, HABA measurements 
used  to  illustrate  how  easy  it  is  to  quantify  biotin  yield lower estimates of biotin incorporation result‐
incorporation  by  a  simple  scan  of  the  biotinylated  ing in significant differences between the two as‐
sample  (Figure  2).    Data  can  be  acquired  on  any  says. For example, the biotin molar substitution 
conventional  or  NanoDropTM  spectrophotometer  ratio calculated using the HABA dye‐binding assay 
is generally 1/3 the value obtained with the Chro‐
and  the  sample  recovered  after  analysis  (non‐
destructive).  maLink method. The HABA dye‐binding assay gen‐
erally underestimates the true biotin molar 
  substitution ratio because it measures the number 
of moles of biotin available for binding to strepta‐
  vidin and not the absolute number of biotin mole‐
  cules attached to the antibody surface.  For 
  example, two biotin molecules in close proximity to 
  each other are likely to bind to a single streptavidin 
Figure 2:  Overlaid UV absorbtion spectra of buffer  molecule. 
exchanged bovine lgG biotinylated using ChromaLinkTM 
 
Biotin at 5x, 10x and 15x equivalents of reagent over 
protein.   

Email: solulink@solulink.com  3 
Solulink  How to Biotinylate with Reproducible Results – November 2008 

   
 
   
   
 
   
 
 
 
   
 
Label Reproducibility  was then incubated with streptavidin‐HRP @ 1 
µg/ml for 60 minutes.  After washes, TMB substrate 
Triplicate biotinylation reactions were set‐up using 
(3,3’,5,5’‐ tetramethylbenzidine) was added for 20 
bovine IgG @ 5 mg/ml and 6 equivalents of  
minutes. Signals were measured on a conventional 
ChromaLink Biotin reagent.  After purification, each 
plate reader @ 650 nm. Direct ELISA dose response 
sample was scanned using a NanoDropTM spectro‐
curves were plotted as illustrated below 
photometer (Figure 3), and the resultant spectra 
overlaid.  As clearly demonstrated, results are easy  Results: Signal/noise increased approximately 2.9‐
to confirm and reproduce, time after time.  fold (linear portion of the curve) as the biotin MSR 
increased from 1.3 to 6.1 as illustrated in Figure 4. 
Background controls were constant across the vari‐
ous MSRs (data not shown). 

To further illustrate the relationship between sig‐
nal/noise and MSR for this antibody/antigen pair, 
plots were generated at a single fixed antigen con‐
centration (e.g.2 ng/well) across a range of molar 
substitution ratios (Figure 5). 
 
Results: Measured signal/noise increases almost 
Figure 3. Overlaid spectra confirming reproducibility of antibo‐ 2.9‐fold as the MSR goes from 1.3 to 6.1.  Note the 
dy biotinylation (triplicates). 
slight reduction in signal as the MSR goes beyond 
Make Assay Optimization Simple  6.1 probably due to over‐modification of the anti‐
body. 
Direct ELISA  
Conclusion:  You have more important things to 
A goat anti‐bovine IgG antibody was biotinylated 
do than worry about biotinylating a protein.  
using ChromaLinkTM Biotin to obtain a series of dif‐ ChromaLink Biotin allows you to biotinylate pro‐
ferent molar substitution ratios. The biotinylated  teins quickly and easily and then confirm the 
antibodies were then used to detect immobilized  number of biotins incorporated so you can pro‐
antigen (bovine IgG) in a standard ELISA procedure.   ceed with confidence!!   
Purified bovine IgG was immobilized (2‐fold dilu‐  
Recommended Products: 
tion series) (0.5 ‐ 5,000 ng/ml).  After immobiliza‐
[B‐9007‐105K] ChromaLinkTM Biotin Labeling Kit  
tion (4 hr @ RT), wells were blocked with 1%  [B‐9007‐105K] ChromaLinkTM One‐Shot Kit 
casein/PBS and subsequently washed.  The plate   [B‐1007‐110]   ChromaLinkTM Labeling Reagent 

Email: solulink@solulink.com  4 
Solulink  How to Biotinylate with Reproducible Results – November 2008 

 
 
 
 
 
 
 
Optical Density (650 nm)

 
 
  MSR = 6.1 MSR = 3.1
 
  MSR = 6.1
  MSR = 3.1
MSR = 1.3
  MSR = 1.3
 
 
 
 
  1 10 100 1000 10000
 
  Concentration
  (ng/ml)
 
 
  Figure 4. Direct ELISA response curves illustrating the relationship between biotin molar substitution ratio and 
  direct ELISA signals @ 650 nm for an anti‐bovine IgG biotin conjugate. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 
 
 
Figure 5. Background corrected direct ELISA signals at a fixed quantity of immobilized antigen (i.e. 2 ng per well) vs.   
MSR.  Note the gradual increase in S/N (~ 2.9‐fold) as the MSR increases from 1.3 to 6.1.  

Email: solulink@solulink.com  5