Professional Documents
Culture Documents
Рендгенска структура анализа
Рендгенска структура анализа
1
Историјски подаци
Рендгенски зраци откривени су 1895. године, и име су добили према свом проналазачу,
немачком научнику Вилхелму Конраду Рентгену. Прве експерименте са дифракцијом X
зрачења на кристалима спровео је Макс фон Лауе 1911. на кристалима соли. Одмах је
уочен огроман потенцијал ове методе за одређивање структуре молекула — до тада
доступне само преко хемијских и хидродинамичких експеримената. Пионири у развоју
рендгенске структурне анализе били су и Вилијам Браг и Бернал. Први протеин чија
кристална структура је решена био је миоглобин једне врсте китова и то радовима Макса
Перуца и Џона Кендрјуа(1958), за шта су добили Нобелову награду за хемију.
3D изглед протеина
Теоријске основе
Основни услов који треба испунити да би дошло до дифракције електромагнетног зрачења
јесте да таласна дужина зрачења и димензије решетке буду блиске. То је задовољено јер
је таласна дужина X-зрачења 10-9-10-11 m, што је истог реда величине као и размак суседних
равни у кристалу (1-10 Ǻ).
Када рендгенски зраци падну на кристал атоми или јони почињу да делују као нови,
секундарни извори зрачења (Хајгенсов принцип), тј. долази до расипања рендгенских зрака
на електронским облацима атома. Између расутих зрака долази до интеракције при чему
се део таласа појачава, а део слаби или чак поништава и та појава позната је као
дифракција.
2
Брагов закон
Услов за конструктивну интерференцију два овако добијена зрака јесте да је њихова путна
разлика једнака целобројном умношку таласних дужина (λ) зрачења:
где је
3
Евалдова сфера
4
Експерименталне методе РСА-е
Ако се одреде и интензитети зрачења и фазне разлике у односу на упадно зрачење може
се, Фуријеовом трансформацијом одредити просторна дистрибуција електронских густина:
5
Класификација експерименталних медота
Велика примена РСА данас је, као што је већ поменуто, у одређивању структуре протеина
и других биомолекула. Овде су описани основни кораци у једној таквој анализи протеина.
Примењује се метод дифракције на монокристалу, и као што је горе поменуто користи се
монохроматско рендгенско зрачење. Користи се монокристал испитиваног једињења.
Услови кристализације
6
Стварање кристала довољно квалитетног за дифракцију (довољно правилна структура) је
један од главних проблема у експериментима одређивања атомске структуре протеина. До
сада је овај процес слабо разјашњен и добијање доброг кристала своди се више на
уметност него на науку. Основна идеја је споро, постепено смањење растворљивости
молекула, било снижавањем температуре или повећавањем концентрације раствора. Ако
се процес изведе брзо или са неравномерном променом ових величина тј. услова
кристализације молекули само преципитују формирајући прах на дну суда.
Раствор протеина се затим концентрује. Постоје многе методе кристализације које раде на
принципу дијализе, дифузија течности, мешања два раствора као и класичне методе
испаравања, којима можемо добити кристале испитиваних протеина. Правило је да се
корисна информација о структури може добити за кристале који дифрактују са резолуцијом
већом од 4 ангстрема (400пм), што је граница за квалитет кристала који желимо да
добијемо.
7
последње време направљени су неки помаци у методама израчунавања који омогућавају
одређивање и оваквих структура, мада је то још увек тешко.
Снимање дифрактограма
Пре него што је у експеримент уведено хлађење кристала подаци су добијани на собним
температурама. Због горе описаних проблема који се јављају притом (шум) било је
потребно извршити многострука мерења за један скуп података што је продужавало време
анализе. Данас је време анализе додатно смањено и коришћењем скупа CCD детектора
који покривају широк опсег углова истовремено.
Обрада података
Основни циљ РСА-е јесте одређивање функције расподеле електронске густине, ф(ρ) у
кристалу. Подаци добијени експериментом представљају репрезентацију кристалне
решетке у реципрочном простору. Математички је могуће из тога добити изглед решетке у
реалном простору.
8
Фуријеова трансформација
Генерално, функција F(q) је комплексна функција, тј. има поред амплитуде |F(q)|, и фазу
Φ(q) :
тј. у општем случају важи F(q) = F(-q), што је познато као Фриделов закон (Friedel), а
рефлексије које одговарају q тј. –q називају се Фриделови парови. Као последица важења
Фриделовог закона дифракциона слика добијена са било ког кристала увек је централно
симетрична, што смањује број експерименталних података које треба прикупити при
решавању кристалне структуре.
9
Проблем фазе
Постоји неколико начина да се одреде фазе, тј. реши фазни проблем. У најстарије методе
за одређивање кристалне структуре спада метода пробе и грешке. Она се заснива на томе
да се претпостави модел структуре, израчунају структурни фактори и упореде са
експериментално добијеним. Ова метода може да се користи за једноставније структуре и
има углавном историјски значај.
Стога аутокорелациона функција C(q) електронске густине (тј. Патерсонова функција) може
бити израчуната директно из познатих амплитуда, без познавања фазе. У принципу на овај
начин се може директно одредити кристална структура; међутим то је тешко практично
реализовати. Аутокорелациона функција одговара расподели вектора међуатомског
растојања у кристалу. Стога Патерсонова функција за кристал са N атома у елементарној
ћелији може имати N(N-1) максимума. С’ обзиром на неизбежне грешке у мерењу
интензитета и математичким проблемима при реконструкцији атомских позиција из вектора
међуатомских полођаја и ова техника се користи углавном за решавање структуре
једноставнијих кристала.
10
Модел структуре
Када смо добили податак о почетној фази у стању смо да формирамо почетни модел.
Координате атома и њихови Дебај-Велерови фактори се фитују према експерименталним
подацима. Тиме добијамо нови сет фаза и нову мапу електронских густина. Затим
експериментатор прегледа добијене податке, врши корекције на основу искуства или
претпоставки и почиње нови круг побољшања на исти начин. То се наставља док се не
постигне максимална корелација између експерименталних података и модела.
Када је модел молекулске структуре завршен обично се уноси у неку кристалографску базу
података, као што је Протеинска Банка Података, Protein Data Bank (за протеине), или
Кембриџ базу података структура, Cambridge Structure Database (за мање молекуле). Многе
структуре одређене у приватним, комерцијалним лабораторијама у медицинским
истраживањима не налезе се у јавним кристалографским базама података.
Предности и мане
Ниједна друге техника откривена до сад не нуди толико података колико РСА, тј. тачније
дифракција на монокристалу. Типичан кристал даје 20-30 хиљада рефлексија, где је свака
представља један делић укупне информације о структури. Сви ови подаци компјутерском
обрадом дају слику расподеле електронске густине са атомском резолуцијом. Захваљујући
толиком броју независних података ово и јесте најбоља метода за одређивање атомске
структуре било ког молекула.
11