2A Ingenieria bioguimice sbles a los esfuerzos cortan- vegetal S07 er ama y aa igi de tes, debit jular. Las células vegetales rece e.Ramente, con tiempos de generacion de 2 8 cere Notmalimente Ios compuestos que Prox se ass g son excretados al exterior sino a T interior de las vacuolas, 1o Se acumulan en el inter 0 que crea problemas adicionales en las oe dienes de recuperacion de los productos. En foe eultivos en suspension de células vegetales ee dificil tener células aisladas y 1a forma nor- ‘nal de crecimiento son los agregados celulares, de més de 1.000 um de diémetro. Este fenéme- ho ocasiona, a veces, problemas de sedimenta- ign en el interior del reactor, dificultad en la toma de muestras y limitaciones a la difusin de sustancias al interior de los agregados. Los cultivos de células vegetales se inician a partir de un callo, es decir una masa de células no diferenciadas que se deriva de un fragmento de tejido vegetal. Estos callos se cultivan sobre medios sélidos y tienen un crecimiento lento y una gran heterogeneidad celular, pero permi- ten obtener los cultivos de células en suspen- sién cuando se transfieren a un medio liquido de composicién adecuada y en condiciones de agitaci6n. Los cultivos en suspensién represen- tan una forma de crecimiento més répida y ho- mogénea. EI metabolismo de las células vegetales es similar al de otras células heterétrofas, de for- ma que pueden utilizar azticares como fuente de carbono y energia. Para la produccién de metabolitos secundarios, la sacarosa parece ser la fuente més eficaz. El resto de los compues- tos necesarios para el crecimiento estd formado por sales mineraes algunas vitaminas y fito- die tome : componentes que més influyen se forma de crecimiento y en la produccién : olitos secundarios son las horm« : auxinas y citoquininas. Del ae cue a . Del balance entre estos ineages, G8 Sompuestos depende la diferen- Saye Cultivos y, por tanto, la expresion °s genes del metabolismo i desdiferenciacién es un eaten eee fa a ace 0 Para el crecimiento de las células erueee — i6n, pero, al mismo tiempo, un inconvenj, ae Ia produccién de metabolitos secundarin® La diferenciacién celular, la seleccién y ¢y tabilizacién de las lineas celulares productoras y la baja productividad son los principales pro, ‘blemas con que se enfrenta la aplicacién de joy cultivos de células vegetales a la produccién dg substancias al nivel industrial. Una alternativa a la utilizacién de cultives de células es el uso de las ratces transformadas obtenidas por transformacién genética de t dos vegetales por la bacteria patdgena del sue. lo Agrobacterium rhizogenes. Las rafces trans. formadas pueden utilizarse en la produccién de cualquier metabolito derivado de las rafces de una planta, con las ventajas, respecto a los cul- tivos de células, de un crecimiento més répido, mayor estabilidad genética y mayor productivi- dad. Las células vegetales también se utilizan pa- ra a realizacién de biotransformaciones, es de- cir reacciones bioqufmicas sencillas en las que no es necesaria la diferenciacidn ni el creci- miento celular. Un ejemplo es la hidroxilacién estereoespecifica en posicién 12-f de la f-me- til-digitoxina para producir la 6-metil-digoxina, un importante glucésido cardfaco, realizada por células de Digitalis lanata. 2.3. Metabolismo El término metabolismo se aplica a todos los procesos quimicos que tienen lugar dentro de un organismo vivo. La célula incorpora unos nutrientes que se convierten en constitu- yentes celulares a través del proceso denomi- nado biosintesis 0 anabolismo, Estas reaccio- nes requieren una energfa que la célula obtiene a partir de la oxidacién o degradacién de subs- tancias, reacciones catabélicas, con la consi- guiente produccién de compuestos de desecho- Este sistema es el que utilizan los organismos quimidsrofos. En el caso de los organismos fo- i profes utilizan la energfa de la luz. Ademés s teacciones de biosintesis, la energta 0b — L Escaneado con CamScannerCapitulo 2: Biok °8'¢ de los microorgonismos y clues de interés indsrial 25 . las células, se puede = enida por “e "de consumir e; wwatizacion de trabajos de tipo mecénico ra rertico, ete. 1 que se denomina, en genens mrantenimiento (figura 2.3). 2.3.1. Catabolismo En el metabolismo quimiétrofo, la fuente de energia actiia como donador de electrones y, para que se produzca la liberacién de ener- Ya, se requiere wna reaccién de oxidaci6n-re- Guecién completa, es decir, la presencia de un aceptor de electrones. Son numerosas las subs- tancias que pueden actuar como aceptores ex- ternos de electrones, desde’el oxigeno’en la respiraciOn aerobica, hasta el nitrato, nitrito, Sulfato, o fumarato, a través de la denominada Tespiracién anaerobia, El-aprovechamiento de energfa se realiza a través de la fosforilacion oxidativa, en un proceso denominado cadena Tespiratoria o de transporte de electrones. En él intervienen los sistemas de membranas celula- Tes, y es independiente del substrato de partida (figura 2.4). : En otros casos, en ausencia de aceptores ex- ternos de clectrones, los organismos llevan a cabo reacciones de oxidacién-reduccci6n equi- libradas internamente, que conducen a la ob- tencién de energfa a través de la fosforilacién a nivel de substrato. Es el proceso conocido como fermentaci6n (figura 2.5). Muchos microorganismos y células utilizan monosacéridos como fuente de energfa y car- NUTRIENTES PRODUCTORES DE ENERGIA rae FUENTEDEP Fours 2.3, Exquema general del mele: bolismo. Escaneado con CamScanner26 Ingenieria bioquimica COMPUESTOS ORGANICOS ELECTRONES CADOURESMRATONA 5 INTERMEDIARIOS BASICOS (NADA) 7 ADE SRE ae FIGUEA 2.4. Aprovechanian, de energia, en forma de AT en la cadena respiratoria g ye dela fsfacin onda co, un microorganismo aeréhe de las hexosas monofosfato (HMP, también de, COMPUESTOS ORGANICOS nominada de las pentosas fosfato), la de Eine. Doudoroff y la ruta de la fosfocetolasa, Las dos primeras vias funcionan simulténey. mente en las células eucariotas y numerosa, COMPUESTOS INTERMEDIOS bacterias, y pueden ser utilizadas tanto por e1 metabolismo aerébico como por el fermentat- 3 vo. La principal funcién de la glucélisis es ge- nerar energfa y piruvato, mientras que la ruta 5 t de las hexosas monofosfato proporciona dife- EOS FUNADI) | _ Tentes precursores imprescindibles para la si. ADP. AGDE) tesis de nuclestidos, aminodcidos arométicos y iar la vitaminas, ademés de los equivalentes de re- Arr. duccién en forma de NADPH+H'*. En la glucs- ACEPIORES DEL BCHRONES lisis (ver figura 2.6) se producen dos moles de piruvato por mol de glucosa, con una ganna gti de energfa de dos moles de ATP. El proceso es- 4 catalizado por diez enzimas y consta de una fase preparatoria en la que se activan por fos- PRODUCTOS DE FERMENTACION e Pr forilacién las moléculas de hexosa, con const Ficura 2.5. Aprovechamiento de energia, en forma de AIP, por fosforilacién a nivel de substrato en un microorga- nismo que realiza un metabolismo fermentativo. Las mis, mas substancias generados o partir de la fuente de carbo. no actéan como aceptores de electrones bono, pero no todos son metabolizados a tra: vés de las mismas vias metabélicas, Existen cuatro rutas diferentes para el catabolismo de los azticares: la glucdlisis (también denominada via de Embden Meyerhof-Parnas, EMP), la via mo de ATP, y otra de oxidaci6n y ganancia de energfa, realizada con las triosas fosfato gent tadas, a partir de las hexosas, mediante la ac ci6n de la aldolasa. La ruta de las hexosas mo- nofosfato se diferencia de la anterior por SY capacidad para producir, ademés del gliceral- dehido-3-fosfato, azticares fosforilados con di ferente mimero de étomos de carbono, gracits a la presencia de enzimas como las transaldo- lasas y transcetolasas (ver figura 2.7). La ruta de Etner-Doudoroff se presenta & tun grupo de bacilos gram negativos (Pseudo monas y Zymomonas) y también puede set Ut Escaneado con CamScannerCapitulo 2: Bj * Biologia de los mi Imicroorganismes y eélulas de interés industrial 27 — eas = GLUCOSA en ‘ADP GLUCOSA-6-P FRUCTOSA-6-P ATP. ‘ADP FRUCTOSA-1,6-diP A GLICERALDEHIDO3-P- =—= DIMDROXICETONAP Pi ‘NADY NADAL 134iP.GLICERATO ‘ADP ‘Are 3-P-GLICERATO 2:P-GLICERATO , P-ENOLPIRUVATO AGI T Cr ‘ATP Foe PIRUVATO ECUACION GLOBAL: (Goss 2NAD*+2ADP-42P, —e 2 pinnate +2NADH + 2H1*+2ATP Ge a ee FIGwRA 2.6. Via de EmbdenMayethoF (0 gluclisis) de de- gradacién de azécares hasta piruvalo. lizada tanto en el metabolismo aerSbico come en el fermentativo, En la figura 2.8 se presen’ la secuencia de reacciones asf como la eouacisn alobal hasta la obtenci6n de piruvato y gliceral- dchido-3-fosfato, Es de destacar que el rend Miento energético de esta via es relativamente ponte ye ave s6lo proporciona un mol de ATP Le vie giucosa degradado. raree Mia de la fosfocetolasa puede conside- enon Yariante de la ruta de las hexosas Tas Dacenato gue se encuentra solamente en tas bese lstcas heterofermentatves Es- recen de las enzimas aldolasa, transaldolasa y transcetolasa propias de las Tutas EMP y HMP. En este caso (ver fi 2.9) las hexosas se conviert xilulosa-5- ot nvierten en xilulosa-5- fosfato que se metaboliza con la formacién de acetil-fosfato (compuesto con un enlace rico en energfa) y gliceraldehido-3-fosfato. Si el acetil-fosfato se metaboliza hacia la formacién de acetato, el enlace rico en energfa se conser- va dando lugar a un mol de ATP, con un ba- lance global comparable al de la glucélisis. Mientras que si la metabolizacién da lugar a la formacién de etanol, este enlace se pierde y 7 ganancia global de energfa es de un mol de En el caso del metabolismo respiratorio, las vias de degradacién de las distintas fuentes de energia convergen en la formacién de Acido pi- rivico. Este es oxidado a acetato, el cual entra en el ciclo del dcido citrico (también denomi- nado de los dcidos tricarboxflicos, TCA) sien- do, a su vez, oxidado a CO, y H,0 (ver figura 2.10). Los electrones generados en estas reac- ciones de oxidaci6n, transportados en forma de NADH+H, son transferidos al aceptor ex- terno de electrones a través de la cadena respi- ratoria, con la correspondiente produccién de energia en forma de ATP. Pero, el ciclo del Aci- do cftrico también tiene gran importancia para Ia biosintesis: proporciona una serie de precur- sores para las vias de produccién de aminodci- dos y cofactores. "Algunos microorganismos son capaces de llevar a cabo oxidaciones incompletas de la fuente de carbono, con la generacién de pro- duetos finales que se acumulan en el medio. Un ejemplo de estas oxidaciones parciales lo cons- fituye la producci6n de dcido acético a partir de ttanol por las bacterias del género Glucono- bacter. ———————— Escaneado con CamScannerIngenieria bioquimica 28 GLUCOSA ATP hice GLUCOSA 6P-GLUCONATO RIBULOSA-S-P RIBOSA-S-P SEDOHEPTULOSA-7-P »~< FRUCTOSA-6P a GLUCOSA‘6P 6P. or NADPH GLUCONOLACTONA-6-P NADP coy x NADPH XILULOSA-SP GLICERALDEHIDO-3-P ERITROSA 4.P FRUCTOSA-6-P GLICERALDEHIDO-3-P ECUACION GLOBAL: 3Glucosa + 6NADP++3ATP—e 2fructosa-6P + gliceraldehido3-P + 6NADPH + 6H++3ADP+3CO,, Fisura 2.7. Via de las hexosas monofosfato (0 pentosas fosfato) para la ut En condiciones anaerobias, en ausencia de un aceptor externo de electrones, los equiva- lentes de reduccién generados en'la produc- cién de dcido pirtivico son regenerados utili- zando aceptores de electrones internos y, por tanto, formando productos finales reducidos como etanol o dcido lactico. Se estima que en un organismo con respiracién aerdbica, la efi- cacia del aprovechamiento energético repre- senta un 43% del total, mientras que en la fer- mentacién se aproxima al 32%. 1cién de azticares. Los microorganismos pueden realizar nU- merosos tipos de fermentaciones a partir d¢ substratos como los glticidos, los aminodcidos las bases nitrogenadas. En el cuadro 2.5, se dam algunos ejemplos de fermentaciones y microor- ganismos que las llevan a cabo. La cantidad é¢ ATP producida por un microorganismo, 2 Pa" tir de un determinado substrato, condiciona It cantidad de biomasa que puede obtenerse °? cultivo, Esto es debido a que el coste enersét Co necesario para el ensamblaje de las distin'® Escaneado con CamScanneree ‘ADP GLUCOSA6-P en NADPH 6P-GLUCONATO 2.CETO3-DEOXI- A PIRUVATO — GLICERALDEHIDO3. Pip NAD+ ree 13-4iP-GLICERATO ‘ADP ‘GLUCONATO. ‘ATP 3-P.GLICERATO 2-P-GLICERATO P-ENOLPIRUVATO fae ATP PIRUVATO ECUACION GLOBAL: Chica + 2NAD(P}++ ADP + F,—= 2 pirwvato +2NAD(P)H +24 + ATP| FicuRa 2.8. Via de EtnerDoudoroff de conversion de azé- cares a piruvato. Mactomoléculas es, aproximadamente, el mis- Mo para todos los microorganismos. 2.3.2. Anabolismo ta 4 diferencia de lo'que ocurre en el catabo- ‘mo, las vias metabélicas de biosintesis son Tucho més parecidas en todos los microorga- nismos, y se inician a partir de’doce metaboli- a Jeans totes © intermediarios bésicos (figura tidos neg meciante el consumo de ATP, nucles- azufre attidos (NADPH+H"*), nitrégeno y » $e transforman en vitaminas, NADP* Tofactores y en las unidades estructurales de 2s Mactomoléculas. Las distintas unidades es- fructurales (aminodcidos, azdcares, nuclestidos Y 4cidos grasos) son ensambladas posterior- mente para dar lugar a las correspondientes Mmacromoléculas. Estos doce metabolitos pre- Cursores constituyen el puente metabélico en- tre las reacciones de degradacién y de sintesis. Las vias metabilicas de sintesis difieren bas- tante en complejidad y, mientras algunas son li- neales, como la ruta de sintesis de la histidina, otras son ramificadas, como la via de sintesis de los aminodcidos aspartato, lisina, asparragi- ha, metionina, treonina ¢ isoleucina a partir de los Acidos oxalacético y pirtivico, y otras re- quieren el aporte de muchos precursores, como és el caso de la biosintesis del nticleo heteroci- clico de las bases ptricas. * Los metabolitos precursores no contienen nitrégeno ni azufre, que deben obtenerse a partir de compuestos presentes en el medio de Cultivo, pero que son incorporados en su forma teducida, NH,* y HS. Las fuentes de nitrége- no pueden ser muy variadas, desde el nitré- geno gas (s6lo en algunas bacterias) hasta las diferentes formas de nitrégeno orgénico, pa- sando por compuestos inorgénicos con diferen- te grado de oxidacién del dtomo de nitrégeno. La asimilacién de las diferentes formas de ni- trégeno requiere vias metablicas especificas y puede ser una caracteristica propia de un de- terminado grupo de microorganismos. La in- corporaci6n del nitrégeno a las células repre- senta un consumo energético que es funcién de su estado de oxidaci6n en el compuesto de par- tida. La fuente de azufre més tipica en los me- dios de cultivo son los sulfatos, que son incor- porados a través de una compleja serie de reac- ciones que consumen energfa y poder reductor. ‘A diferencia de los anteriores, el fésforo no cambia de estado de oxidacién en el proceso de Escaneado con CamScanner30 Ingenieria bioquimica Gaia ie Fis ge PENTOSAS k ATP ‘ADP PENTOSAS-P ‘NADPH GLUCONOLACTONA4-P 6-P-GLUCONATO. NADP*+ COr co RIBULOSA-5-P aN ACETATO. ACETILP, ATP ADP Kee a Py ACETIL-CoA NADH o x ths ACETALDEHIDO | 3P-GLICEI NADH NAD+ ETANOL ECUACION GLOBAL: Glucosa + NAD(P)*+ ADP+ P| = pirwato + etanol + NAD(P)H + H+ GLICERALDEHIDO-3-P 1,3-4iP-GLICERATO 2P-GLICERATO P-ENOLPIRUVATO TP PIRUVATO Pentosa+ NAD(P)++ 2ADP + 2°) = piruvato + aetalo+ NAD(P)H + Ht + 2A TP ‘NADP+ NADPH ‘ADP ‘ATP 1 RATO. ‘ ADP A ATP+ CO; FIGURA 2.9. Via de la fosfocetolasa de utilizacién de hexosas y pentosas. asimilaci6n-y, ademés, esta asimilacién va aso- ciada a las vias catabélicas. El f6sforo se asimila en forma de fosfato, y éste, a través de la for. maci6n de intermediarios fostorilados, se utiliza Para la sfntesis de ATP en cualquier reaccién de fosforilacién, La energfa y el poder reductor necesarios Para la sintesis representan un coste muy ele. vado para las células. Por esto, cuando las uni. dades estructurales o’sus precursores est4n pre- sentes en el medio de cultivo, algunos mictoot- ganismos son capaces de asimilarlos y, por tal” to, de realizar un ahorro energético importat- te. También pueden existir células incapaces Sintetizar una determinada unidad estructu Por falta de una enzima de una via biosintétic® En este caso, reciben el nombre de auxéirofts (en contraposicién a protétrofas) y su cree miento depende de la presencia de dicho co™ Puesto en el medio de cultivo, Escaneado con CamScannerFiGURA 2.10. Ciclo del dcido citrico. Copitulo 2: Biologia de los microorganismos y células de interés industrial 31 Principoles tipos de fermentacion OXALACETATO NADH: NAD+. MALATO FUMARATO FADES FAD. ‘SUCCIYATO. LI oon a GTP i GDP+P, +P. Ssuccintt NADH PS 60s Firwato +4NAD*+FAD+GDP4R —= 3002+ 4NADH +41 + FADH+ GTP ECUACION GLOBAL: CUADRO 2.5 PIRUVATO NADt + CoA cole NADH ‘ACETIL-CoA CoA ISOCTTRATO, he NADH+ CETOGLUTARATO cod ee eee eee Akcohélica Saccharomyces Hexosas | Etoncl y CO, Zymemonos Pichia Pentosas Homeléctica Lactococcus Hexosas Usetico Lactobacillus casei Heteroléctica Leuconostoc Hexosas Lsetico, etenel, ecético y CO, Lactobaeillus brevis Pentosas Propiénica Propionibacterium Kosong Propiénico, acético y CO, ictico: Butirica Clostridium butyricum Hexosas Butrico, acético, Hy CO, Acetona-butanol Closridivm acetobutylicum Hexosas Buel en, etonol, acético, 1 Hy Acido mixta Escherichia Hexosas Léctico, acético, férmico, suecinica, Klebsiella ‘etanol, 2,3-butanodiol, Hy y COp Enterobacter Homoacetogénica ‘Acetobacterium Fructosa Acbtico ‘Metanogénica ‘Methanosarcina Acético ‘Metano y CO, ‘Methanothrix Escaneado con CamScanner32 Ingenieria bioquimica 2.3.3. Metabolismo secundario . » El término de metabolito secundario hace referencia a aquellos productos metabélicos que no estén relacionados directamente con el crecimiento del organismo que los produce. En este grupo se incluyen compuestos como los al- caloides, las micotoxinas, los pigmentos o los antibiéticos. Muchos de ellos tienen importan- tes aplicaciones terapéuticas por su actividad farmacolégica como inmunosupresores, antiin- flamatorios, cardioténicos, inhibidores enzimé- ticos, antimicrobianos 0, en agricultura, como antihelminticos, herbicidas, y fungicidas, Los microorganismos son una fuente impor- tante de metabolitos secundarios, ya que se han descrito més de 8,000 compuestos produci- dos principalmente por diferentes géneros de actinomicetes, eubacterias y hongos. Aunque no se conoce exactamente cudl es la funcién de los metabolitos secundarios, to- dos ellos presentan una serie de caracteristicas comunes; ei COMPUESTOS ‘ORGANICOS [ INTERMEDIARIOSBASIOS ss qpesesTRUCTURALES _MACROMOLECULAS Glucosa I-fosfato ‘Azicares ___|-»-| Polisacdridos |Glucosa 6-fosfato Ribosa 5-fosfato Acidos grasos }=|Grasas Eritrosa 4-fosfato Fosfoenol piruvato Aminoscidos Ly | proteinas Piruvato 3-fosfoglicerato Nuclestidos |p| Acidos nucleicos Cetoglutarato = [Succinil-CoA iguanas (Oxalacetato Dihidroxiacetona-P Cofactores Acetil-CoA CO; FIGURA 2.11. Esquema general del ano- bolismo: la biosintesis de los cofactores, vitaminas y macromoléculas se realiza ¢ partir de doce intermediarios bésicos que se originan en reacciones del cote bolismo. a) No son esenciales para el crecimiento. 5) Presentan una gran variedad de estructu- ras quimicas distintas, ¢) Se sintetizan en vias biosintéticas espe- ciales, largas y complejas, catalizadas por enzimas propias. d) Se producen como mezclas de diferentes compuestos relacionados estructural- mente entre sf. Las rutas del metabolismo secundario se ori- ginan siempre a partir de precursores de la red metabélica primaria. Pero, la gran diversidad es- tructural de los metabolitos secundarios, hace muy dificil su clasificacién y la definicién de unas vias metabélicas concretas Para la sintesis de ca- da uno de sus diferentes tipos. Asf, por ejemplo, la sintesis de tetraciclina requiere 75 reacciones enzimaticas que no estén Presentes en el meta- bolismo primario. El metabolismo primario proporciona los Precursores que son modificados y ensambla- dos de distintas formas para producir unas es- Escaneado con CamScanner