Génomique Fonctionnelle - Chapitre 4 - Fonction Des Gènes

Université Frères Mentouri Constantine 1
Institut de la Nutrition, de l'Alimentation et des Technologies Agro Alimentaires (INATAA)

Master Biotechnologies Alimentaires : Semestre 1/M1
Matière : Génomique fonctionnelle / Chapitre 4 : Fonction des gènes
Enseignante : Mme KECHID Maya Email : maya.kechid@umc.edu.dz
Institut de la Nutrition, de
l’Alimentation et des
Technologies Agro-
Université des Frères Mentouri - Alimentaires
Constantine 1
Master 1: Biotechnologie alimentaire

Matière: Génomique
Enseignante: M. KECHID
Fonction des gènes
Fonction d’un gène

« Caractère » ?
Génétique Génétique
directec inverse
gène
gène
?
Séquence d’ADN
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Relation entre les gènes
Indépendance
Gène A Phénotype A Gène B Phénotype B
Sauvage (AA BB) Phénotype A B

Mutant (a) (aa BB) Phénotype B
Mutant (b) (AA bb) Phénotype A

35 gène A
La mutation a n’affecte pas l’expression du 30 gène B
ns
e
gène B
è
25
e
dsg
20
La mutation b n’affecte pas l’expression du
so
i n
15
s
gène A
p
xre
10
ud
'e
L’expression du gène A est indépendante de

a
5
n
ive
celle du gène B et vis versa 0

sauvage mutant a mutant b
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Redondance
La redondance génétique est lorsque une fonction donnée est encodée de façon
redondante par deux ou plusieurs gènes. Il y a plusieurs possibilités.
F: phenotype
1: expression du
phénotype (Comme le
sauvage)
0: pas d’expression de
phenotype
h: variation de
l’expression
Epistasie
Dans la génétique mendélienne  Les lois de Mendel (Proportions) correspondent aux
cas ou un gène contrôle un caractère.
En génétique la transmission d’un caractère n’est pas si simple que ça.
Souvent la transmission d’un caractère est en relation avec d’autres facteurs

(autres gènes, facteurs environnementaux, facteurs métaboliques,…etc)
épistasie Un gène affecte l’expression d’un ou de plusieurs gènes.
Gène A 35 gène A
nes
gène B
è
30
ds
eg
25
o n
Gène B
i
20
prs
es
15
de
' x
10
va
eu
5
N
i
0
Phénotype A+B sauvage mutant a mutant b
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Exemple d’épistasie ( cas de gènes

independants)
Croisement X
oignon rouge X oignon blanc
F1 tous rouges
Les F2 sont : 9/16 rouge
3/16 jaune
4/16 blanc
Analyse: modification de la ségrégation

9:3:3:1, donc du dihybridisme
oignon rouge X oignon blanc
C/C R/R X c/c r/r
 C_ R_ = rouge
 C_ rr = jaune
 cc __ = blanc
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Interpretation de l’épistasie
Precurseur de la Substance Substance
couleur blanc jaune rouge
C gène R gène
Precurseur de la Substance
couleur balnc jaune
C gène X
R gène
Precurseur de la
couleur balnc
X
C gène R gène
Génétique formelle: deux Un gène qui

mutants touchés dans le même contrôle le Un mutant comme les parents
caractère caractère
Mais dans le cas ou il y a une

interaction génique ( plus qu’un gène
qui contrôle le caractère)
deux mutants touchés dans le

même caractère
Un sauvage
Une Complémentation
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Présence de Complémentation
Les deux mutants qui sont affectés dans le même caractères ne

sont pas mutés au niveau du même gène
Ce caractère est contrôlé par plus d’un

gène
Exemple: la couleur des yeux chez la drosophile, la couleur est contrôlée par deux
gènes sauvage A et B.
Couleur sauvage des yeux : A  B (AB)(Couleur rouge des yeux)

Le male (aB): aaBB  yeux blanc (White)
La femelle (Ab): Aabb  yeux blanc (White)
Descendance: (AB): AaBb  Sauvage ( présence de complémentation)
Absence de complémentation
Les deux mutants qui sont affectés dans le même caractère sont
mutés au niveau du même gène
La mutation est affectée au niveau du

même gène
Exemple précédent: couleur des yeux chez la drosophile
Couleur sauvage des yeux : A  B (AB) (Couleur rouge des yeux)

Le male (aB): aaBB  yeux blanc (White)
La femelle (aB): aaBB  yeux blanc (White)
Descendance: (aB): aaBB yeux blanc (White) ( absence de complémentation car
la mutation est au niveau du même gène (A)).
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Test de complémentation
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Test de complémentation
Interprétation des tests de complémentation
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Régulation des gènes
POURQUOI IL Y A UNE RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES?
Pour répondre aux conditions changeantes

de l’environnement immédiat
QU’EST-CE-QUE LA REGULATION GENETIQUE ?
Un moyen pour la cellule de développer des

mécanismes qui lui permettent de réprimer les
gènes qui codent pour des protéines inutiles et de
les activer au moment ou ils deviennent
nécessaires
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Contrôle de l’initiation de la
transcription chez les bactéries
Un contrôle constitutif Un contrôle de régulation
Qui dépend de la structure du Qui est sous la dépendance de

promoteur et du gène de régulation protéines régulatrices.
Mutant, … Activateur
répresseur
Inducteur ou co represseur
Quelques définitions sur la régulation de l’expression

des gènes
Facteur de transcription: protéine de régulation transcriptionnelle.

Gène de structure : code une protéine structurale, une enzyme ou une protéine
régulatrice.
Gène de régulation : code une protéine impliquée dans la régulation d’expression
d’autre gène (activateur ou represseur).
Activateur: protéine qui stimule l’initiation de la transcription favorise l’expression
d’un gène.
Répresseur : protéine qui inhibe la transcription et empêche l’expression d’un gène.
Operateur : site cible de la protéine répresseur ou activateur chez un procaryotes
Enhencer: site cible de la protéine activatrice chez un eucaryote
Silencer: site cible de la protéine répresseur chez les eucaryotes
Inducteur: substance qui induit l’expression (la transcription) d’un gène.
Corépresseur: substance qui réprime l’expression (la transcription) d’un gène.
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Un régulateur en cis : est un site de liaison pour une protéine de liaison à l’ADN,
situé en amont du gène régulé.
Un régulateur en trans : c’est la protéine elle-même , qui diffuse dans la cellule
depuis son site de synthèse jusqu’à son site de liaison sur l’ADN.
Facteur « trans » =proteines
ARN
Facteur « cis » = séquence
Rappel de la Régulation de l’expression

des gènes chez les procaryotes
Régulation négative Régulation positive
Répresseur Protéine activatrice
Le site de liaison se retrouve en Le site de liaison se retrouve

aval du promoteur: Opérateur en amont du promoteur
Le site se retrouve Le site se retrouve à plusieurs

généralement à la région -10 centaines de paires de bases
du promoteur en amont du gène concerné
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Les gènes vont donc souvent être organisés en opérons. Un opéron est un ensemble de
gènes ayant vocation à fonctionner de manière coordonnée de façon à produire les
protéines répondant à une voie physiologique bien intégrée, ainsi qu'à apporter les
mécanismes de régulation de cette voie.
Chez les procaryotes, l'ARNm est polycistronique : il présente plusieurs séquences

codantes indépendantes, chacune entourée d'un codon start et d’un codon stop.
En général, toutes les protéines codées par un même ARNm polycistronique sont
produites simultanément et de manière coordonnée, et interviennent dans une même
séquence biochimique.
Un cistron est une

séquence codante encadrée
par AUG puis STOP
Régulation négative: Catabolisme
LacI LacZ LacY LacA

LacP LacO
transporter le lactose de
l’exterieur vers
l’interieur de la cellule.
Sa fonction est mal connue mais elle est probablement

impliqué dans la suppression des produits toxiques dérivés
de la dégradation de lactose .
L’opéron lactose
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Régulation négative: Catabolisme
Opéron lactose
Allolactose
Liaison à l’opérateur empêche stériquement l’ARN polymérase de se lier…
Transcription de l’opéron est rétablie
Réponse de l’opéron lac en absence de lactose , lorsque la cellule porte l’une des deux mutations I- et OC
Les mutations I-et OC induisent un

contrôle constitutif => mutations
constitutives
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Réponse de l’opéron lac en

l’absence de lactose , lorsque la
cellule porte la mutation IS
(Super réprimé)
+ -
Comparaison de l’activité - -
+ +
des gènes (+ ou-) en présence + +
+ -
ou en l’absence de lactose + +
pour divers génotypes + -
+ -
d’E.coli. - -
- -
Régulation négative: Anabolisme

Opéron Tryptophane
Opérateur tryptophane
trpR
Gène régulateur
Promoteur Opérateur
trpP trpO Gènes Brin d’ADN
mRNA
Répresseur inactif Les enzymes de la voie de biosynthèse de tryptophane
Arrêt du Tryptophane
mouvement de la
RNA polymérase
Répresseur
inactif: Opérateur
Aporépresseur bloqué
1: trpE
2: trpD
Tryptophane
3:trpC
Répresseur
(corépresseur)
activé 4:trpB
5:trpA
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Régulation positive
Adénosine
monophosphate
cyclique
CAP: Catabolite Activator Protein
L'activateur permet la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur :

Activation de la transcription
En absence du glucose
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En présence du glucose
Glucose
Pourquoi il n y a pas de cAMP pour activer la CAP?
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Pourquoi il n y a pas de cAMP pour activer la CAP?
Glucose
Le glucose réprime (bloque) l’adenylate cyclase

Pas de production de cAMP
La CAP n’est pas activée par le cAMP
Régulation de l’expression des gènes chez

les eucaryotes
C’est le même principe que chez les procaryotes sauf que c’est plus compliqué à
cause :
la structure de la chromatine doit être modifiée pour permettre l’accessibilité des
sites de transcription.
L’information génétique est retenu par plusieurs chromosomes retenus dans le
noyau.
La majorité des eucaryotes sont des organismes multicellulaires contenant
différents types cellulaires ( différents organes et tissus).
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Facteurs de transcription généraux

Ce sont les facteurs de transcription qui agissent avec l’ARN
polymérase pour initier la transcription
+ TFIID
+ TFIIA
Cependant, la machinerie de transcription chez les eucaryotes

nécessite l’intervention d’autres facteurs
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Changements de la structure de la
chromatine
Modification des histones (Régulation epigénetique)
Les histones composant les nucléosomes peuvent présenter des modifications post-
traductionnelles transitoires (réversibles) qui affectent la transcription. Parmi ces
modifications on trouve : l'acétylation, la méthylation, la phosphorylation et
l'ubiquitination, ainsi que d'autres modifications plus rares.
Le code histone montre des modifications sur des sites très précis (à l'acide aminé près)
et joue un rôle dans la compaction de la chromatine et dans l'accessibilité des facteurs de
transcription (machinerie ou régulation). De plus, ces histones sont partiellement
transmissibles de la cellule mère à la cellule fille, l'information épigénétique est donc
potentiellement conservée.
L’acétylation des histones induit une

décondensation de la chromatine
L’acétylation des histones

induit une décondensation
de la chromatine : en effet
l’addiction d’un groupement
acétyles sur les histones crée
des charges qui ont un rôle
répulsif entre les
nucléosomes. Ce
phénomène est réversible et
est contrôlée par des
histones acétylases
trasférases (HAT).
L’élimination d’un
groupement acétyl se fait
par des désacétylases
(HDAC).
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Remodelage de la (a) Modification des contacts ADN / protéine

chromatine
Le remodelage de la
chromatine nécessite de
l’energie ATP, il y a plusieurs
complexes de remodelage
de la chromatine , le plus
étudié est le complexe
SWI/SNF.
Ce complexe permet de
repositionner les
nécluosome pour
permettre aux facteurs de
transcription géneraux de
se fixer sur les promoteurs.
Methylation de l’ADN
Une méthylation de l’ADN réprime la transcription (Méthylation de la cytosine)
Facteurs de transcription spécifiques

Les activateurs et les represseurs sont des proteines qui activent ou
repriment la transcriptions, ces proteines sont codés par des gènes de
regulation, on les appelent aussi les facteurs des transcriptions spécifiques
Site de fixation d’un activateur: Enhancer Site de fixation d’un represseur: Silencer
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Différents mécanismes du fonctionnement des répresseurs eucaryotes.
Mécanismes:
Compétition
Inhibition
Répression
directe
Répression
indirecte
les éléments isolateurs sont des séquences d'ADN qui se trouvent parfois entre
deux gènes ou groupes de gènes, les protégeant ainsi des effets produits par les
autres séquences régulatrices. Ces éléments agissent en tant que
barrières génétiques empêchant les interactions entre les
éléments enhancer/amplificateur et promoteur.
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Exemple de gènes régulant l’acétylation de l’histone et la floraison chez Arabidopsis
Transcription Transcription
Traduction Traduction
La floraison chez Arabidopsis est contrôlée par un

gène FLD qui code une enzyme désacétylase.
Cette enzyme élimine le groupement acétyl des
histone dans la chromatine autour de FLC. Le FLC est
un gène de régulation qui réprime la floraison .
L’elimination des groupements acetyle des histones
Repression rétablit la structure condensé de la chromatine et
réprime la transcription de FLC, permettant ainsi à la Pas de Repression
de la
plante de fleurir. de la floraison
floraison
Régulation par épissage

alternative
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La séquence intronique des ARNm contient :
- En 5’ une séquence GU : site donneur d’épissage
- En 3’ une séquence AG : site accepteur d’épissage.
- Un A de branchement à environ 30 nt du site accepteur (3’). Le A de
branchement est trouvé de manière fréquente, mais non obligatoire. L’élimination
d’un intron est réalisée après deux réactions de transesterification.
Epissage
Il s’agit d’un mécanisme qui aboutit à l’excision des introns et à
la ligation des exons, pour aboutir à un ARN fonctionnel et
mature.
ARNnh: (ARN nucléaire hétérogène)
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Epissage alternatif
Un pré ARNm peut donner naissance à différentes protéines
suivant un mécanisme de maturation différentielle touchant
l’épissage : l’épissage alternatif.
En fonction des sites d’épissage utilisés par la cellule, on peut avoir

plusieurs ARNm matures différents de par leur séquence. Ils
peuvent être générés à partir d’un seul ARN pré messager.
Les ARNm matures donnent naissance à des protéines différentes :
les variants d’épissage. Bien que générés par le même gène (par
le même pré ARNm), ces protéines possèdent des fonctions
différentes au sein de la cellule.
La cellule peut utiliser des sites d’épissage différents, des sites
accepteurs d’un intron et des sites donneurs d’un intron différents
pour exciser ainsi un fragment d’ARN pré messager.
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Fonction d’un gène
Identification d'un gène

Exemple chez les eucaryotes: plante
Deux méthodes principales pour identifier un gène chez une plante :
- Homologie de séquence
Dans le cas ou le gène recherché a déjà été cloné chez une espèce
voisine.
- Recherche et analyse de mutant(s)
- Interrogation de banques de données (recherche in silico)

Pour les espèces dont le génome est entièrement séquencé (A. thaliana,
le riz, et d'autres à venir).
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Identification d'un gène par homologie de séquence
Recherche du gène X chez la tomate
Etalement sur boîtes de Etalement d'une

banque Plasmide contenant le
milieu gélosé
d'ADN génomique ou gène X du tabac
d'ADNc de tomate
x 10-20
Répliques sur filtres de Disque de nitrocellulose Marquage

adsorbtion partielle des chaud (radioactif)
nitrocellulose phages à partir des plages de ou froid (enzyme)
lyse de la sonde
Boîte mère conservée à 4°c
Dénaturation de la sonde
Préparation des répliques
nitrocellulose
pour l’hybridation
solutions Isolement des clones
- Dénaturation
- Neutralisation positifs sur la boîte mère
- Fixation sur le filtre
Hybridation moléculaire de la membrane

avec sonde marquée (type Southern)
signaux positifs
- Pré-hybridation : blocage des sites non spécifiques (BSA, Détection des signaux = clones d’intérêt
ADN thymus de veau)
- Hybridation : sonde hétérologue marquée d’hybridation
- Lavages : dissociation des hybrides non spécifiques (autoradiographie)
(pas trop stringeants) Autoradiogramme
Identification d'un gène par recherche de variants (mutants)
Les mutations peuvent être naturelles ou provoquées
- ponctuelles, touche un seul nucléotide (erreurs durant la

réplication, lésions spontannées, UV, EMS, etc.)
Grande variété de mutations possibles : allèle mutant faible, fort ou même gain de
fonction.
- délétions (pendant les réarrangements chromosomiques, rayons

gamma)
Mutations perte de fonction en général.
- insertions (saut de transposon, insertion d'ADN-T chez les dicots)

Mutations perte de fonction en général.
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Mutations ponctuelles
Silencieuses : AGG (Arg) CGG (Arg) Appariements de Watson & Crick

Neutres : AAA (Lys) AGA (Arg)
Adénine
Faux-sens : GGC (Gly) GAC (Asp) Guanine
Non-sens : UGG (Trp) UAG (STOP)
Addition décalage du
Thymine
Délétion cadre de lecture Cytosine
Pyramidine: C et T
Purines : A et G
Appariements illégitimes rares (commutations tautomériques)
Adénine Guanine Imino Enol

Adénine Guanine
Imino Enol
Cytosine Thymine Cytosine Thymine
Mutations ponctuelles pendant la réplication
Guanine sous
forme énol (rare) wt
Réplication
Réplication mutant
Réplication wt
ADN
parental
wt
1ère
génération
2ème
génération
Les mutations engendrées par ces mauvais appariements se classent en 2 catégories :
transitions transversions
.
A .. T C.. G
.
Mutations substituant une
Mutations substituant une T ..A G.. C
. A .. T T.. A
purine en une autre purine A ..T G.. C purine en une pyrimidine ou
ou une pyrimidine en une T ..A
.
C.. G une pyrimidine en une T ..A A.. T
. .
autre pyrimidine.
purine. G .. C C.. G
. .
C ..G G.. C
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Mutations ponctuelles pendant la réplication
Les mutations de phase :

L'addition ou la délétion
codons sauvages : ILS ONT MIS UNE DES SIX VIS
d'une ou plusieurs paires
de bases (non multiple de délétion d'un nucléotide (M) : ILS ONT *ISU NED ESS IXV IS
3) provoque des mutations
sévères par décalage du addition d'un nucléotide (G) : ILS GON TMI SUN EDE SSI XVI
cadre de lecture. S
Le modèle de Streisinger explique la formation des mutations de phase
Synthèse d'ADN Synthèse d'ADN
5' 5'
3' 3'
Le glissement du Le glissement du
brin néosynthétisé brin matrice
provoque une 5' 5' provoque une
addition de 3' 3' délétion de
nucléotide(s). nucléotide(s).
5' 5'
3' 3'
Fréquence d'apparition de ces mutations privilégiées aux points chauds :

répétitions d'une base ou de courtes séquences.
Mutations ponctuelles provoquées
L'EMS (éthyl-méthane-sulfonate) :
L'EMS alkyle les guanines. La guanine
alkylée en O-6-éthylguanine s'apparie EMS
illégitimement avec une thymine.
L' EMS produit des transitions G -> A
Guanine O-6-éthylguanine Thymine
Les agents intercalants :

sont des mutagènes à structure plane, bases normalement
appariées
analogue à une paire de bases. Ils peuvent
s'intercaler dans la double hélice d'ADN et
acridine orange
engendrer des mutations par addition ou
délétion d'une paire de bases.
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Mutations insertionnelles par ADN-T

Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol (rhizobiacée, GRAM-) capable
d'infecter les dicotylédones et induisant la gale du collet (tumeur).
La maladie est due à un transfert d'ADN (ADN-T) de la bactérie dans le génome des
cellules végétales : transformation.
Ce mécanisme est le seul exemple naturel de transport d'ADN entre règnes.
L'ADN-T :
Fragment d'ADN du plasmide Ti (Tumour inducing, 200kpb) délimité par 2 séquences

répétées de 25pb (en orientation directes). Il code pour :
- 1 enzyme de la voie de biosynthèse des cytokinines
Oncogenèse
- 2 enzymes de la voie de biosynthèse des auxines
- enzyme de biosynthèses des opines (source de C et N pour la
bactérie)
Les cellules infectées se divisent activement (tumeur) et synthétisent des opines

utilisées par A. tumefaciens.
3 composantes génétiques nécessaires pour la transformation de la cellule végétale:
- l'ADN-T : seules les bordures gauches et droites sont indispensables (sur le Ti).
- les gènes vir: perception d'une blessure, synthèse transfert et intégration d'ADN-
T (Ti).
- les gènes chv: chémotaxie et attachement à la cellule végétale (chromosome
bactérien)
Mécanisme de transfert de l'ADN-T
1 Attachement d'A.
tumefaciens à la
cellule végétale (chvB,
pscA, Att)
2 Perception et
traduction du signal
de virulence (virA,
virG)
3 Activation
transcriptionnelle
des gènes de
virulence (virG)
4 Production du
brin-T (virD1,
virD2, virE1,
virE2)
5 Transport
intercellulaire (virB,
virD4)
6 Importation
nucléaire (virD2,
virE2)
7 Intégration au
génome végétal
(virD2, virE2) D ’après Sheng et al. (1996) Plant Cell 8:1699-1710
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Cal (tumeur)
Transfert des
cals sur milieu
Introduction de l’ADN bactérien chez gélosé
la plante
Plasmide Ti Plasmide Ti
d’Agrobacterium d’Agrobacterium
tumefaciens tumefaciens
transformé pour
la transgénèse
Le système binaire de transfert d'ADN-T
Plasmide Ti
RB LB
IaaH IaaM Ipt Ocs
Plasmide Ti
(200kpb)
Gènes de virulence ori
Système binaire
RB LB
IaaH IaaM Ipt Ocs Npt II Gène X
Plasmide Ti désarmé + Plasmide binaire

(15kpb)
Gènes de virulence CarbR ori RifR ori
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Collection T1 de
Collection de mutants ADN-T mutants transgéniques
(insertions aléatoires)
Plantes
sauvages
Transformation
Sélection des graines T1
(antibiotique ou autre)
Autofécondation
Criblage de la
collection sur la base
du phénotype
Criblage de la
collection sur une
base moléculaire
Criblage de la Collection T2 avec
collection in silico mutants
homozygotes
Criblage d'une collection de mutants ADN-T
Criblage Phénotypique
(gène inconnu)
wt pym gl1
p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7
ADN-T
Criblage Moléculaire
(gène connu)
gène favori
Criblage in silico
(gène connu et
collections étiquetées
disponibles
sur internet)
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Mutations insertionnelles par transposon
Les transposons :
Eléments Ac/Ds découverts chez le maïs dans les années 1950 par
Barbara McClintock (prix Nobel 1983)
Elémént Ac 4,5kpb
IR IR
(11pb) (11pb)
transposase
transposase
Découplage Ac et Ds
La transposase va mobiliser n'importe quelles séquences. Elle agit en
trans.
Transposon sauvage Eléménts Ac et

Ds dissociés
transposase Ds transposase
transposase transposase
= élément Ac
Ds transposase
transposase
Les transposons Ac/Ds existent aussi chez d'autres plantes que le maïs.
On peut également les transférer chez des lignées qui en sont dépouvues.
Si l'élément Ds s'insère dans un gène, il crée une mutation (forte).
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Collection de mutants Ds
Lorsqu'un élément Ds "saute", il se réinsère (généralement) dans une
séquence proche de son site d'origine. -> Nouveau type de collection
possible.
RB LR
RB IR IR LR Ac
Ds
Transformation
Transformation
X
Lignée Ds 35S::Ac
d'intérêt
Sélection (internet)
d'une plante
possédant une Hybride F1 chez lequel
Collection de mutants l'élément Ds va sauter et
insertion proche du
(insertion aléatoires) potentiellement s'insérer
gène à muter
dans le gène d'intérêt
Clonage d'un gène muté par mutation ponctuelle
1- Cartographie de la mutation :
- attribution à un chromosome
- localisation plus précice grâce aux marqueurs moléculaires
2- Cartographie physique de la mutation :

- utilisation des contigs (marche sur le chromosome)
3- Séquençage et recherche de gène candidat
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Clonage d'un gène étiqueté par l'insertion d'un ADN-T ou
d'un transposon
La séquence de l'insertion étant connue (ADN-T ou Ds) on s'en sert comme
appât pour "pêcher" le gène muté.
Restr. Restr. Restr. Gène sauvage recheché
ATG nptII ori TAG
gè.................................ne
ADN-T Utilisation de l'extrémité 3' comme
sonde pour le criblage d'une banque
Digestion d'ADN génomique (ou ADNc)
enz. restriction sauvage.
Clone bactérien
transformé par le
Sauvetage du plasmide
plasmide contenant
Ligation l'extrémité 3' du gène
Restr.
recheché.
Transformation Sélection sur

bactérienne kanamycine
Clonage d'un gène étiqueté par l'insertion d'un

ADN-T ou d'un transposon
La séquence de l'insertion étant connue (ADN-T ou Ds) on s'en sert comme appât
pour "pêcher" le gène muté.
Restr. Restr. Restr. Gène sauvage recheché
ATG TAG
gè.................................ne
ADN-T
Utilisation de l'extrémité 3' comme
Digestion sonde pour le criblage d'une banque
enz. restriction d'ADN génomique (ou ADNc)
sauvage.
Clonage et séquençage
Inverse PCR du fragment PCR
Ligation (iPCR)
contenant l'extrémité 3'
du gène recheché.
Restr.
iPCR
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ADN
Séquence Séquence Séquence
inconnue connue inconnue
Digestion
Enzyme de enzymatique Enzyme de
restriction restriction
1+2=
Séquence
2
flanquante
Ligation du fragment sur lui même

Amorce
sens
Amorce
anti sens
PCR
PCR inverse
NRT2.5R1
NRT2.5F1
64746 64769
63313 63333
NRT2.5F2 NRT2.5R2
63897 63910 64346 64369
63223 63910 64259 64736 64809 65156 65408
63223 63909 64260 64735 64810 65155 65408
FST : séquence
Ko nrt2.5 FST flanquante
64401 64458
Référence du gène NRT2.5:
AT1G12940, F13K23
Référence sur Gabi KAT : GK
213H10 Exemple de
Référence sur NASC: N420446 mutant
tDNA
Gabi kat
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Exemple
chez un
animal 1 Des souris sont croisées et les
œufs fécondés sont prélevés sur
la femelle
2 De l’ADN étranger est éjecté dans un des pronuclei
3 Les embryons sont implantés dans une femelle

pseudogestante
4 La descendance est testée pour la présence du

transgène
5 Les souris porteuses du transgène

sont croisées pour produire une
souche de souris homozygote pour le
transgène.
La construction d’un transgène

comprend :
la séquence codante de la protéine

d’intérêt
un promoteur en amont
un terminateur de transcription en

aval
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Les promoteurs utilisés sont de différent

types :
‐Constitutifs: Ces promoteurs dirigent

l’expression permanente dans tous les tissus.
‐Inductibles: Ces promoteurs sont activés en

présence d’un composé particulier.
‐Spécifiques: Ces promoteurs limitent

l'expression du gène à certains tissus ou
organes.
Exemple d’un knock up Promoteur CaMV 35S
Virus découvert dans les années 1980, responsable de la

décoloration du limbe entre les nervures des feuilles de
Brassicacées.
• L’ADN du virus comporte 2 promoteurs constitutifs : 19S et

35S
• Promoteur 35S :
‐promoteur constitutif fort

‐couramment utilisé
‐chargé de la transcription du virus dans la plante
‐entraîne des niveaux d’expression élevés chez les
dicotylédones
‐moins efficace chez les monocotylédones (céréales)
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Constitution du promoteur
Des expériences de délétions ont été réalisées afin de déterminer les régions
responsables de l’activité du promoteur 35S :
Gènes rapporteurs
Gènes qui
peuvent
apporter une
fluorescence à Rapporteur Gus
l’organisme au
niveau de
l’expression du
gène étudié Rapporteur GFP
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Le gène rapporteur permet de

déterminer les régions de fonction de
la protéines transcrite par le gène
étudiée.
le gène rapporteur peut être fusionné

au gène étudié, ou mis sous le contrôle
du promoteur de ce dernier
Surexpression d'un gène
Contrôle 35S::BP
La surexpression simple
Fusion transcriptionnelle :
BP stimule la production de méristèmes

RB ter LB ectopiques
gène nptII (Facteur de transcription
homéodomaine)
Prom FORT
35S CaMV Contrôle 35S::TRY
TRY réprime la production de trichomes

(Facteur de transcription Myb)
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Surexpression d'un gène avec un gène rapporteur
La surexpression avec rapporteur
Fusion transcriptionnelle et traductionnelle :

GFP
RB ter LB
p.35S gène GFP Hyg
DAPI
protéines hybrides
Merge
La présence de GFP certifie que la protéine GeBP est produite.

La localisation intra-cellulaire de la GFP montre que GeBP est une protéine nucléaire
(Facteur de transcription Leu-Zip)
Inactivation de gènes par ARN antisens
noyau
Gène enéG
Gène enéG 5' ATGCCA..... 3' 5' .....TGGCAT 3'

3' TACGGT..... 5' 3' .....ACCGTA 5'
ARNm 5' 3'
ARNm AS
5' 3'
protéine 5' AUGCCA..... 3' 5' .....UGGCAU 3'

ARN double
brin
Dégradation
Fonction 5' AUGCCA..... 3'
Perte de 3' UACGGU..... 5'
fonction
Contrôle 35S::WAK antisens

Antisens pour le gène WAK (cell Wall
Associated Kinase) impliqué dans les
mécanismes d'élongation cellulaire chez N.
Benthamiana (tabac)
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Comprendre la fonction des gènes
Etude ou construction de lignées gain de fonction :

- Surexpression simple
- Surexpression conditionnelle (pour éviter une
léthalité par exemple)
-> la nouvelle fonction constatée est contrôlée par
le gène sauvage.
Etude ou construction de lignées perte de fonction :

- mutants naturels, isolés à partir de collections, ou
construit spécifiquement
-> la fonction perdue chez les mutants était
contrôlée par le gène sauvage.
Etude du transcriptome
(Expression du gène)
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Extraction d’ARN
Les ARN sont plus difficiles à étudier que
les ADN parce qu’ils sont très vulnérables
vis-à-vis de la ribonucléase (RNase A). Celle-
ci est ubiquitaire (les doigts par exemple en
sont couverts), extrêmement active et très
résistantes à toutes les agressions
habituellement néfastes pour toutes les
enzymes ; par exemple un traitement à 90°C
pendant une heure n’altère pas son activité.
Tout travail sur les ARN doit donc être
effectué dans des conditions d’asepsie total,
tout doit être stérilisé à l’autoclave.
L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de

l'ARN et soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de
césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce coussin et être
récupéré dans le culot).
Par précipitation: les tissus ou cellules sont homogénéisés dans un

tampon (acétate) contenant un détergent puissant à haute
concentration (SDS ou sarcosyl), un agent dissociant (chlorure ou
thiocyanate de guanidine) et un agent réducteur à haute concentration
(2-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT)).
La composition de ce tampon a été ainsi choisie pour répondre à deux

impératifs :
- inhiber les RNases endogènes

-dénaturer l’ADN et dissocier les protéines qui pourraient y être
fixées.
Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Les ARN
relativement purs avec un très bon rendement repose sur la
précipitabilité différentielle De l’ARN et de l’ADN selon le pH et la
concentration d’éthanol.
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Extraction d’ARN
a dé
e
r
sd
g
d
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a
d
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r
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n
e
é
r
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a
u
Nn
h
q
N
c
r
R
Ma
R
A
Reverse Trascription PCR

« RT PCR »
A cause de la vulnérabilité de l’ARN, La RT PCR implique
l’utilisation de l’enzyme reverse transcriptase; une enzyme
extraite des Virus à ARN , cette enzyme a la capacité de
transcrire un brin d’ADN complémentaire au brin d’ARN
messager (ADNc ou cDNA).
RT PCR est utilisée pour tester l’ARN transcrits dans

différents tissus et différentes conditions afin de
déterminer les gènes impliqués dans cette expression.
RT PCR comporte deux étapes:

ETAPE 1: Synthèse d’ADN Complémentaire ADNc
ETAPE 2: Utilisation d’ADNc comme matrice dans la PCR
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1/ Synthèse d’ADNc
• implique l’utilisation de l’enzyme
reverse transcriptase qui va
convertir l’ARN en ADN , cette ADN
est complémentaire à l’ARN
(ADNc). La reverse transcriptase
est ADN polymérase, elle
nécessite une amorce pour
commencer la synthèse, chez les
eucaryotes une amorce poly T est
utilisée qui va se lié à la queue
poly A (extrémité 3’) pour
commencer la synthèse. une 2ème
amorce oligonucléotidique
spécifique (amorce 2) permettra la
synthèse du 2ème brin par
extension.
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2/ Utilisation d’ADNc dans la PCR
ADN génomique (ADNg)
ADN complementaire (ADNc)
Chez les eucaryotes, l’ADN complémentaire a une taille plus petite que celle des
ADN génomiques car l’ADNc est la forme d’ADN de l’ARN m, donc l’ADNc a perdu
les séquences des introns.
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Détection des extrémités du cDNA

Il faut viser l’ARNm et l’etude du cDNA.
Etude de la RT PCR (transcription reverse) => RT-PCR –RACE
(Rapid amplification of cDNA ends)
Nothern blot
Le principe est le même que pour le Southern blot mais ici ce sont les
ARN qui sont étudiés.
Donc plus besoin de digérer par enzyme de restriction.
Cette technique permet le repérage d'un type de molécule d'ARN dans

une population (repérer l'expression d'un gène dans un tissu, dans des
conditions particulières de l'environnement... Penser à normaliser avec
un gène de ménage).
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Nothern blot
La visualisation d'un
ARN par une sonde
permet de :
• apprécier sa
distribution dans les
tissus,
• étudier son
abondance relative
• déterminer sa taille
• détecter les
intermédiaires de
maturation et les
différentes formes
d'épissage de l'ARN.
Nothern blot
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Etude de la transcription à l'échelle du génome
Puces à ADN (micro-array, DNA chips)
Les avancées dans les domaines de la génomique (prog. de séquençage des

génomes, etc.) et des nanotechnologies (miniaturisation, automatisation, etc.)
rendent possible l'analyse des niveaux de transcription de nombreux gènes
simultanément: la transcriptomique.
Chez A. thaliana, l'ensemble des 25 000 gènes est représenté sur une puce.
Puces à ADN Résultat d'hybridation

d'une puces à ADN
Puces à ADN DNA microarrays, DNA chips
Mesure globale de lʼexpression génétique Recherche fondamentale et appliquée

dans tous les domaines Diagnostic médical, nouveaux médicaments, fonction des
genes, ….
Analyse dʼamplifications et de délétions de gènes
Analyses des variabilités génomiques et corrélations avec des phénotypes et
certaines conditions.
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Puces à ADN
Les sondes
Les puces à ADN sont des lames de verre activées sur lesquelles
sont déposés plusieurs milliers de "spot" d'acides nucléiques : les
acides nucléiques fixés sur les puces à ADN sont appelés sondes
("probes").
Les cibles
Les acides nucléiques qui sont hybridés avec ces sondes sont
appelés cibles ("targets").
Pour une exprérience donnée, une condition expérimentale (stress,
pathologie, état de différenciation cellulaire, ...) est comparée à une
condition de référence : les ARN messagers (les cibles) sont donc
extraits des 2 types de cellules que l'on veut comparer.
Les ARN messagers sont rétro-transcrits en ADNc par une
transcriptase inverse
Puces à ADN
Au cours de cette rétro-transcription :
les ADNc d'un type de cellule sont marqués par une molécule
fluorescente
les ADNc de l'autre type de cellule sont marqués par une autre
molécule fluorescente
Le marquage des cibles consiste en l'incorporation de nucléotides
portant :
soit le fluorophore cyanine 3 (Cy3) sous forme de Cy3-dUTP
(Couleur verte)
soit le fluorophore cyanine 5 (Cy5) sous forme de Cy5-dUTP
(couleur rouge)
signal faible signal fort
signal fort signal

signal faible
équivalent
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Puces à ADN
Puces à ADN
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Puces à ADN
Puces à ADN
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Puces à ADN
Etapes de l'analyse transcriptomique par micro-array
Plaque contenant robot
des framents spotteur
de gènes
ADN
Fragments PCR Fragments PCR sont Puce ADN (micro

spécifiques de déposés sur une lame de array)
chaque gène (1, 2, 3, microscopie
...) sonde ADNc
hybridation avec
un mélange des
2 sondes
ARNm
spécifiques
des fleurs synthèse d'ADNc
avec nucléotides
fluorescents
signal faible signal fort
sonde ADNc
ARNm signal fort signal

spécifiques
des feuilles signal faible
équivalent
Gène candidat: est un gène qui montre des

niveaux de transcrits différents lorsque
l’organisme est mis sous certaines conditions
(particulières), ce qui mène à le sélectionner et
utiliser ses mutants afin de comprendre sa
relation avec ces conditions.
Etude du niveaux des transcrit d’un gène

Utilisation de la qPCR (PCR quantitative)
Les niveaux de transcrits peuvent aussi être étudiés en
détails par l’utilisation de la qPCR afin de voir les
relations intergéniques entre les différents gènes.
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la qPCR (PCR quantitative)
Le niveau de transcrits :du gène étudié par rapport à celui du gène constitutif (le niveau
des transcrits du gène constitutif est toujours le même sous différents traitements et
différentes conditions).
Le niveau des transcrits 2-∆Ct => ∆Ct= Ctx – Ctconstitutif
Utiliser les simples mutants pour l’étude de

niveau de transcrits par rapport au sauvage
Le programme de transcription n'est pas fixe:

Les cellules doivent être capables d’activer ou de
réprimer la transcription de chaque gène ou
groupes de gènes spécifique
Les cellules doivent savoir reconnaître les
conditions environnementales dans les quelles elles
doivent activer ou réprimer la transcription des
gènes adéquats.
Utilisation des simples mutants (sous différentes

conditions) est l’une des techniques les plus utilisés
pour comprendre la fonction d’un gène ainsi que son
transcriptomes.
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Utilisation des doubles et même triples mutants pour voir si il y a une
interaction entre les gènes.
Pour avoir des doubles mutants Croisement entre simple mutants
Exemple
Croisement entre le simple mutant al et le simple mutant cn
al-CN AL-cn
1iere génération hétérozygote
2ème génération hétérozygote
Si les deux gènes AL et CN sont indépendants ¼ de la population est double mutante

al-cn
Si les deux gènes AL et CN sont liés Double mutant al-cn

obtenu sauf si il y a Crossing over
Métagénomique
La métagénomique est la méthode d'étude du microbiote. C'est une
technique de sequençage et d'analyse de l'ADN contenu dans un milieu.
A l'inverse de la génomique qui consiste à séquencer un unique génome,
la métagénomique séquence les génomes de plusieurs individus
d'espèces différentes dans un milieu donné.
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Il existe deux grandes stratégies de séquençage en
métagénomique : la stratégie globale et la stratégie ciblée.
1/ La métagénomique globale consiste à

fragmenter tous les ADNs présents dans un échantillon en
courts fragments et les séquencer à l'aide d'un séquenceur
haut débit haut débit. D’où le nom de Shotgun sequencing.
Les séquences (ou reads) obtenues sont ré-assemblées
bioinformatiquement afin de reconstruire les génomes
bactériens d'origine.
2/ La métagénomique ciblée: n'est pas de la

métagénomique à proprement parler, mais de
la métagénétique. Cette stratégie consiste à séquencer un
unique gène au lieu d'un génome complet. Cependant le
terme de métagénomique étant plus régulièrement employé
pour décrire cette stratégie. Ce gène doit être commun à
plusieurs espèces tout en présentant des régions
suffisamment variables afin de discriminer une espèce. En
bactériologie, le gène utilisé est celui de l'ARN 16S. Il
s'agit d'un gène présent uniquement chez les bactéries.
Page 55/55

Génomique Fonctionnelle - Chapitre 4 - Fonction Des Gènes

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Génomique Fonctionnelle - Chapitre 4 - Fonction Des Gènes

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Université Frères Mentouri Constantine 1

Institut de la Nutrition, de l'Alimentation et des Technologies Agro Alimentaires (INATAA)

Master 1: Biotechnologie alimentaire

Fonction des gènes

Fonction d’un gène

Relation entre les gènes

Sauvage (AA BB) Phénotype A B

Mutant (b) (AA bb) Phénotype A

L’expression du gène A est indépendante de

celle du gène B et vis versa 0

Souvent la transmission d’un caractère est en relation avec d’autres facteurs

épistasie Un gène affecte l’expression d’un ou de plusieurs gènes.

Exemple d’épistasie ( cas de gènes

Les F2 sont : 9/16 rouge

Analyse: modification de la ségrégation

Génétique formelle: deux Un gène qui

Mais dans le cas ou il y a une

deux mutants touchés dans le

Les deux mutants qui sont affectés dans le même caractères ne

Ce caractère est contrôlé par plus d’un

Couleur sauvage des yeux : A  B (AB)(Couleur rouge des yeux)

La mutation est affectée au niveau du

Exemple précédent: couleur des yeux chez la drosophile

Couleur sauvage des yeux : A  B (AB) (Couleur rouge des yeux)

Interprétation des tests de complémentation

Régulation des gènes

POURQUOI IL Y A UNE RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES?

Pour répondre aux conditions changeantes

QU’EST-CE-QUE LA REGULATION GENETIQUE ?

Un moyen pour la cellule de développer des

Un contrôle constitutif Un contrôle de régulation

Qui dépend de la structure du Qui est sous la dépendance de

Quelques définitions sur la régulation de l’expression

Facteur de transcription: protéine de régulation transcriptionnelle.

Facteur « cis » = séquence

Rappel de la Régulation de l’expression

Régulation négative Régulation positive

Répresseur Protéine activatrice

Le site de liaison se retrouve en Le site de liaison se retrouve

Le site se retrouve Le site se retrouve à plusieurs

Chez les procaryotes, l'ARNm est polycistronique : il présente plusieurs séquences

Un cistron est une

Régulation négative: Catabolisme

LacI LacZ LacY LacA

Sa fonction est mal connue mais elle est probablement

Liaison à l’opérateur empêche stériquement l’ARN polymérase de se lier…

Transcription de l’opéron est rétablie

Les mutations I-et OC induisent un

Réponse de l’opéron lac en

Régulation négative: Anabolisme

trpP trpO Gènes Brin d’ADN

Répresseur inactif Les enzymes de la voie de biosynthèse de tryptophane

CAP: Catabolite Activator Protein

L'activateur permet la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur :

Pourquoi il n y a pas de cAMP pour activer la CAP?

Pourquoi il n y a pas de cAMP pour activer la CAP?

Le glucose réprime (bloque) l’adenylate cyclase

Régulation de l’expression des gènes chez

Facteurs de transcription généraux

Cependant, la machinerie de transcription chez les eucaryotes

L’acétylation des histones induit une

L’acétylation des histones

Remodelage de la (a) Modification des contacts ADN / protéine