Informe 7: Preparación y Estudio Cinético de La Invertasa de La Levadura

Aronátegui, Anabella (8-986-459)

Cuvillier, Jean Luc (8-995-1121)
Rodríguez, Soliette (8-967-1619)
Zeballos, Aileen (8-997-264)
Universidad de Panamá
Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y Tecnología
QM 217-Bioquímica
Profesor: Elio Muñoz
7 de noviembre de 2022

Resumen

En la experiencia se realizó un estudio cinético de la actividad de la invertasa, que

comprenderá la determinación de velocidades iniciales así como estudios del efecto
de algunos factores como la concentración del enzima; pH con establecimiento del
rango de valores de pH en el que el enzima es activo determinación del pH óptimo;
la temperatura, logrando la determinación de la temperatura óptima, energía de
activación y valor del coeficiente de temperatura, también la concentración de
sustrato, con establecimiento del modelo cinético y determinación de los parámetros
cinéticos del enzima.

Introducción

Para comenzar a desarrollar nuestra experiencia debemos conocer algunos

términos que se estarán utilizando en el como, la levadura que se le conoce como a
cualquiera de los hongos microscópicos predominantemente unicelulares en su ciclo
de vida, generalmente caracterizados por dividirse asexualmente por gemación o
bipartición y por tener estados sexuales que no están adjuntos a un micelio o
conjunto de hifas.

Las levaduras se conocen por su gran capacidad para realizar la descomposición

mediante fermentación (predominantemente alcohólica) de diversos compuestos
orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas
sustancias.

​ or esta razón se emplea en muchos procesos de fermentación industrial, de forma

P
similar a la levadura química, por ejemplo en la producción de cerveza, vino,
hidromiel, pan, antibióticos, etc.
Además producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos,
principalmente azúcares, y alguna estructura proteica.
Ya que conocemos estos datos esenciales que usaremos en nuestro laboratorio
podemos empezar a desglosar las cosas paso que hicimos y nuestras
observaciones.

Resultados

1. “Preparación del extracto bruto”

Pesa 5.0 g de levadura seca suspendela en 25 mL de 𝑁𝑎𝐻𝐶𝑂3 0.15 M y
colócalo en un baño de agua a 45°C durante 24 h para que se realice la
autolisis. A continuación centrifuga la suspensión por 20 min a 10 000 rpm,
elimina el sedimento y utiliza el sobrenadante para las pruebas de actividad
enzimática de la invertasa.

2. Determinación de la concentración de proteína en el “extracto bruto”

Transfiere 0.5 mL del “extracto bruto” a 9.5 mL de agua destilada y agita.
Toma 1.0 mL de éste y adiciónale 4 mL del reactivo de Biuret, mezcla y deja
reposar por 30 min. Lee la absorbancia a 540 nm, contra un blanco
preparado con agua destilada. Determina el contenido de proteína utilizando
un patrón de albúmina. Para esto utiliza la siguiente relación:

𝐴𝑝 𝐴𝑚
𝐶𝑝
= 𝐶𝑚

Ap= absorbancia del patrón

Am= absorbancia de la muestra
Cp= concentración del patrón
Cm= concentración de la muestra

3. Dilución del “extracto bruto”

Prepara diluciones del “extracto bruto” 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000. Se
disponen 5 tubos de ensayo como aparece en la siguiente tabla.

Tubo B 1/100 1/200 1/500 1/1000

Amortiguador pH 4.6 --- 1.0 1.0 1.0 1.0

Agua 3.5 1.0 1.0 1.0 1.0

Enzima diluida --- 0.5 0.5 0.5 0.5

Nota: las cantidades son en unidades de mililitros.

 A excepción del tubo blanco, añadele 1.0 mL de la solución de sacarosa 0.3
M en el mismo orden según la tabla, se agita vigorosamente y se incuban los
tubos a temperatura ambiente por 10 minutos. Al finalizar el periodo se
adiciona 1.0 mL de la solución de tartrato de cobre (Soln. de Nelson), se agita
bien los tubos, se colocan en ellos canicas y se incuban en un baño maría
por 15 minutos. Transcurrido el tiempo, se enfrían los tubos y se adiciona 1.0
mL de solución de arsenomolibdato y se agitan los mismos. Se completa el
volumen de cada tubo con agua destilada hasta 10 mL agitando y mezclando
bien y se lee la absorbancia a 510 nm, contra un blanco. Evite que las celdas
contengan burbujas de aire.

La dilución apropiada es aquella que se presenta entre un rango de 0.3 a 0.7

nm. Para los ensayos posteriores la actividad será expresada en términos de
unidades de absorbancia, como medida de formación de azúcares
reductores.

4. Efecto de la concentración de la enzima

Con la dilución apropiada del extracto, prepara un conjunto de tubos de
ensayos de acuerdo al siguiente cuadro:

Amortiguador pH
Tubo Agua Enzima diluida
4.6

1 1.0 1.3 0.2

2 1.0 1.2 0.3

3 1.0 1.1 0.4

4 1.0 1.0 0.5

5 1.0 0.5 1.0

6 1.0 1.5 ---

7 1.0 1.5 1.0

A continuación añade a cada tubo (1 a 6) 1.0 mL de la solución de sacarosa 0.3 M y

se agita vigorosamente. Incuba los tubos a temperatura ambiente durante 10
minutos y “Se continúa con los mismos pasos de acuerdo al punto anterior” (3).
Construye un gráfico concentración de proteína o volumen de la enzima contra
azúcares reductores formados, medidos como absorbancia y comenta tus
resultados.
 Tubo Absorbancia (510)

1 2.268

2 2.337

3 2.804

4 2.273

5 2.432

6 0.00

7 2.607

Gráfica #1
Efecto de la concentración de la enzima
 5. Determinación del pH óptimo de la invertasa
Completa todos los volúmenes indicados para cada tubo según el siguiente
cuadro:

Tubo Amortiguador Agua Enzima Dil.

1 pH 4.0 1.0 1.0 0.5

2 pH 4.6 1.0 1.0 0.5

3 pH 5.0 1.0 1.0 0.5

4 pH 6.0 1.0 1.0 0.5

5 pH 7.0 1.0 1.0 0.5

6 pH 8.0 1.0 1.0 0.5

7 --- --- 3.0 0.5

8 --- --- 2.5 ---

Con excepción del tubo 7, añade a cada tubo 1.0 mL de sacarosa 3.0 M, agita
vigorosamente, deja incubar por 10 minutos a temperatura ambiente y “Se continua
según los mismos pasos del punto 3”. Grafica la absorbancia contra pH y analiza la
actividad enzimática con respecto al pH del medio. Anota tus resultados y
comentarios.

Tubo Absorbancia (510)

1 >3.5

2 3.325

3 3.111

4 2.382

5 >3.5

6 2.200

7 00.00

8 1.704
Gráfica #2
Determinación del pH óptimo de la invertasa

6. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la invertasa

Prepara 5 sistemas (tubos de ensayo) conteniendo 1.0 mL de amortiguador
pH 4.6, 1.0 mL de agua destilada, 0.5 mL de la enzima diluida y 1.0 mL de
sacarosa 0.3 M e incuba durante 10 minutos a temperaturas de 20°, 30°, 40°,
50° y 60°C respectivamente. Paralelamente prepare un blanco con agua
destilada. Luego de pasado el termino “continúa de acuerdo a los pasos del
punto 3”. Grafica la absorbancia con respecto a la temperatura. Analiza y
anota tus resultados.

Tubo Temperatura Absorbancia (510)

1 20° 1.904

2 30° 2.124

3 40° 1.920

4 50° 2.644

5 60° 2.528
Gráfica #3
Efecto de la temperatura sobre la actividad de la invertasa

7. Determinación de la constante de Michaelis-Menten (km)

Para determinar la constante de Michaelis-Menten de la invertasa o sea, la
concentración de sacarosa capaz de proporcionar la mitad de la velocidad
máxima de la enzima, completa el sistema de tubos según el siguiente
cuadro:

Tubo Amortiguador (pH 4.6) Agua Sacarosa (0.3M)

1 1.0 1.95 0.05

2 1.0 1.85 0.15

3 1.0 1.75 0.25

4 1.0 1.50 0.5

5 1.0 1.00 1.0

6 1.0 --- 2.0

7 1.0 2.00 ---

A cada tubo adiciónale 0.5 mL de enzima diluida, incuba a temperatura ambiente

por 10 minutos y “continua de acuerdo a los pasos del punto 3”. Determina la
concentración de azúcar en cada tubo. Calcula la velocidad de la reacción en
términos de absorbancia, pero esta vez a 540 nm. A partir de un gráfico Analiza y
formula comentarios sobre tus resultados.
 Tubo Absorbancia (540)

1 -0.065

2 -0.208

3 0.696

4 1.578

5 2.71

6 2.777

7 0

Gráfica #4
Determinación de la constante de Michaelis-Menten (km)
Análisis de los resultados

Cuestionario:

1. Consulta y comenta qué actividades específicas, si las hay, afectan en forma

directa la actividad enzimática, diferentes a las estudiadas en el laboratorio.
R/.
a. concentración del enzima
b. pH, con establecimiento del rango de valores de pH en el que el
enzima es activo y determinación del pH óptimo
c. temperatura, con establecimiento del rango de valores de temperatura
en el que el enzima es activo y determinación de la temperatura
óptima, energía de activación y valor del coeficiente de temperatura
d. concentración de sustrato, con establecimiento del modelo cinético

2. ¿Qué infiere sobre la actividad enzimática a baja temperatura del medio?

R/. A bajas temperaturas, el aporte de calor usualmente aumenta la velocidad
de una reacción enzimática, porque los reactivos tienen mayor energía y
pueden alcanzar el nivel de la energía de activación con mayor facilidad.

3. ¿Qué características debe tener la enzima con el pH del medio con relación a
la actividad enzimática?
R/. Cada enzima tiene un rango óptimo de pH. Cambiar el pH fuera de este
rango hará más lenta la actividad de la enzima. Valores de pH extremos
pueden causar la desnaturalización de la enzima.

4. ¿Se afectaría la curva del cálculo de la constante de Michaelis-Menten (km)

cuando se altera la concentración de la enzima? Explica brevemente.
R/. Sí, ya que al aumentar la concentración de la enzima se acelerará la
reacción, siempre que se disponga de sustrato al cual unirse. Una vez que
todo el sustrato esté adherido, la reacción deja de acelerarse, puesto que no
hay algo a lo las enzimas adicionales se puedan unir.

Conclusiones

La práctica tiene como finalidad realizar estudios clásicos de cinética enzimática,

considerando una serie de factores típicos que condicionan claramente la actividad
de las enzimas. Se pudo concluir con la práctica que la capacidad de interpretar la
química cinética de una enzima se puede mostrar con las distintas pruebas
realizadas en el laboratorio. Se demostró en forma de gráfica la cinética de una
enzima y así se conoció los parámetros que afectan la actividad de una enzima.
Bibliografía

Online Labs for schools - Developed by Amrita Vishwa Vidyapeetham and CDAC
Online Lab. (s. f.). Online labs for schools. Recuperado 30 de octubre de 2022, de
https://www.olabs.edu.in/?pg=topMenu&id=41

Problemas de Energía, Enzimas y Catalasa. (2004, abril). El proyecto biológico

bioquímica.
http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/energy_enzymes_catalys
is/07t.html#:~:text=A%20bajas%20temperaturas%2C%20el%20aporte,de%20activa
ci%C3%B3n%20con%20mayor%20facilidad.