Docente: Msc. Fiorella Orellana P.

fiorella.orellana@uma.edu.pe
 Objetivos

❖Comprender la técnica de espectrofotometría y su

utilización en el área clínica.

❖Comprender los conceptos planteados por Lambert y

Beer.
 Logro de sesión

❖ Al finalizar la sesión, el estudiante

comprenderá como utilizar la técnica de
Espectrofotometría en el área clínica.

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ESPECTROFOTOMETRÍA
ANÁLISIS CLÍNICOS
 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Espectrofotometría
entos
▪ Método de análisis óptico que permite hallar concentraciones de
diferentes muestras coloreadas.
▪ Permite la detección específica de diversas biomoléculas.
Fundamento
▪ Capacidad de las moléculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones
dentro del espectro UV- visible.

▪ Las moléculas pueden absorber energía

luminosa y almacenarla en forma de energía
interna.
 Espectrofotometría
entos
Región UV

▪ Región de energía muy alta.

▪ Determinación cualitativa y
cuantitativa de compuestos
orgánicos.
▪ Rango de longitudes de onda comprendida entre 195 a
400 nm.

▪ La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de

Lámpara de deuterio
deuterio.
 Espectrofotometría
entos
Región Visible

▪ La parte del espectro electromagnético

que el ojo humano es capaz de percibir.

▪ En la Luz o región visible se aprecia el

color visible de una solución que
corresponde a la longitud de onda que
transmite, no se absorbe.
▪ Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la
longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada.
 Espectrofotometría
entos
Región Visible

▪ Está compuesta por radiaciones de longitud

de onda comprendida entre 400 y 700 nm.

▪ La fuente de radiación visible suele ser una

lámpara de tungsteno.

Lámpara de tungsteno
 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Espectrofotómetro

▪ La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en un

aparato llamado Espectrofotómetro.

▪ Instrumento que compara la radiación absorbida o transmitida por una

solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que
contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
 Espectrofotómetro

▪ Puede variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores

para el análisis de datos.
 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Componentes de un Espectrofotómetro

▪ Los componentes son :

1. Una fuente de radiación: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda:

Filtros, prismas, redes de difracción.

Espectrofotómetro

Haz de Luz
luz monocromada
DETECTOR

Fuente de Compartimento para la Registro

Monocromador:
radiación Filtro Muestra
https://www.youtube.com/watch?v=wS0va4G2UMA
 Componentes de un Espectrofotómetro

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que

contenga la muestra.
Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente.

Espectrofotómetro

Haz de Luz
luz monocromada
DETECTOR

Fuente de Monocromador: Compartimento para la Registro

radiación Filtro Muestra

https://www.youtube.com/watch?v=wS0va4G2UMA
 Componentes de un Espectrofotómetro

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales

eléctricas.

5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Espectrofotómetro

Haz de Luz
luz monocromada
DETECTOR

Fuente de Monocromador: Compartimento para la Registro

radiación Filtro Muestra

https://www.youtube.com/watch?v=wS0va4G2UMA
 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Espectrofotómetro

▪ Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz,
el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el
resto (It).
▪ De forma que se cumple: Io = Ia + It

Li Lt
Li : Luz incidente
Lt : Luz transmitida
b : Ancho de la cubeta.
b
 Espectrofotómetro

▪ De acuerdo a las características de la sustancia analizada, la luz que no

se absorbe atraviesa la solución.
Io = Ia + It

Li Lt

Li : Luz incidente b
Lt : Luz transmitida
b : Ancho de la cubeta.
 Absorbancia

• La Absorbancia es un concepto más relacionado con la muestra puesto que

nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/T, en consecuencia:

A = - log T = log 1/T

 Transmitancia

• La Transmitancia es la relación entre la cantidad de luz transmitida que

llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It , y la cantidad de
luz que incidió sobre ella, I0 , y se representa normalmente en porcentaje :

%T =It / I0 x 100
 Transmitancia y Absorbancia (DO)

▪ Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, la
absorbancia es cero.

Luz

Transmitancia: 100% Absorbancia 0

 Transmitancia y Absorbancia (DO)

▪ La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través

de la solución de la concentración de éste.

Luz

Transmitancia: 40% Absorbancia 0.40

 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Ley de Lambert y Beer
▪ Relaciona la absorción de luz monocromática (longitud de onda fija) y la
concentración de un cromóforo en solución :

A= log I0/I = ε.b.c

▪ Depende de la distancia que recorre la luz por la solución, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará.
▪ Depende ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de
extinción- que es específica de cada cromóforo.
Sustancia absorbente A= Absorbancia o Densidad Óptica (Adimensional)
I = Intensidad
ε = coeficiente de absortividad
Intensidad b = trayecto óptico
transmitida c = concentración
 Ley de Lambert y Beer

▪ La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su

concentración.

Absorbancia Concentración

A= log I0/I = ε.b.c

Sustancia absorbente A= Absorbancia o Densidad Óptica (Adimensional)
I = Intensidad
ε = coeficiente de absortividad
Intensidad b = trayecto óptico
transmitida c = concentración
 Aplicación

[ ] problema = Absorbancia x Factor de Calibración

Factor de Calibración
Es la concentración de una sustancia que corresponde a una unidad de medida,
generalmente 0,001 de absorbancia.

FC = Concentración del patrón / Absorbancia del patrón

 Fórmula única

[ ] = Abs. x FC
 Preguntas

❖ ¿Qué es la técnica de Espectrofotometría ?

❖ ¿Qué es un espectrofotómetro?
❖ ¿Cuáles son los componentes de un espectrofotómetro?
❖ ¿Cómo funciona el espectrofotómetro?

❖ ¿ De qué se trata la Ley de Lambert y Beer?

❖ ¿Cómo construir una curva patrón?
 Curva patrón

• Marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una

sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de moléculas
presentes en una muestra incógnita o desconocida.
 Preparación de una curva patrón

Ejemplo:
Diluciones con azul de metileno.
• Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al
Espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en
DO como en % de Transmitancia.

Tubo N°
Contenido
1 2 3 4 5

Azul metileno mL 0 2 4 6 8

Agua destilada mL 8 6 4 2 0
 Preparación de una curva patrón
Ejercicio

• Obtener la concentración del tubo 3 y 4 usando las fórmulas antes mencionadas.

Tubo N°
Contenido
1 2 3 4 5

Absorbancia 0.0 0.785 0.932 1.250 1.535

Concentración(mg/dl) 0.0 0.013 0.015 0.020 0,025

FC= 0.016
Curva patrón
 MOTÍVATE

CELEBRA TUS PROPONTE

TRIUNFOS METAS

DISFRUTA ESFUÉRZATE

PERSEVERA

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