Spektrometrija masa

Principi metode

• Molekula se u gasnoj fazi jonizira, pri čemu nastaje molekulski jon (np. radikal kation).
• Molekulski jon se dalje fragmentira, pri čemu nastaju fragmentni joni.
• Fragmentni joni se dalje raspadaju.
• Svi nastali joni se sakupljaju i odvajaju na osnovu odnosa mase i naboja (m/z).
• Odvojeni joni se registriraju na osnovu svog relativnog intenziteta.
• Rezultat je spektrogram masa koji predstavlja grafički prikaz relativnog intenziteta
pojedinog jona u ovisnosti od njegovog odnosa mase i naboja.
Fagmentacija

• Jonizacija molekule udarom elektrona.

• Nastanak radikal kationa koji se fragmentira na dva načina: jon sa parnim brojem
elektrona i radikal ili radikal kation i neutralna molekula.
• Grafički prikaz spektrograma masa.
Primjena metode

• Identifikacija nepoznate strukture i kvantitativna analiza supstanci u tragovima.

• Primjena u biokemijskoj analitici: proteomi, metabolomi i dr.

• Identifikacija i praćenje metabolita lijekova.

• Forenzičke analize.

• Rutinske analize polutanata u okolišu i hrani.

• Analiza prirodnih produkata.

• Određivanje kinetike reakcije, termodinaskih parametara i praćenje reakcija jon-

molekula.

• Geokronologija

• Atomska fizika

Prikaz spektra

• Na X osu se nanosi m/z a na Y osu

relativni intenzitet.

• Bazni pik je onaj koji ima najveći

intenzitet njemu se arbitrarno
dodjlejuje 100%.

• Molekulski jon nastaje obično

gubitkom jednog elektrona iz
molekule i ima m/z jednak
molekulskoj masi, pod uvjetom da je
z=1.

Načini za izračunavanje mase

• Stehiometrijska, prosječna masa:

koristi za izračunavanje prosječnu atomsku masu koja se dobije na osnovu mase izotopa
nekog elementa i njihove relativne zastupljenosti.

• Nominalna masa: koristi se atomska masa najzastupljenijeg izotopa, zaokružena na

najbliži cijeli broj koji odgovara atomskom broju.
 • Egzaktna, monoizotopska masa: uzima se u obzir egzakna masa svakog izotopa koja je
zbog defekta mase nešto niža od cijelog broja. Ovaj defekt mase je ekvivaklentan energiji
koja je potrebna da se čestice “drže” zajedno.

Primjer izračunavanja masa

• Klor ima dva izotopa: Cl mase 34,968 852 koji je zastupljen sa 75,77% i Cl 36, 965 903
koji je zastupljen sa 24,23%.
• Prosječna atomska masa klora je: 34,968 852 x 0,7577 + 36,965 9603 x 0,2423 = 35,453.
• Prosječna masa CH3Cl je 12,011 + (3 x 1,00794) + 35,453 = 50,4878.
• Monoizotopna masa CH3Cl je 12,000 000 + (3 x 1,007 825) + 34,968 852 = 49,992 327.
• Kada se CH3Cl snima spektrometrom masa, dobiju se dva signala molekulskog jona:
jedan na 49,992 327, što se u spektrima niske rezolucije zaokružuje na 50 i drugi na
51,989 365 što se u spektrima niske rezolucije zaokružuje na 52.
• Rezolucija instrumenta je sposobnost da razlikuje dva bliska signala. Izražava se kao
m/dm.
• Spektri masa snimljeni instrumentima visoke rezolucije omogućavaju elementarnu
analizu svakog signala na osnovu pretpostavlljenog izotopskog sastava.

Načini jonizacije molekule

• Jonizacija elektronima (Udar • Kemijska jonizacija pri

elektrona, Electron Impact, EI) atmosferskom pritisku (Atmospheric
Pressure Chemical Ionization, API)
• Kemijska jonizacija (CI)
• Fotojonizacija pri atmosferskom
• Jonizacija u polju (Field Ionisation, pritisku (Atmospheric Pressure
FI) Photoionization)
• Bombardiranje brzim atomima (Fast • Različiti načini jonizacije
Atom Bombardment, FAB) neorganskih spojeva
• Desorpcija u polju (Field Desorption,
FD)
• Desorpcija u plazmi (Plasma
Desorption, PD)
• Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionisation (MALDI)
• Termosprej (Thermospray)
• Elektrosprej (Electrospray)
Jonski izvor za EI Izgled spektra u ovisnosti od
energije jonizacije

Mehanizam jonizacije udarom elektrona

• Svaki elektron ima svoju valnu dužinu.

• Za kinetičku energiju od 20 eV ta valna dužina je 0,27 nm a za 70 eV je

0,14 nm.

• Kada je valna dužina jednaka dužini veze, dolazi do poremećaja u elektronskim

orbitalama i elektron se “izbacuje” iz molekule.

Kemijska jonizacija (CI)

• Daje jone sa neznatnim viškom energije.

• Molekulski joni se lako mogu prepoznati.
• Joni ispitivane supstance nastaju kolizijom sa primarnim jonima u jonskom izvoru.
• Elektron u jonskom izvoru dovodi do jonizacije gasa reaktanta i nastanka plazme.
• Nastaju i pozitivni i negativni joni ispitivane supstance.
• Moguće reakcije su prenos protona, uklanjanje hidrogena, formiranje adukata, prenos
naelektrisanja i dr.
• Joni koji nastaju uklanjanjem hidrogena s molekule, adicijom hidrogena na molekulu ili
adicijom nekog drugog jona na molekulu zovu se joni molekulskih vrsta ili
pseudomolekulski joni.
CI prenosom protona

• GH+ + M MH+ + G
• GH+ se ponaša kao Bronstedova kiselina.
• Efikasnost protoniranja ovisi od protonskog afiniteta (PA) gasa reaktanta i ispitivane
supstance.
• Protonski afinitet je
negativna promjena
entalpije u reakciji
protoniranja.
• Nastanak protonirane
ispitivane molekule MH+ je
moguć ako molekula M ima veći
protonski afinitet od gasa
reaktanta.

Protonski afinitet gasova reaktanata

• Metan 5,7 eV
• Izobutan 8,5 eV
• Amonijak 9,0 eV
• Protoniranje izobutanom i
amonijakom je mnogo
manje egzotermno, tako da u
reakciji sa njima uglavnom ne
nastaju fragmentni joni.

Razlika između EI i CI spektra benzil metakrilata

1. EI
2. CI sa metanom
3. CI sa izobutanom
CI formiranje adukata

• U plazmi jona svi joni se mogu vezati za polarne molekule i formirati adukte.
• Proces je favoriziran nastankom hidrogenovih veza.
• Svaki jon može biti vezan ili s molekulom
analita ili s molekulom gasa reaktanta.
CI prenosom naelektrisanja

• Plemeniti plinovi, CO i gasovi s visokim jonizacionim potencijalom reagiraju prenosom

naelektrisanja.

• Nastaje radikal kation ispitivane molekule, ali s

manjim viškom energije i uz manju
fragmentaciju nego u EI.

Metan kao gas reaktant

• Primarna reakcija

• Dalja fragmentacija

• Kolizija sa drugom
molekulom

Nastanak C3H5 jona

 FAB

Maseni analizatori

• Magnetni i elektromagnetni • Analizatori vremena preleta (Time-

analizator of-Flight Analyser)
• Kvadrupolni analizator • Jon Ciklotronska Rezonancija i FT
• Ion Trap Analyser Spektrometrija masa
• Elektrostatski trap (Orbitrap) • Tandemna spektrometrija masa
• Hibridni instrumenti
Elektrostatski i magnetni analizatori

• Na jon mase m djeluje napon akceleracije V i daje mu kinetičku energiju E:

Magnetno polje koje djeluje

normalno na putanju jona djeluje silom:

• Ako je radijus putanje jona r, centrifugalna sila je jednaka magnetnoj:

• Kinetička energija jona koji izlazi iz jonskog izvora je:

 • Iz toga slijedi:

• Radijus putanje jona je:

Utjecaj električnog polja

• Elektrostatsko polje je u ravnoteži s centrifugalnom silom:

Kvadrupolni analizator

• Kvadrupolni analizator koristi stabilne putanje jona u oscilirajućem električnom polju da

bi odvojio jone na osnovu odnosa mase i naboja.
• Sastoji se od 4 čelične elektrode hiperboličkog presjeka.
• Po dvije naspramne elektrode su vezane za pozitivni, odnosno negativni napon.
• Na ovo stalno elektrostatsko polje se dovodi promjenjivo elektromagnetno polje
(radiofrekventni signal).
• Na jone koji se kreću duž z ose djeluje ukupno električno polje koje čine promjenjivo
električno polje i stalno elektrostatsko polje:

F0 = potencijal na elektrodama;

 = ugaona frekvencija (u
radijanima po sekundi) = 2pn (n
je frekvencija RF polja);

U = stalni potencijal, obično 500-2000V

V = potencijal RF signala mjeren od 0 do maksimuma amplitude, obično 0-3000 V

Jednačine kretanja jona

• Joni koji uđu u kvadrupolni analizator nastavljaju kretanje duž z ose, ali dobivaju
ubrzanja i u pravcu x i y ose, pod utjecajem sila izazvanih električnim poljima:

• Fi je funkcija od Fi0

Diferenciranjem i
preuređivanjem izraza dobiju se slijedeće
jednačine kretanja (Paulove jednačine):

Fizičar Mathieu je kretanje valova kroz membrane opisao slijedećom jednačinom:

Ako se uzme u obzir da potencijal duž x ose ima

suprotan predznak od potencijala duž y ose,
jednačina kretanja jona u polju dobiva oblik Mathieu-ove jednačine.

 iz Mathieu-ove jednačine se može zamijeniti sa wt/2 pa je:

Uvršatavnejm ovih zamjena u Paulove jednačine, dobije se:

• Prethodne jednačine jasno pokazuju vezu između koordinata jona i vremena.

• Samo joni čije su oscilacije duž x i y ose manje od r0 (razmak između elektroda) imaju
stabilnu putanju i mogu napustiti kvadrupolni analizator.
 • Pošto je za svaki instrument r0 konstantna vrijednost, a w=2pn se drži konstantnom,
stabilne koordinate x i y za jon bilo koje mase u nekom vremenskom intervalu se mogu
predstaviti kao funkcija U i V:

Pošto su:

Slijedi:

Prostor gdje su oscilacije Prostor gdje su oscilacije prostor gdje je

jona stabilne duž x ose se jona stabilne duž y ose se putanja jona
predstavlja: predstavlja stabilna i duž x i
duž y ose:
Na presjeku ovih
prostora je

• Iz prethodnih jednačina se vidi da “prelazak” sa jedne

stabilne m/z na drugu znači proporcionalno umnožavanje au i qu.

• Mijenjajući U i V pri čemu se njihov odnos drži konstantnim, sukcesivno se u stabilno

područje dovode joni različitog m/z.

• U praksi je najviši postignuti m/z

4000, ali iznad m/z 3000 rezolucija
značajno opada.

• Kvadrupolni analizatori imaju

nominalnu rezoluciju 1.
• Ovi analizatori ne ovise o kinetičkoj energiji jona koji napuštaju jonski izvor, pa se zbog
toga u jonskom izvoru mogu koristiti niski naponi koji, opet, dopuštaju više pritiske u
izvoru.

• Da bi se postiglo razdvajanje na osnovu m/z vrijeme potrebno da se prođe analizator

mora biti razmjerno kratko u odnosu na vrijeme prebacivanja s jedne mase na drugu, ali
istovremeno mora biti dovoljno dugo da omogući nekoliko oscilacija jona između
elektroda.

Trostruko fokusirajući kvadrupolni analizatori