4.4.2 Citric acid. Production of citric acid by A.

niger and yeasts amounts to about 1 million tons per year (Magnuson and Lasure, 2004). Annual sales have reached $2 billion. The best strains of A. niger make over 200 g l-1 citric acid from 250 g l-1 glucose or sucrose (Al-Obaidy and Berry, 1979). Keys to the fermentation are excess carbon source, low pH, dissolved oxygen and limited concentrations of certain trace metals and phosphate (Roehr, 1998). Glucose is converted to pryuvate by the EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP) pathway, then to acetylcoenzyme A which enters the TCA cycle by condensing with oxaloacetate to form citric acid. Citric acid production is stimulated by growing this fungus in a high sucrose concentration (1020%). This is probably the result of the sugars ability to cause the intracellular accumulation of fructose 2,6-bisphosphate which activates glycolysis (Kubicek-Pranz et al., 1990). Fructose 2,6-bisphosphate is the product of phosphofructokinase II. Another key to a successful citric acid fermentation by this fungus is a deficiency of Mn2+. Also important is the restriction of the activity of isocitrate dehydrogenase, while maintaining an active citrate synthase. This prevents oxidative decarboxylation of isocitrate to a-ketoglutarate. As the equilibrium of aconitase, which converts citric acid to isocitric acid, is markedly in favour of citrate, citric acid accumulates. Two isocitrate dehydrogenases, mitochondrial and NADP+ specific, are inhibited by citrate. As the cofactor of this enzyme is Mg2+ or Mn2+, citrates ability to chelate these metals restricts enzyme activity; thus citrate inhibits its own degradation. Citrate inhibition of isocitrate dehydrogenase is in direct proportion to citric acid yield. In addition to Mn2+, the metal deficiencies necessary for good citric acid production in different media and by different strains of A. niger are Fe2+ and Zn2+. However, the major required limitation is that of Mn2+. The principal regulatory control site in the reactions from glucose to citrate is phosphofructokinase. This enzyme is inhibited by citrate, an event that would not be favourable for overproduction of citric acid. However, Mn2+ deficiency slows down growth, leading to degradation of intracellular nitrogenous macromolecules and a fivefold increase of NH4 + in mycelia. The high ammonium concentration reverses citrate inhibition of phosphofructokinase, thus assuring the continued conversion of glucose to citrate. Mutants whose phosphofructokinase I is partially desensitized to citrate inhibition are less dependent on low Mn2+ for high citric acid production (Schreferl et al., 1986). Citrate inhibition of phosphofructokinase is also reversed by fructose 2,6-diphosphate and AMP (Kubicek, 1998). The optimum pH for citric acid production by A. niger is 1.72.0. At pH values higher than 3.0, oxalic and gluconic acids are produced instead. Low pH inactivates glucose oxidase and prevents gluconate production (Kubicek and Roehr, 1986). Mutants of A. niger with greater resistance to low pH are improved citric acid producers. Other selective tools include resistance to high concentrations of

citrate (Leopold, 1959), and sugars (Schreferl-Kunar et al., 1989). Yeasts of the Candida genus also excrete large amounts of citric acid and isocitric acid. The key of the yeast citrate process appears to be a sharp drop in intracellular AMP following nitrogen depletion, inhibiting the AMP-requiring isocitrate dehydrogenase. Candida guilliermondii excretes large quantities of citric acid without the undesirable isocitric acid when cultured in the presence of metabolic inhibitors (such as sodium fluoracetate, n-hexadecylcitric acid or trans-aconitic acid). These inhibitors block the TCA cycle at the aconitase step. Mutation of Candida lipolytica to aconitase deficiency is also effective (Akiyama et al., 1973). The optimum pH for the yeast citrate process is above 5.0. Lower pH values lead to production of polyhydroxy compounds such as erythritol and arabitol (Tabuchi et al., 1973). The yeast process yields a conversion of 140150% based on hydrocarbon used, a productivity of 1.4 g l-1 h-1 and a broth concentration as high as 225 g l-1 (Kubicek and Roehr, 1986). High concentrations of citric acid are also produced by Candida oleophila from glucose (Anastassiadis et al., 2002). In chemostats, 200 g l-1 can be made and more than 230 g l-1 can be produced in continuous repeated fedbatch fermentations. This compares to 150180 g l-1 by A. niger in industrial batch or fed-batch fermentation in 610 days. The key to the yeast fermentation is nitrogen limitation coupled with an excess of glucose. The citric acid is secreted by a specific energy-dependent transport 304 S. Sanchez and A. L. Demain
2008 The Authors Journal compilation 2008 Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd, Microbial Biotechnology, 1, 283319

system induced by intracellular nitrogen limitation. The transport system is selective for citrate over isocitrate. Yarrowia lipolytica produces up to 198 g l-1 citric acid in fed-batch fermentations on sunflower oil with a very low production of isocitric acid (Aurich et al., 2003).

4.4.2 cido ctrico. La produccin de cido ctrico por A. niger y levaduras asciende a alrededor de 1 milln de toneladas por ao (Magnuson y lasurado, 2004). Las ventas anuales han alcanzado $ 2 billones de dlares. Las mejores cepas de A. niger hacen ms de 200 g l-1 cido ctrico a partir de 250 g l-1 de glucosa o sacarosa (Al-Obaidy y Berry, 1979). Claves para la fermentacin son el exceso de fuente de carbono, bajo pH, oxgeno disuelto y concentraciones limitadas de ciertas trazas de metales y el fosfato (Roehr, 1998). La glucosa se convierte en pryuvate por la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP) va, y luego a acetylcoenzyme A que entra en el ciclo de Krebs por condensacin con oxalacetato para formar cido ctrico. la produccin de cido ctrico es estimulado por el crecimiento de este hongo en una alta concentracin de sacarosa (10-20%). Este es probablemente el resultado de la capacidad de azcar a causa de la acumulacin intracelular de fructosa 2,6-bisfosfato que activa la gluclisis (Kubicek-Pranz et al., 1990). La fructosa 2,6-bisfosfato es el producto de la fosfofructoquinasa II. Otra clave para una fermentacin xito del cido ctrico por este hongo es un deficiencia de Mn2 +. Tambin es importante la restriccin de la actividad de la isocitrato deshidrogenasa, mientras que el mantenimiento de un citrato sintasa activa. Esto evita que la descarboxilacin oxidativa de isocitrato a a-cetoglutarato. A medida que el equilibrio de la aconitasa, que convierte el cido ctrico para isoctrico cido, es marcadamente a favor de citrato, cido ctrico se acumula. Dos isocitrato deshidrogenasas, mitocondrial y NADP + especficas, son inhibidas por el citrato. Como el cofactor de esta enzima es Mg2 + o Mn2 +, la capacidad de citrato de quelato estos metales restringe la actividad de la enzima, por lo que el citrato inhibe su propia degradacin. Citrato de la inhibicin de la isocitrato deshidrogenasa est en proporcin directa a la produccin de cido ctrico. Adems de Mn2 +, las deficiencias de metal necesario para buena produccin de cido ctrico en diferentes medios de comunicacin y por diferentes cepas de A. niger se Fe2 + y Zn2 +. Sin embargo, el limitacin principal es que requiere de Mn2 +. El director sitio de control reglamentario de las reacciones de la glucosa a citrato es fosfofructoquinasa. Esta enzima se inhibe por el citrato, un evento que no sera favorable para la sobreproduccin de cido ctrico. Sin embargo, Mn2 + deficiencia retrasa

el crecimiento, lo que lleva a la degradacin intracelular de macromolculas nitrogenadas y un aumento de cinco veces de NH4 + En el micelio. La alta concentracin de amonio invierte citrato de inhibicin de la fosfofructoquinasa, por lo tanto asegurar la conversin continua de la glucosa al citrato. Mutantes cuyas fosfofructoquinasa I es parcialmente insensible al citrato de inhibicin son menos dependientes de los bajos Mn2 + para la alta produccin de cido ctrico (Schreferl et al., 1986). la inhibicin de la fosfofructoquinasa citrato tambin invierte por la fructosa 2,6-difosfato y AMP (Kubicek, 1998). El pH ptimo para la produccin de cido ctrico por A. niger es 1.7-2.0. En valores de pH superiores a 3.0, oxlico y glucnico Los cidos son producidos en su lugar. Un pH bajo inactiva la glucosa oxidasa y previene la produccin de gluconato (Kubicek y Roehr, 1986). Los mutantes de A. niger con mayor resistencia a pH bajo se mejoran los productores de cido ctrico. Otros selectiva herramientas incluyen la resistencia a altas concentraciones de citrato (Leopold, 1959), y azcares (Schreferl-Kunar et al., 1989). Las levaduras del gnero Candida de la tambin excretan grandes cantidades de cido ctrico y cido isoctrico. La clave de la proceso de citrato de levadura que parece ser una fuerte cada en el intracelular AMP agotamiento de nitrgeno siguiente, la inhibicin de la AMP-que requieren la isocitrato deshidrogenasa. Candida guilliermondii excreta grandes cantidades de cido ctrico sin la cido isoctrico indeseables cuando se cultivan en presencia de inhibidores metablicos (como fluoracetato sodio, cido n-hexadecylcitric o cido trans-acontico). Estos inhibidores bloquear el ciclo del ATC en la fase de la aconitasa. La mutacin de lipolytica Candida aconitasa deficiencia tambin es eficaz (Akiyama et al., 1973). El pH ptimo para la levadura proceso de citrato est por encima de 5.0. Los valores ms bajos de pH conducen a produccin de compuestos polihidroxilados, como eritritol y arabitol (Tabuchi et al., 1973). El proceso de la levadura produce una conversin de 140 a 150% sobre la base de hidrocarburos utilizado, una productividad de 1,4 g l-1 h-1 y una concentracin de caldo de hasta 225 g l-1 (Kubicek y Roehr, 1986). Alto concentraciones de cido ctrico tambin se producen por Candida oleophila partir de la glucosa (Anastassiadis et al., 2002). En quimiostatos, 200 g l-1 se puede hacer y ms de 230 g l-1 se pueden producir en fedbatch continua repetida fermentaciones. Esto se compara con 150 a 180 g l-1 de A. niger en lotes industriales o de fermentacin por lote alimentado en 6-10

das. La clave de la fermentacin de la levadura es la limitacin de nitrgeno junto con un exceso de glucosa. El cido ctrico es secretada por un transporte especfico dependiente de la energa 304 S. Snchez y A. L. Demain 2008 Los Autores Compilacin de la revista 2008 Sociedad de Microbiologa Aplicada y Blackwell Publishing Ltd, Biotecnologa Microbiana, 1, 283-319 sistema inducida por la limitacin de nitrgeno intracelular. La sistema de transporte es selectivo para el citrato en isocitrato. lipolytica Yarrowia produce hasta 198 g l-1 de cido ctrico en fed-batch fermentaciones en aceite de girasol con un muy bajo produccin de cido isoctrico (al Aurich et al., 2003).