UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

INFORME Nº11: GENÉTICA

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE PRUEBA MOLECULAR
DE APOYO AL DIAGNÓSTICO: REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

❖ CURSO: Genética y Embriología Práctica NRC: 4137

Turno: Miércoles 5:05 pm. - 06:50 pm.

❖ INTEGRANTES:
● Quispe Cueva, Karen
● Quispe Iberico, Anita
● Pérez Flores, Daira Aylin
● Portilla Rivasplata, Cecilia
● Reyes Flores, Humberto
● Rodriguez Chavez, Anita
● Romero Oré Rouse Madeley

❖ DOCENTES:

● Tipiani Muñoz, Margarita

● Peña Piscoya, Hugo
● Burgos Oliveros, Homero

2021
 SEMANA 11
INSTRUCTIVO PARA LA PRÁCTICA 11

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE PRUEBA MOLECULAR

DE APOYO AL DIAGNÓSTICO: REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR).
I. INTRODUCCIÓN
La evaluación de la expresión génica mediante los métodos clásicos requiere de una
gran cantidad de RNAm que es difícil de obtener cuando el número de muestras es
limitado o cuando el material biológico es una población de diferentes tipos celulares.
Aunque la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha tenido un fuerte impacto en
esta área, su uso en la cuantificación de la expresión génica ha sido problemática,
principalmente debido a la naturaleza exponencial del PCR, donde pequeñas
diferencias en la eficiencia de la amplificación pueden alterar de manera significativa
el rendimiento del producto de la amplificación (amplicón). Recientemente ha sido
introducida una nueva tecnología que permite la cuantificación precisa de los
amplicones durante cada ciclo del PCR (Bonilla, Párraga, López, Escolar, y del Mazo,
2002, p. 3).
Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real fueron
Higuchi y colaboradores, en 1992, al videograbar en tiempo real la incorporación de
bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV. Desde
entonces, el objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar y cuantificar las
secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes
en la reacción. El principio de la técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la
forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplificación es diferente.
El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados
sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace
referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a diferencia
de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la
secuencia blanco (Mas, Poza, Ciriza, Zaragoza, Osta, y Rodellar, 2016, p. 73-74).

II. COMPETENCIAS
• Reconoce las implicancias de la técnica de PCR en tiempo real y sus
aplicaciones.

• Emplea los conocimientos de la técnica del PCR en tiempo real en el

diagnóstico propuesto: Displasia Espondiloepifisaria Congénita
III. PRÁCTICA
Instrucciones: Contesta las siguientes preguntas en forma clara y precisa, en base
a la direccionalidad del diagnóstico del PRC real time para la displasia
espondiloepifisaria congénita.
1. Gen alterado en esta enfermedad
La displasia espondiloepifisaria congénita, es un tipo de displasia ósea manifiesta
desde la etapa de lactante, se produce por mutaciones en el gen COL2A1, ubicado
en el cromosoma 12, causando defectos en el colágeno de tipo II, un componente
principal del cartílago. Es un raro trastorno de los huesos en crecimiento que da lugar
a un acortamiento de tronco preferente con baja talla.

La proteína que forma el colágeno tipo II, molécula que se encuentra principalmente
en el cartílago y en el humor vítreo. Este es esencial para el desarrollo normal de
huesos y otros tejidos conectivos. Las mutaciones en el gen pueden interferir con el
montaje de las moléculas de colágeno tipo II, evitando que los huesos se desarrollen
correctamente y produciendo los signos y síntomas de esta afección.
2. Tipo de enfermedad autosómica

Esta patología es hereditaria de carácter autosómica dominante, heterocigosis en

el gen COL2A1.

3. Que es PCR convencional y PCR real time, indique diferencias,

semejanzas, ventajas y desventajas de ambas técnicas

- PCR convencional PCR real time

Diferencias Detecta un único Detecta y

segmento del ADN cuantifica el ADN

Semejanzas Ambas tienen el mismo principio de multiplicar la región

de interés

Sensibilidad
Cuantificación
Confirmación temprana Monitoreo de todo el
del diagnóstico procedimiento (tiempo real)
Ampliamente utilizado Disminución del riesgo de
Ventajas
Equipos menos costosos contaminación
Rapidez, ya que no se necesita
ningún otro proceso de
adicional de detección
Más específica

Desventajas Menor especificidad y Equipos y reactivos y más

sensibilidad costosos (sondas fluorescentes
más caras)
4. En el método de apoyo al diagnóstico: qPCR; explique los métodos de
cuantificación

a. Cuantificación absoluta
Se utiliza para conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco o la
concentración precisa de ácidos nucleicos en la muestra, en la práctica se utiliza
para medir la carga viral o bacteriana en diferentes tejidos.

b. Cuantificación relativa
Se utiliza para evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados
fisiológicos. Estos cambios están basados en los niveles de ARNm del gen blanco
comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) este no cambia su
expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por diversas
causas. Estos datos son expresados como relativos como el número de veces en
el que aumentaron o disminuyeron los niveles de ARNm o si no hubo cambios.

5. Partes de la curva del qPCR y grafique, explique

● Fase exponencial: Incremento exponencial y/o logarítmico del producto de

PCR.
● Fase inicial: Son los niveles de señal de fluorescencia durante los primeros
ciclos (lo que se conoce como ruido, pues no pasa el umbral).
● Umbral: Es el primer incremento significativo en la cantidad de producto de
PCR, medido por el aumento de fluorescencia. No significa que no exista
fluorescencia antes, solo que no es detectada por el termociclador.
● Fase meseta: Tope de amplificación.
6. Explique lo siguiente: ¿Es necesario tener un control endógeno en el proceso
de PCR-RT?

Si es necesario porque gracias a esto se mide la expresión génica y en base

al punto de control que es un gen normal y permite corregir también algunas
variaciones que existen entre varias muestras entonces se comparan las
cuantificaciones que existen entre estas.

7. Un pediatra envía dos muestras para diagnóstico de displasia

espondiloepifisaria congénita, mediante qPCR (M1=paciente 01 y M2=
paciente 02), en el laboratorio realizan el análisis con el siguiente resultado:

Con respecto al gráfico mostrado, se interpreta que, si se alcanzó una concentración

de copias a partir del PCR rápido tiempo real cuantitativo en el M1, llegando a la
fase meseta o plateau; sin embargo, en el M2 no se logró pasar el umbral, viniendo a
ser una señal no amplificada.

En el caso de los resultados, se observa una comparación entre la amplificación de

los genes de interés, es decir, las muestras (M1 y M2); y del gen endógeno o
calibrador (C (+)), cuya expresión no varía pesar de las condiciones del experimento
(control endógeno) y es necesario para dicha comparación.

La muestra M2 después de haber pasado los 45 ciclos no llegó a amplificarse, debido

a la mutación que presenta, la displasia espondiloepifisaria congénita, el gen
COL2A1. Por otro lado, la muestra M1 si llegó a amplificarse; sin embargo, no llegó
a alcanzar a la curva del gen endógeno, probablemente porque la mutación en esta
ha sido más leve en comparación a la muestra M2.
· Muestra 1 (verde) ESTA ENFERMA
· Muestra 2 (rojo) ES SANA
· M1 si amplifica, tiene un producto, lo cual indica que está codificando los genes mutados
que producen esta enfermedad.
· Delta Rn (Y): Intensidad de emisión de Flurecencia.

8. Asumiendo que: por cada ciclo se duplica las copias de ADN, hallemos la carga de
ADN inicial comparativa entre M1 y C (+) en base al mismo treshold.

Datos:
- NF=No x 2ct Donde: NF= Carga ADN final por ciclo
- 2ct= copias del ADN por ciclo
- No= Carga ADN inicial

No de C(+)/ No de M1 = ¿?

Resolución: ¿Cuántas veces es mayor o menor la carga genética, para el gen analizado, de M1
en relación con el C(+)?
No de C(+)/ No de M1=¿?

- No de C(+)= “A” → 5000= A x 2^35

A=5000/2^35

- No de M1= “B”→ 5000= B x 2^53

B= 5000/2^53

- No de C(+)/No de M1= A/B= (5000/2^35) / (5000/2^53)

A/B= 2^18= 262144

Respuesta: La carga genética de M1 es 262144 veces menor que la de C(+).

 IV. CONCLUSIONES
● La PCR, 'Reacción en Cadena de la Polimerasa', es una prueba de diagnóstico que
permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno.
● La displasia espondiloepifisaria congénita (DEEC) es un raro trastorno de los huesos en
crecimiento que da lugar a enanismo esquelético típico, y en ocasiones problemas con la
visión y la audición.
● La displasia espondiloepifisaria congénita, es un tipo de displasia ósea manifiesta desde
la etapa de lactante, se produce por mutaciones en el gen COL2A1, ubicado en el
cromosoma 12, causando defectos en el colágeno de tipo II, un componente principal del
cartílago.
● La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bonilla, E., Párraga, M., López, L. A., Escolar, F., & del Mazo, J.
(2002).Cuantificación de la expresión génica a partir de un número limitado de
células mediante RT-PCR en tiempo real. Bioquimia, 27(1), 3-7.
Mas, E., Poza, J., Ciriza, J., Zaragoza, P., Osta, R., y Rodellar, C. (2016).
Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Revista
AquaTIC, (15).
Velilla MSc, C., Martínez MS, J., & González MSc, M. S. (2020).
Standardization of Multiplex Real-Time PCR for the diagnosis of Feline
Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline Leukemia Virus (FeLV) in Felis
silvestris catus. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 15(1), 31-43.
Velilla, Martínez y González, 2002, p. 38
http://www.scielo.org.co/pdf/cmvz/v15n1/1900-9607-cmvz-15-01-31.pdf