Results

Simplex rRT-PCR standardization

- Before multiplexing, all targeted gene primer/probe set, and RT-PCR reagents were tested in simplex
rRT-PCR
- The quantity of SARS-CoV-2 specific E and RdRP gene primer and probe
set were optimized by using 105 copy/μL of synthetic viral RNA
- Before the reactions, the rRT-PCR instrument was calibrated to get the best fluorescent performance.
- The simplex reactions were repeated at least six times for two viral E and RdRP genes
- One internal control (IC) gene RP.
- The average cycle threshold (Ct) value with standard deviations (SD): 24.1 ± 1.05, 27.1 ± 1.5, and
31.5 ± 1.0 for RP, E, and RdRP, respectively
Duplex rRT-PCR standardization
- The primer and probe: detect one viral (E or RdRP) and one human IC gene (RP)
- Triplicate reactions yielded the Ct value as 23.6 ± 0.77 and 32.3 ± 1.8 for RP and RdRP genes,
respectively
- The Ct values of both reactions are less than 38
Multiplex (triplex) rRT-PCR standardization
- Multiplex rRT-PCR protocol: amplification of three genes (E, RdRP, and RP).
- Sigmoidal amplification curve (Ct ± SD): 28.8 ± 0.51, 27.3± 0.7, and 23.6± 1.04 for RdRP, E, and RP
genes
--> The assay is capable to detect three genes in the same reaction tube.
Limit-of-detection (LOD) and rRT-PCR efficiency
- A serial dilution of synthetic RNA (105, 104, 103, 102 and 101 copies/μL) --> find the limit-of-
detection (LOD) for RdRP and E genes.
- LOD of RdRP gene ≥ 10 copy/ μL
- LOD of E gene ≥ 103 copy/μL.
- The E value of RdRP: 99.9
- R2: 0.977 for the RdRP and 0.995 for the E gene.
Validation of the assay using SARS-CoV-2-positive samples detected by Cepheid‘s system
- Compared our results by using Cepheid’s GeneXpert1 System.
- The nasopharyngeal swabs were collected from COVID-19 at King Fahd
- The samples were kept in VTM medium and 300 μL of the solution
- Using Xpert1 Xpress SARS-CoV-2 detection kit.
- The SARS-CoV-2 positive samples --> viral RNA extraction --> used as template to test
- All Ct values of the E gene are below the threshold accepted by
the CDC (≤ 37)
- RdRP gene, only one clinical sample was out of the threshold,
which is consistent with Cepheid’s assay
- The comparison of Ct values between Cepheid’s E and N2, and the RdRP and E genes of COV2-kit-->
agree-ment between the obtained data
Discussion
- The global increase in the COVID-19 pandemic makes the development of faster, reliable, and
sensitive virus detection methods a priority
- This study aims to develop a multiplex rRT-PCR test that targets two viral (RdRP and E) and one
human (RP) gene simultaneously in a single reaction tube.
- The assay is named as COV2-kit.
- Thanks to the specific probes that were labelled with different fluorescence dyes
- Using different filters of the Applied Biosystems™, 7500 Fast Real-Time PCR System
- Three different approaches were performed to optimize the protocol:
+ simplex (targets single gene)
+ duplex (simultaneously targets two genes)
+ triplex (simultaneously targets three genes)
--> A synthetic viral template together with mRNA of RP gene was used
- The Ct values of the reactions are ranged in between 24 to 34
- The samples with a Ct value of 37.01 or greater are considered as neg
Ative
- The LOD (limit-of-detection) for RdRP and E genes were at least 101 and 103 copy/μL
- The viral load of the COVID-19 patients is the critical factor for the test efficiency
- It can be concluded that RdRP gene provides the maximum detection capability on the patients having
low
viral load (≥ 10 copy/μL).
- A viral load of ≥ 103 copy/μL can be detected by using the E gene as a target.
- The reaction includes a human gene target, RP, as an internal control (IC)
- The IC gene is tested in a separate tube for each reaction --> decreases the sample size to be tested
and increase the expenses
- The number of reactions per sample is reduced
- For instance, the assay allows testing 91 patients in 96-well plates per run, thus provides less time and
save expensive RT-PCR reagents
- Fast, reliable, high-sensitivity and lowcost SARS-CoV-2 detection
- The COV2-kit assay was tested to verify its performance on clinically SARS-CoV-2 positive samples.
- The results were compared by using Cepheid’s GeneXpert1 System
- The Ct value of the E gene was in between 18 and 41 using the Cepheid‘s system. COV2-kit revealed
the Ct scores of the same gene as 27–35.5
- The Ct value of the RdRP gene (COV2-kit) was found to be lower than N2 gene (Cepheid‘s)
--> The sensitivity of COV2-kit than Cepheid‘s system
- Multiplex (triplex) rRT-PCR standardization test: efficient to detect three genes in the same reaction
tube.
- Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is a sensitive assay for the detection of
specified gene sequences encoding the proteins of the virus, such as RNA-dependent RNA polymerase
(RdRP), nucleocapsid (N), envelope (E), and spike (S).
- E gene is an important gene codes for the envelope (E) protein of SARS-CoV-2.
- RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) gene encodes an enzyme responsible for viral replication
Conclusions
- This study demonstrates a multiplex rRT-PCR method for the diagnosis of SARS-CoV-2.
- Provides an accurate, reliable, and easy-to-use SARS-CoV-2 diagnostic test.
- The assay allows working with large numbers of patients using less PCR reagent.
- The cost and reliability of the assay are improved.
- The test must be validated using different RT-PCR instruments
- Can be used in infection prevention and control organizations, hospitals, medical centers, and
diagnostic laboratories.
Kết quả
Chuẩn hóa Simplex rRT-PCR
- Bộ mồi / đầu dò gen được nhắm mục tiêu và thuốc thử RT-PCR được thử nghiệm trong rRT-PCR đơn
giản.
- Số lượng mồi và bộ mẫu dò gen E và RdRP đặc hiệu SARS-CoV-2: 105 bản sao / µL của RNA
- Trước khi có phản ứng, thiết bị RT-PCR được hiệu chỉnh để có được hiệu suất huỳnh quang tốt nhất
- Phản ứng simplex được lặp lại ít nhất sáu lần đối với hai gen E và RdRP
- Một gen kiểm soát nội bộ (IC) RP
- Giá trị ngưỡng chu kỳ trung bình (Ct) với độ lệch chuẩn (SD) lần lượt là 24,1 ± 1,05, 27,1 ± 1,5 và 31,5
± 1,0 đối với RP, E và RdRP
Chuẩn hóa hai mặt rRT-PCR
- Bộ mồi và bộ thăm dò: phát hiện một virus (E hoặc RdRP), một gen IC
- Các phản ứng ba lần mang lại giá trị Ct lần lượt là 23,6 ± 0,77 và 32,3 ± 1,8 cho các gen RP và RdRP
- Giá trị Ct của cả hai phản ứng đều nhỏ hơn 38
Chuẩn hóa rRT-PCR đa kênh (triplex)
- Giao thức đa kênh rRT-PCR: khuếch đại ba gen (E, RdRP và RP)
- Đường cong khuếch đại tín hiệu (Ct ± SD): 28,8 ± 0,51, 27,3 ± 0,7 và 23,6 ± 1,04 đối với các gen RdRP,
E và RP
--> Xét nghiệm có khả năng phát hiện ba gen trong cùng một ống phản ứng
Hiệu quả giới hạn phát hiện (LOD) và rRT-PCR
- Pha loãng RNA tổng hợp: 105, 10, 103, 102 và 10 'bản sao / µL --> tìm giới hạn phát hiện (LOD) cho
các gen RdRP và E
- LOD của gen RdRP> 10 bản sao/ µL
- LOD của gen E> 10³ bản sao / uL
- Giá trị E của các gen RdRP và E: 99.9
- R²: 0,977 đối với RdRP và 0,995 đối với gen E.
Thẩm định xét nghiệm bằng cách sử dụng các mẫu dương tính với SARS-CoV-2 được phát hiện bởi
hệ thống của Cepheid
- So sánh kết quả bằng Hệ thống GeneXpert "của Cepheid
- Thu thập mẫu gạc mũi họng từ những bệnh nhân bị nhiễm COVID-19 tại King Fahd
- Các mẫu được giữ trong môi trường VTM và 300 μL
- Sử dụng bộ phát hiện Xpert (R) Xpress SARS-CoV-2
- Các mẫu posi SARS-CoV-2 --> tách chiết RNA vi rút -->làm khuôn mẫu để kiểm tra xét nghiệm
- Tất cả các giá trị Ct của gen E đều dưới ngưỡng được CDC chấp nhận (≤37)
- Gen RdRP: chỉ có một mẫu lâm sàng nằm ngoài ngưỡng, phù hợp với xét nghiệm của Cepheid
- So sánh các giá trị Ct giữa E và N2 của Cepheid và các gen RdRP và E của COV2-kit--> có sự thống
nhất
Thảo luận
- Sự gia tăng toàn cầu của đại dịch COVID-19 làm cho việc phát triển các phương pháp phát hiện virus
nhanh hơn, đáng tin cậy và nhạy cảm trở thành ưu tiên
- Các nghiên cứu mở rộng nhằm tìm ra một phương pháp phát hiện hiệu quả, đáng tin cậy và nhạy
cảm đối với SARS-CoV-2 vẫn đang được tiến hành.
- Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển một xét nghiệm rRT-PCR đa hợp nhắm vào hai gen virus
(RdRP và E) và một gen người (RP) được mô phỏng thuần túy trong một ống phản ứng duy nhất.
- Thử nghiệm được đặt tên là COV2-kit
- Nhờ các đầu dò cụ thể được gắn nhãn bằng các thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau (HEX, ROX và
FAM), các khuếch đại gen có thể được xác định trong cùng một ống phản ứng bằng cách sử dụng các
bộ lọc khác nhau của Hệ thống PCR Ứng dụng ", 7500 Fast Real-Time PCR.
- Ba cách tiếp cận khác nhau:
+ simplex (nhắm mục tiêu gen đơn)
+ song công (nhắm mục tiêu đồng thời hai gen)
+ triplex (nhắm mục tiêu đồng thời ba gen)
--> Một mẫu virus tổng hợp cùng với mRNA của gen RP đã được sử dụng.
- Giá trị Ct của các phản ứng nằm trong khoảng từ 24 đến 34.
- Các mẫu có giá trị Ct từ 37,01 trở lên: âm tính
- LOD (giới hạn của detec tion) cho các gen RdRP và E lần lượt là ít nhất 10 'và 103 bản sao / μL.
- Các đoạn mồi và đầu dò đối với gen RdRP được phát hiện là nhạy cảm hơn đối với gen E.
- Tải lượng vi rút của bệnh nhân COVID-19 là yếu tố quan trọng đối với hiệu quả xét nghiệm
- Có thể kết luận rằng gen RdRP cung cấp khả năng phát hiện tối đa trên những bệnh nhân có tải
lượng vi rút thấp (> 10 'bản sao / µL).
- Những bệnh nhân có tải lượng vi rút> 103 bản sao / μL có thể được phát hiện bằng cách sử dụng gen
E làm mục tiêu.
--> Các mẫu có tải lượng vi rút thấp có thể được phát hiện bằng cách sử dụng hai phương pháp tiếp
cận nhắm mục tiêu gen nhạy cảm này
- Phản ứng còn bao gồm một mục tiêu gen người, RP, như một biện pháp kiểm soát nội bộ (IC)
- Gen IC được thử nghiệm trong một ống riêng biệt cho mỗi phản ứng, làm giảm kích thước mẫu cần
thử nghiệm và tăng chi phí.
- Ví dụ, xét nghiệm cho phép kiểm tra 91 bệnh nhân trong các đĩa 96 giếng mỗi lần chạy, do đó tiết
kiệm thời gian hơn và tiết kiệm thuốc thử RT-PCR đắt tiền
--> Phát hiện SARS-CoV-2 nhanh chóng, đáng tin cậy, độ nhạy cao và chi phí thấp
Xét nghiệm COV2-kit đã được thử nghiệm để xác minh hiệu suất của nó trên các mẫu dương tính với
SARS-CoV-2 trên lâm sàng.
- kết quả được so sánh bằng cách sử dụng Hệ thống GeneXpert của Cepheid sử dụng bộ phát hiện
XpertⓇ Xpress SARS-CoV-2
- Giá trị Ct của gen E nằm trong khoảng từ 18 đến 41 khi sử dụng hệ thống Cepheid.
- COV2-kit tiết lộ điểm Ct của cùng một gen là 27-35,5. CDC khuyến nghị giới hạn trên của Ct là 37.
- Hiệu suất của gen RdRP của COV2-kit so với gen N2 của Cepheid đã được so sánh, giá trị Ct của gen
RdRP (COV2-kit) được tìm thấy thấp hơn so với gen N2 (Cepheid's)
--> Độ nhạy của COV2-kit hơn so với hệ thống của Cepheid.
- Xét nghiệm tiêu chuẩn hóa rRT-PCR đa phương tiện (triplex) hiệu quả để phát hiện ba gen trong
cùng một ống phản ứng.
- Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là một xét nghiệm nhạy cảm đối với các trình
tự gen xác định mã hóa protein của vi rút, chẳng hạn như RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRP),
nucleocapsid (N), vỏ (E), và tăng đột biến (S).
- So với phân tích sim plex hoặc phân tích song công, phân tích bộ ba cung cấp độ chính xác cao hơn
và tránh được các kết quả sai lệch có thể xảy ra do đột biến ở một trong các gen của virus
Kết luận
- Nghiên cứu này chứng minh một phương pháp rRT-PCR đa hợp để chẩn đoán SARS-CoV-2.
- PCR cung cấp một xét nghiệm chẩn đoán SARS-CoV-2 chính xác, đáng tin cậy và dễ sử dụng
- Xét nghiệm cho phép làm việc với số lượng lớn bệnh nhân sử dụng ít thuốc thử PCR hơn
- Chi phí và độ tin cậy của thử nghiệm được cải thiện
- Thử nghiệm phải được xác nhận bằng cách sử dụng các thiết bị RT-PCR khác nhau và có thể được sử
dụng trong các tổ chức phòng ngừa và kiểm soát nhiễm trùng, bệnh viện, trung tâm y tế và phòng thí
nghiệm chẩn đoán.