Cas9 介导的同源重组

Cas9 介导同源重组（HDR）的基本操作和做基因敲除（KO）基本一致（Fig 1），除了

需要多引入一条修复模板（repair template）。顺利的情况下整套操作下来至少需要 4 周时间

（心急吃不到热豆腐嘞~~）
，其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤（小伙伴在这一步

可以开开脑洞优化一下）
。

WT 的 Cas9 （这里指 spCas9）是引起双链断裂（DSB）

，进而引起 NHEJ（nonhomologous

end joining，意思就是断裂的末端重新连起来，这一过程容易产生 indels）或者 HDR（修复

模板存在）；但有一个突变体（D10A）却只保留了切口酶的活性（nickase） （spCas9n），

一般不会引起 NHEJ，但会引起 HDR（修复模板存在）。大家周知 WT 的 spCas9 会有些微的

脱靶效应，因此利用 cas9n 代替 WT 的 cas9 产生 deletion（需要两条 sgRNA 同时作用）或

者 HDR 可以降低一部分脱靶的效果（Fig. 2）。

Fig 1. Cas9 敲除/敲入基因时间安排(1)。

 Fig 2. Cas9 (D10A)突变体（Cas9n）只保留 nickase 活性。这一突变体不会引起 NHJE。

如果同有两条 sgRNA 靶向一个 gene 的不同位点，Cas9n 会引起一个片段（两个 sgRNA 之

间）的 deletion。修复模板存在的情况下可以引起 HDR(1)。

今天的内容主要讲讲利用 Cas9 怎么做同源重组（修复）

（HDR）
。其实基因的敲入（KI）

也是一模一样的做法。

一、 同源臂的设计：和做 KO 比较，做 HDR 最大的不同就是要有同源模板的

存在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3):

1. 单链模板：手动设计单侧同源臂长度不低于 40 nt，但强烈推荐设计~90 nt。

找引物合成公司合成较长单连 oligo 即可(90+90+Insertion)，针对正链或者反链合成都

ok。没有必要使用 PAGE 纯化。为了验证方便，建议引入酶切位点（RFLP 法）。当然，

同源模板也可以是线性化的双链 DNA 片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR

获得。溶解成终浓度 10 M，-20C 分装保存。

2. 线性化双链模板：同源臂在 1000 nt 左右；线性化载体或者 PCR 产物作为转染

模板；

二、 转染：
12-孔板：~2105 cells/well (50-70% confluency)

500 ng Cas9（或者 Cas9n）-sgRNA

1 l 单链同源模板（10 M）

三、 鉴定方法：

通过 GFP 或者 puromycin 富集成 mixture，然后直接 PCR 测序或者利用 Restriction-fragment

length polymorphism (RFLP) 分析方法.

四、 结论：

1. WT 的 Cas9 直接切割双链，引起 DSB，重组效果最好，但会引起脱靶；

2. 单链 oligo 作为模板优于线性化载体作为模板；

3. 貌似反义 oligo 的模板效果优于正链。

Fig 3. Cas9 介导同源重组(1)

五、 多说几句

目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系（包括 ES 细胞等）/受精卵（Zygote）
 中操作，因为效率还是比较高的。对于操作细胞系来说，结合单克隆挑取，往往可以获

得 100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作，也可以达到>50%的效率（被矫正的后代占

全部后代的百分比）(2, 3)。已有报道 AAV 介导的 spCas9 在小鼠的脑内可以有效编辑

目的基因(4)，但对于成年动物其他组织的矫正则未必能 work。虽然现在有更小的

Cas9-saCas9 可以被包装成 AAV 高效特异性的导入到小鼠某个组织或者器官，但由于编

辑工具的局限性整体效果往往并不理想(5, 6)；再加上同源重组的效率会进一步降低。

即使如此，研究者依然可以去 try，比如在新生鼠时期利用 AAV-saCas9 进行局部注射编

辑和重组效果可能会好一些。AAV-Cas9 作为目前最流行的工具组合起来使用，一定是

将来几年最热门的研究热点（汉恒生物提供多种血清型的高滴度 AAV-sgRNA-saCas9）。

将来某一天，也许会产生可以上市的 AAV-Cas9 基因治疗药物。

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