LEMBAR KERJA LABORATORIUM

IMUNOSEROLOGI

“PEMERIKSAAN ANTI HIV METODE ELISA”

DISUSUN OLEH :

1. OLIVIA MARDHANI PUTRI 20119034

2. SALWIA 20119046
3. TARISA PRICELLA R. 20119052
4. NAWANG PRIMA ILMIAFEE 20118056

FAKULTAS TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN

KESEHATAN INSTITUT ILMU KESEHATAN BHAKTI
WIYATA KEDIRI
Jl. KH Wachid Hasyim No. 65 Kediri
 LEMBAR KERJA

Topik : PEMERIKSAAN ANTI HIV METODE ELISA

PRA ANALITIK

Tujuan : Untuk mendeteksi antibodi HIV secara kuantitatif dalam serum atau plasma
manusia dengan metode ELISA.

Prinsip : Prinsip metode ELISA untuk pemeriksaan prealbumin ini adalah Protein
prealbumin pada sampel akan berikatan dengan anti-prealbumin yang telah
dicoating pada permukaan polystyrene microtitre wells. Setelah dicuci dengan
cairan washing solution, protein yang tidak berikatan dengan antibody pada
dinding well akan tercuci dan dibuang. Kemudian diberikan antibody ke dua
yang telah dikonjugasi dengan enzim horseradish peroxidase(HRP) yang akan
berikatan dengan prealbumin yang sebelumnya berikatan degan anti
prealbumin pada dinding well dan membentuk kompleks antbodi-antigen-
antibodi. Setelah pencucian yang ke dua untuk membuang antibody yang tidak
berikatan, diberikan chromogenic substrate, tetramethylbenzidine(TMB).
Banyaknya enzim yang terikat akan bergantung pada jumlah prealbumin pada
sampel, sehingga ketika diberikan substrat, enzing akan mengolah substrat
sehingga terjadi perubahan warna pada cariran di dalam well dengan gradasi
warna berbeda beda sesuai dengan konsentrasi prealbumin yang
dikandungnya(Petunjuk kit).

Alat :

1. Centrifuge
2. Tabung vakum
3. ELISA Washer
4. ELISA Reader Multiskan GO
5. Perlengkapan untuk Pengambilan sampel darah (Tourniquet, Swab
Alkohol, Spuit 3cc)
6. Tabung centrifuge
7. Vortex

8. Mikropipet
 9. Gelas Ukur

10. Aluminium Foil

Reagen :

1. ELISA KIT MyBioSource yang terdiri dari:

a. Diluent Consentrate 5x

b. Wash Solution 20x

c. Enzyme Antibody Conjugate 100x

d. Chromogen-Substrate Solution

e. Stop Solution

f. Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate

g. Human Prealbumin Standard (Human Prealbumin Calibrator)

2. Aquades

Sampel :

1. Plasma
2. Serum

Probandus :

1. Nama : Mr.X

2. Umur : Xy

3. TTL : Xxy

4. Alamat : Xyy
 ANALITIK

Prosedur :
1. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel darah masing-masing tabung 1,5 cc sampel 1 dan 2 dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi EDTA untuk diambil plasma darahnya, sementara sampel ke 3
dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge tanpa EDTA untuk diambil serumnya.
Selanjutkan dilakukan sentrifugasi ketiga sampel darah tersebut untuk memisahkan
plasma darah dan serum darah dengan sel darah.
Tabung sampel+EDTA 1 dan 2 → sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit. Tabung mikrosentrifuge 3 → dengan mikrosentrifuge kecepatan 3000 rpm selama
10 menit.
2. Pengenceran Diluent Solution 5X → 1X Untuk mendapatkan 10 ml diluent sol 1x= 2 ml
Diluent sol. + 8 ml Aquades.
3. Pengenceran sampel. Siapkan @ 2 tabung eppendorf untuk tiap sampel,
Tabung I = 5 µl Sampel + 495 µl Diluent 1X = 1/100 dilution → sentrifugasi.
Tabung II = 5µl Tabung I + 495 µl Diluent 1X = 1/10000 dilution → sentrifugasi.

Prosedur Well ELISA (Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate)

1. Dengan menggunakan micropipet, masukkan reagen HRP ke dalam well kolom 1 (A-H)
sebanyak 100 µL.
2. Dengan menggunakan micropipet, masukkan kontrol positif ke dalam well kolom 2 dan
3 (BC) sebanyak 100 µL.
3. Dengan menggunakan micropipet, masukkan kontrol negatif ke dalam well kolom 4 dan
5 (DE) sebanyak 100 µL.
4. Dengan menggunakan micropipet, masukkan sampel ke dalam well kolom 6 – 8 (F-H)
sebanyak 100 µL.
5. Diinkubasikan pada suhu ruangan selama 60 menit. Tutup well plate dengan plastik
transparan dan dalam posisi sejajar.
6. Siapkan Wash Solution 20X → 1X sebanyak 100 ml. = 5 ml Wash Solution + 95 ml
Aquades.
7. Setelah selesai diinkubasi, well plate dicuci dengan larutan Wash Solution sebanyak 5
kali dengan menggunakan alat Elisa Washer (Thermo Scientific™ Wellwash™
Microplate Washer).
8. Siapkan 100x enzyme-antibody conjugate yang diencerkan menjadi 1x (dalam keadaan
gelap). = 20 µl enzim + 1980 µl 1X diluent.
9. Masukkan ke masing-masing well 100 µl enzim yang telah diencerkan. Kemudian tutup
dengan aluminium foil (dalam keadaan gelap) dan inkubasi selama 30±2 menit.
10. Lakukan pencucian kembali seperti langkah 5.
11. Masukkan @50 µL TMB Substrate A dan B Solution (Chromogen-Substrate Solution)
pada masing-masing well lalu homogenkan dan inkubasi dengan suhu ruangan dan
keadaan gelap selama 15 menit.
12. Kemudian masukkan 50 µL Stop Solution pada masing-masing well dan diamkan selama
5 menit.
13. Masukkan seluruh well ke Elisa Reader dan lakukan pembacaan hasil dengan gelombang
absorbansi 450 nm.
 PASCA ANALITIK

Hasil :

Absorbansi
A : 0,000 (-)
B : 0,167 (-)
C : 0,573 (-)
D : 0,000 (-)
E : 0,000 (-)
F : 0,000 (-)
G : 2,069 (+)
H : 0,339 (-)

Kesimpulan : Dari pemeriksaan anti-HIV menggunakan metode ELISA didapatkan

hasil absorbansi A : 0,000 (-) ; B : 0,167 (-); C : 0,573 (-); D : 0,000
(-); E : 0,000 (-); F : 0,000(-); G : 2,069 (+) dan H : 0,339 (-)
Diskusi :

HIV adalah singkatan dari Human Immunodeficiency Virus yang dapat penyebab
AIDS dengan cara menyerang sel darah putih yang bersama sel CD4 sehingga dapat merusak
system kekebalan tubuh manusia yang pada akhirnya tidak dapat bertahan dari gangguan
penyakit walaupun yang sangat ringan sekalipun. Virus HIV menyerang sel CD4 dan
merubahnya menjadi tempat berkembang biak virus HIV baru kemudian merusaknya,
sehingga tidak dapat digunakan lagi. Sel darah putih sangat diperlukan untuk system
kekebalan tubuh. Tampa kekebalan tubuh maka ketika diserang penyakit maka tubuh kita tidak
memiliki pelindung. Dampaknya adalah kita dapat meninggal dunia terkena pilek biasa.
AIDS merupakan hasil infeksi yang berbahaya oleh virus yang disebut HIV. Belum ada
cara penyembuhan yang sempurna atau vaksin yang memadai untuk perlindungan terhadap
AIDS, tapi berbagai cara pengobatan sedang dalam proses percobaan. Cara terbaik untuk
melawan wabah ini adalah mencegah penularan dan penyebaran virusnya. Jalur utama dari
penyebaran atau penularan HIV adalah hubungan seksual dan diketahui hanya terjadi lewat
kontak dengan darah yang terinfeksi, atau mungkin sekresi vagina, atau cervik (leher rahim)
dengan selaput lendir (membran mukosa). Sejumlah kecil kasus telah ditularkan melalui ibu ke
janin atau melalui tranfusi darah atau benda yang berasal dari darah yang terkontaminasi
dengan virus HIV. Jumlah penduduk yang menderita AIDS semakin meningkat dan sebagian
besar penduduk yang telah terinfeksi HIV tidak menunjukan gejala apapun (Waluya, 2001).
Gejala AIDS merupakan hasil kondisi yang umumnya tidak akan terjadi pada individu
dengan sistem kekebalan yang sehat. Kebanyakan kondisi ini adalah infeksi yang disebabkan
oleh bakteri, virus, fungi dan parasit yang dalam keadaan normal bisa dikendalikan oleh
elemen sistem kekebalan yang dirusak HIV. Infeksi opportunistik umum didapati pada
penderita AIDS. Penderita AIDS juga beresiko lebih besar menderita kanker seperti sarkoma
kaposi, kanker leher rahim dan kanker sistem kekebalan yaitu limfoma.
HIV terbagi atas dua tipe, yaitu HIV-1 dan HIV-2. Penderita AIDS pada umunya
terifeksi oleh HIV-1 dan HIV-2, perbedaan yang mencolok dari kedua tipe HIV ini adalah
HIV-1 lebih reaktif dari HIV-2. Selain itu, antigen yang reaktif terhadap core protein HIV-1
tidak reaktif terhadap core protein HIV-2, begitupun sebaliknya. Perbedaan lainnya adalah
HIV-1 merupakan tipe yang lebih virulen dan merupakan penginfeksi yang umum pada
penderita AIDS seluruh dunia dibandingkan HIV-2 (Hubah RD, 2014). Diagnosis infeksi oleh
HIV dapat ditegakkan dengan memperhatikan berbagai parameter klinik maupun laboratorik.
Namun setelah terinfeksi oleh virus HIV, seseorang penderita biasanya tetap sehat sehingga
diagnose laboratorium sangat diperlukan (Ratih, 2012). Salah satunya pemeriksaan yaitu
menggunakan metode Elisa. Metode elisa ini digunakan untuk mendiagnosis infeksi HIV
secara dini terutama pada neonates dan seronegatif dengan orang tua riwayat terpapar virus
 HIV. Antigen HIV dapat terdeteksi dalam darah pada saat jumlah antigen lebih banyak
daripada antibodi. Oleh sebab itu deteksi antigen hanya dapat dilakukan hanya stadium dini
infeksi dimana belum terbentuk antibodi dalam jumlah banyak ataustadium akhir penyakit
dimana tidak lagi terbentuk antibodi.

Penularan
Seseorang yang positif-HIV asimtomatis dapat menularkan virus. Adanya penyakit
seksual lainnya seperti sifilis dan gonorhoe meningkatkan resiko penularan penyakit HIV
sebanyak seratus kali lebih besar, karena peradangan membantu pemindahan HIV menembus
barier mukosa. Sejak pertama kali HIV ditemukan, aktifitas homoseksual telah dikenal sebagai
faktor resiko utama tertularnya penyakit ini. Resiko ini bertambah dengan bertambahnya
jumlah pertemuan seksual dengan pasangan yang berbeda. Transmisi HIV masuk ke dalam
tubuh manusia melalui 3 cara, yaitu:
1. Secara vertikal yaitu dari ibu yang terinfeksi HIV ke anak, terjadi selama mengandung
(intrauterine), persalinan (intrapartum) dengan resiko penularan 14% dan menyusui
(postpartum) dengan resiko penularan 11- 29%.
2. Secara transeksual atau kontak seksual (termasuk seks-oral), yaitu pada homoseksual
maupun heteroseksual dengan prevalensi 70-80%.
3. Secara horizontal yaitu antar darah atau produk darah yang terinfeksi saat transfusi darah,
transplantasi organ, tindakan hemodialisis, asas sterilisasi yang kurang diperhatikan pada
pemakaian bersama jarum suntik injecting drugs use (IDU) atau secara bergantian pada
pengguna obat-obat terlarang, pembuatan tato, tindik dan perawatan gigi. (Nasronudin,2014).

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) atau nama lainnya enzyme immunoassay

(EIA) merupakan teknik biokimia yang banyak digunakan di bidang imunologi untuk
mendeteksi adanya antibody atau antigen pada suatu sampel. ELISA diperkenalkan pada tahun
1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen
dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai reporter
label. Terdapat beberapa jenis teknik ELISA, yaitu (1) Indirect ELISA; (2) Direct ELISA; (3)
ELISA Sandwich; (4) ELISA Multiplex dan (5) ELISA Biotin Streptavidin.
Dalam penggunaan sehari-hari ELISA bisa digunakan unruk melabel suatu antigen atau
mengetahui antibody yang ada dalam tubuh. Apabila kita ingin mengetahui antigen apa yang ada
di dalam tubuh, maka yang diendapkan adalah antibody- nya, begitu pula sebaliknya. Untuk
mendeteksi kadar suatu protein, maka dapat digunakan teknik ELISA sandwich assay dengan
dengan mengedapkan antibody pada well plate.
 Gambar 1. Prinsip metode ELISA sandwich untuk memeriksa kadar protein sampel

Fungsi dari test ELISA yaitu bukan hanya untuk mengetahui

keberadaan suatu antigen dengan antibodi tetapi juga untuk mengukur kadar
antigen atau antibodi tersebut dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Spektrofotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya
yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang
terjadi pada well mcroplate dan setelah pemberian substrat, enzim yang terikat
pada antibody ke dua pada kompleks antigen-antibodi yang terbentuk akan
memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan
optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau
menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan
menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk
mengestimasi kadar protein tersebut.
LAMPIRAN

https://youtu.be/7nvtMJnOQUs
 DAFTAR PUSTAKA

1. http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction (diakses 25 Mei 2021)

2. Shenkin, Alan. 2006. Serum Prealbumin: Is It a Marker of Nutritional Status or of Risk of
Malnutrition?.Clinical Chemistry. v. 52, p.2177-2179
3. Johnson AM, Merlini G, Sheldon J & Ichihara K. 2007. Clinical indications for plasma
protein assays: transthyretin (prealbumin) in inflammation and malnutrition1) International
Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) IFCC Scientific Division
Committee on Plasma Proteins (C- PP). Clin Chem Lab Med 2007;45(3):419–426. by
Walter de Gruyter • Berlin • New York. DOI 10.1515/CCLM.2007.051
4. Ylatupa, Sari, 1997. Liquid Handling Aplication Note. www.biohit.com (diakses 25 Mei
2021)