UNIVERZITET U TRAVNIKU

Farmaceutsko-zdravstveni fakultet Travnik

ODSJEK/SMJER: Farmacija

“HPLC” U ANALITICI HRANE

-seminarski rad -

Kandidat: Mentor:
Hana Bektaš

Broj indexa:

Travnik, 2019.
SADRŽAJ

UVOD.........................................................................................................................................3

1. HPLC...................................................................................................................................4

1.1. Tečna hromatografija...................................................................................................6

1.2. Koeficijent raspodjele..................................................................................................7

1.3. Faktor selektivnosti......................................................................................................8

1.4. Retenciono vrijeme......................................................................................................8

1.5. Teorijski podovi...........................................................................................................8

1.6. Primjena spektroskopskih metoda u analizi hrane.......................................................9

1.7. Primjena hromatografskih metoda u analizi hrane.....................................................11

1.8. Primjena imunohemijskih metoda u analizi hrane.....................................................13

ZAKLJUČAK...........................................................................................................................14

LITERATURA.........................................................................................................................15

2
UVOD

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, tečna hromatografija pod visokim

pritiskom) je oblik kolonske hromatografije koji se često koristi u analitičkoj hemiji. HPLC se
koristi za razdvajanje komponenti iz smese na osnovu hemijskih interakcija između supstance
koja se analizira i stacionarne faze u koloni.

Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz
kolonu (cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem
tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka
u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog
zadržavanja komponenata smjese.

Vrijeme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i

sastava mobilne faze. Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se
retenciono vrijeme i one je karakteristično za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska
povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava
rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastvarači, čisti ili u bilo kojoj kombinaciji
(npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd).

Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je

koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumijeva promjenu sastava mobilne faze u toku
eluiranja. Uređaj za HPLC se sastoji od sledećih komponenata: rezervoar mobilne faze,
pumpe i injektora.

3
 1. HPLC

Visokopritisna tečna hromatografija (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography)

ređe se označava i kao visokoperformantna tečna hromatografija (HPLC – High Performance
Liquid Chromatography). Kvantitativno određivanje vitamina C HPLC analizom uključuje
pripremu uzoraka, ekstrakciju, saponifikaciju (ili bez), HPLC razdvajanje, identifikaciju
pikova i kvantifikaciju (Marjanović, Krstić, 1998).

Sa R je označen rezervoar za rastvarač ili eluent (smjesu rastvarača), koji za upotrebu

u HPLC mora biti bez čvrstih suspendovanih čestica i bez rastvorenog gasa. Čvrste čestice se
uklanjaju filtracijom kroz ultrafiltre, dok se rastvoreni gasovi uklanjaju ključanjem u
vakuumu, uz pomoć ultrazvuka ili barbotiranjem helijuma. Filter F služi za uklanjanje
slučajno prisutnih čvrstih čestica prečnika oko 10 μm.

Pumpa PU služi da se obezbedi ulazni pritisak mobilne faze, najčešće između 30 i 300
bar, uz odgovarajući protok kroz hromatografski sistem (oko 1 ml/min). Najčešće su u
upotrebi klipne pumpe sa linearnim (jednosmernim) ili naizmeničnim kretanjem klipa.
Upotreba pumpi sa naizmeničnim kretanjem klipa ima jedan nedostatak, a to je pulsiranje
pritiska, odnosno protoka. Zbog toga se neposredno iza pumpe ugrađuje prigušivač oscilacija
(PO).

M predstavlja manometar za mjerenje ulaznog pritiska, a DR ventil za ispuštanje

nepotrebne tečnosti (drain) i za uklanjanje gasa iz prethodno opisanih dijelova. Injektor (I)
predstavlja kritični dio aparature za HPLC jer treba da omogući unošenje uzorka pri visokom
unutrašnjem pritisku bez promjene režima strujanja (protoka). Pri nižim ulaznim pritiscima
(do 70 bar) može se koristiti rješenje sa septumom, dok se za više pritiske koristi rješenje kao
što je gasna slavina, koja se pomjera ručno ili pomoću elektromagneta ili pneumatskog
izvršnog organa. Može se koristiti i rešenje u kombinaciji septuma i gasne slavine.

Najčešća zapremina probe je 10-50 μl. Pretkolona (PK) ima iste karakteristike kao
kolona i zadatak joj je da ukloni nečistoće unijete sa uzorkom i na taj način spriječi
začepljenje kolone. Pretkolone obično imaju dužinu od nekoliko cm.

4
 Kolona (K) može biti izrađena od stakla (ređe), nerđajućeg čelika ili tantala. Na oba
kraja kolone nalaze se proširenja na kojima je narezan navoj na koji se navrće posebna
navrtka (nut) namjenjena za spajanje kolona sa metalnim kapilarama za dovod i odvod
tečnosti. Ove navrtke takođe služe za učvršćivanje sita na početku i kraju kolone koja služe za
uklanjanje grubih nečistoća i kao porozni čep pri punjenju kolone.

Detektor (D) služi za prevođenje signala mase (koncentracije) u električni signal, koji
se zatim pojačava, moduliše i mjeri (registruje). Najčešće su u primjeni UV-detektori
(zasnovani na apsorpciji zračenja iz UV i vidljive oblasti elektromagnetnog spektra), slabije
detektori na bazi mjerenja fluorescencije, indeksa refrakcije, elektrohemijski i ostali. UV
detektori mjere apsorbanciju pri konstantnoj talasnoj dužini (ili rasponu talasnih dužina)
koristeći protočne kivete kroz koje protiče eluat (rastvarač + komponenta) i eluent (rastvarač).

Kako je apsorbancija data izrazom: A = e x l x c gde je: ε-koeficijent apsorbancije; l-

debljina sloja i c-koncentracija, to se osetljivost ovih detektora povećava isključivo
konstrukcijama koje omogućavaju veću dužinu (l), jer se na ostale veličine ne može uticati (ε,
c).

Praktično se grade kao fotometri ili spektrofotometri. Novije konstrukcije ovog

detektora omogućavaju neprekidno mjerenje (snimanje) apsorpcionog spektra supstance
(diode array) što ove detektore čini izuzetno pogodnim za kvalitativnu, a pogotovu
kvantitativnu analizu. Osetljivost ovih detektora je 10-10 g/ml.

U detektoru nastaje električni signal saglasan koncentraciji ispitivane komponente koji

se pojačava (oslabljuje) i zatim zapisuje potenciometrijskim kompenzacionim pisačem (P) ili
se analogni električni signal prevodi u digitalni i zatim mu je put, odnosno obrada, definisana
digitalnim hardverom i softverom (računarskom tehnikom), pri čemu su dominantne funkcije
mjerenja vremena izlaska pikova (maksimuma) i merenja površine pikova (integracija).

Kada je riječ o računarima u sklopu instrumentacije HPLC-a, oni im elucionih

vremena, integracije pikova uz dodatno računanje udijela komponente na bazi funkcije
zavisnosti površine od količine (definisane na bazi standarda). Tumačenje rezultata bez
upotrebe računara pre svega obuhvata kvalitativnu analizu (na osnovu elucionih (retencionih)
vremena uz definisanje intervala povjerenja) i kvantitativnu analizu (na osnovu površina
zahvaćenih pikovima uz prethodno eksperimentalno definisanje funkcije zavisnosti površine
od koncentracije različitim metodama).
5
 Korišćen je HPLC-UV-DAD sistem. Nepokretna faza je bila C-18 kolona (Agilent,
SAD), a pokretna rastvor amonijum-acetata. pH 5,1 koncentracije 0,1mol/l, i protoka 0,4
ml/min. Ove faze su izabrane sa zvaničnog sajta firme Merck, Njemačka.

Sadržaj vitamina C je određen u sve četiri serije uzoraka, koji su prečišćavani aktivnim
ugljem i silika gelom.

Utvrđivanje sadržaja vitamina C je izvedeno na sljedeći način: prvo je iz

hromatograma očitavana površina ispod pika supstance, a potom je proporcijom pomoću
standarda vitamina C određivana koncentracija vitamina u supstratima.

1.1. Tečna hromatografija

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je separaciona analitička tehnika

koja se koristi za razdvajnje istih, sličnih i/ili različitih supstanci iz analizirane smijse.
Razdvajanje se ostvaruje na osnovu različitih raspodela ispitivanih supstanci između dvije
faze - pokretne (mobilne) i nepokretne (stacionarne). Mobilna faza je tečnost, dok je
stacionarna faza čvrsta ili tečna fiksirana na analitičkoj koloni ili nekoj drugoj čvrstoj podlozi.
Tečnom hromatografijom se mogu kvalitativno i kvantitativno, a prvenstveno kvantitativno,
analizirati manje ili više složene smijese jedinjenja rastvorenih u mobilnoj fazi.

Razdvajanje se dešava usljed različitih afiniteta komponenata smijese između pokretne

i nepokretne faze. Analiti nošeni strujom mobilne faze se usled različitih fizičko-hemijskih
osobina se različitom jačinom vezuju za stacionarnu fazu i različito zadržavaju na
hromatografskoj koloni. Analiti koji imaju veći afinitet prema stacionarnoj fazi (manji prema
mobilnoj fazi) duže se zadržavaju i sporije prolaze kroz kolonu i obrnuto.

Kontinualnim protokom mobilne faze analiti se sukcesivno eluiraju sa kolone i

kvalitativno razdvajaju. Razdvojeni analiti različito vrijeme putuju kroz kolonu i u različito
vrijeme dospijevaju do detektora gde se registruju u vidu električnog signala. Električni signal
se preko kompjutera beleže kao hromatografski pik. Površina hromatografskog pika je
direktno proporcionalan koncentraciji analita.

6
 Svaki hromatografski pik predstavlja odgovor detektora za specifični analit, a skup
pikova svih razdvojenih analita predstavlja LC hromatogram. Hromatogram otpočinje sa
pikom analita koji najbrže prođe kroz kolonu, a završava pikom analita sa najdužom
retencijom na koloni. Cilj svake LC analize je postizanje uskih i visokih pikova koji su
pokazatelj dobrog i efikasnog hromatografskog razdvajanja.

Nizom savremenih tehničkih inovacija omogućeno je da se sa različitim parovima

pokretna/nepokretna faza LC analize vrše jednim jedinstvenim aparatom, koji se naziva tečni
hromatograf visokih performansi tj. HPLC (eng. High Performance Liquid Cromatography).

HPLC omogućuje kontinualnu izmjenu hemijskog sastava pokretne faze u cilju

poboljšanja razdvajanja, povezivanje sa raznim tipovima detektora (diode-array, UV/VIS,
fluorescentni, maseni spektrometar i dr.) i automatizaciju postupka od uzimanja uzorka do
detektovanja hromatograma i kvalitativne i kvantitativne obrade podataka odnosno
identifikacije komponenti i određivanje njihove koncentracije.

HPLC predstavlja tečnu hromatografsku tehniku gde se tečnost kroz kolonu potiskuje
pod pritiskom od 400 - 600 bara. Sam naziv potiče od poboljšanja performansi standardnih
aparata za tečnu hromatografiju. Savremeni HPLC modeli omogućuju analize vrlo malih
količina uzorka u količini rastvarača od nekoliko mililitara. Analize su tačnije, praktičnije i
ekonomičnije u odnosu na klasično eluiranje analita kroz vertikalnu hromatografsku kolonu.

1.2. Koeficijent raspodjele

Dok je u mobilnoj fazi, molekul je nošen brzinom kretanja mobilne faze, dok se za
vreme nalaženja u stacionarnoj fazi molekul neće kretati. Zato se komponente sa većim K
sporije kreću kroz stacionarnu fazu u odnosu na komponente čiji je K manji. U idealnom
slučaju koeficijent raspodele je konstantan u širem opsegu koncentracija.

U takvom slučaju, krive koje pokazuju raspodelu analita u dvije faze u zavisnosti od
koncentracija su linearne (linearna hromatografija). U praktičnom radu linearnost je uglavnom
prisutna pri niskim koncentracijama analita, dok se pri višim koncentracijama vrlo često
javljaju odstupanja.

7
 1.3. Faktor selektivnosti

Razdvajanje komponenti smijese će se lakše ostvariti ako je α vrijednost veća. Obično

se uzima da je faktor selektivnosti veći od jedinice (α > 1), tako da se brojilac odnosi na
komponentu koja ima veći K. Selektivnost je mjera uzajamne raspodjele komponenata
smijese u toku hromatografskog procesa i mjera za pokretljivost ovih komponenata.
Povećanjem faktora kapaciteta k'B povećava se razdvajanje ali se povećava i vrijeme trajanja
anlize, pa se velike vrijednosti faktora k'B izbjegavaju (> 10). Optimalne se smatraju
vrijednosti između 2 i 5.

1.4. Retenciono vrijeme

Retenciono vrijeme ili vrijeme zadržavanja tR, je vreme koje prođe od unošenja
analita u kolonu do momenta njenog izlaženja iz kolone. Retenciono vrijeme zavisi od čitavog
niza faktora kao što su fizičko - hemijske osobine mobilne faze (polarnost, viskozitet),
količina stacionarne faze, temperatura kolone, brzina protoka mobilne faze, dimenzije kolone,
vrsta, krupnoća, oblik čestica stacionarne faze i način pakovanja kolone.

Pri konstantnim eksperimentalnim uslovima, tR direktno zavisi od karakteristika

analita (polarnost, rastvorljivost), pa se zbog toga može koristiti za hromatografsku
identifikaciju.

1.5. Teorijski podovi

Jedan od načina opisivanja procesa razdvajanja analita u hromatografskoj koloni je

teorija destilacije. Po ovoj teoriji hromatografska kolona je podeljena na uske horizontalne
slojeve koji se nazvaju teorijski odsečci ili podovi, po analogiji sa konceptom teorije
frakcione destilacije. Slično destilacionim procesima, hromatografski procesi se mogu
posmatrati kao niz ravnoteža koje se uspostavljaju jedna za drugom.

Kretanje analita i rastvarača posmatra se kao serija uzastopnih prenosa iz jednog

odsječka kolone u drugi, gdje se u svakom odsečku kolone uspostavlja ravnoteža raspodjele
analita između stacionarne i mobilne faze. Dio stacionarne faze u jednoj koloni koji odgovara
jednom teorijskom podu naziva se visina ekvivalentna teorijskom podu (HETP).

8
 Ovo je važna veličina, posebno u primeni hromatografske metode u praksi. Visina
ekvivalentna teorijskom podu se često označava kao H ili h, i može da se dobije deljenjem
dužine kolone (L) sa sa brojem teoretskih podova (N): H = L / N.

1.6. Primjena spektroskopskih metoda u analizi hrane

Spektroskopske tehnike koje se primjenjuju su brze, tačne i što je najbitnije jeftine, a

njima se može kontrolirati mlijeko, mliječni proizvodi, meso, mesne prerađevine i druge
namirnice. Brza bliska infracrvena spektroskopija u rutinskoj analitici i procesnoj kontroli
zamjenjuje uobičajene, skupe i zahtjevne klasične analitičke metode. Ove metode se najčešće
koriste za kvalitativnu i kvantitativnu analizu sastojaka mlijeka i mliječnih proizvoda kao i za
utvrđivanje ukupnog broja bakterija u sirovom mlijeku. Ona ima izvanrednu važnost u analizi
i istraživanju tvari.

Spektroskopske tehnike čine najvažniju skupinu tehnika u instrumentalnoj hemijskoj

analizi. Već prema principu na kojem se osnivaju i izvedbi spektroskopske se tehnike mogu
primjenjivati u laboratoriju, u industrijskom pogonu (analiza procesa), ili na terenu. Granica je
identifikacije pojedinih spektroskopskih tehnika različita i kreće se u vrlo širokom rasponu, od
nekoliko pikograma do nekoliko grama . Upotreba i primjena spektroskopskih tehnika u
prehrambenoj industriji sve više raste, a odgovore koje daju olakšavaju rješavanje problema u
proizvodnji i distribuciji hrane.

Ultraljubičasta/vidljiva (UV/Vis) spektrofotometrija je spektroskopska metoda koja

obuhvata proučavanje apsorpcije elektromagnetnog zračenja u oblasti između 200 i 800 nm.
Kako veliki broj organskih jedinjenja ne apsorbuje u ovom dijelu spektra, to UV/Vis
spektrofotometrija, u poređenju sa drugim strukturnim metodama (IC, NMR, MS), ima daleko
manju primjenu za strukturna određivanja i uglavnom se koristi kao komplementarna metoda
za identifikaciju dijelova molekula koji apsorbuju u navedenoj oblasti, takozvanih hromofora.

UV/VIS spektri dobijeni na ovaj način, pružaju veoma korisne informacije o strukturi
ispitivanog jedinjenja. Npr, ona je nezamjenljiva pomoćna (a često i glavna) metoda za
identifikaciju prirodnih konjugovanih jedinjenja, kao što su: biljni pigmenti (karotenoidi),
poliacetileni, porfirini, ukupni fenoli, flavonoidi, ukupni antocijani, monomerni antocijani,
procenat polimerne boje, ukupna antioksidativna aktivnost itd.

9
 Pored primjene za identifikaciju organskih jedinjenja, UV/Vis spektrofotometrija se
danas dosta primjenjuje u kvantitativnoj analizi. Njene prednosti nad ostalim metodama su u
izuzetno velikoj osjetljivosti i jednostavnom rukovanju instrumentom.

Infracrveno zračenje (IR) je elektromagnetsko zračenje talasnih dužina od 0.7 do 500

mm. Naziv mu potiče otuda što su energije infracrvenog zračenja manje od energija vidljivog
dijela spektra na koji se i nastavljaju. IR metoda ima mnoge prednosti jer omogućavaju brzo
mjerenje velikog broja veličina, a da se pri tome uzorak ne uništi. Također se mogu koristiti
za at-line i on-line kontrolu procesa.

Blisko infracrveno zračenje utiče na vibracije istezanja kovalentnih veza C–H, N–H i
O–H u molekuli. Od tehnika bliske infracrvene spektroskopije koriste se tehnika bliske
infracrvene refleksije (NIR) i bliske infracrvene emisije (NIT). Ove tehnike mogu se koristiti
za analizu tekućina i čvrstih materija kao što je mlijeko, sirevi i mlijeko u prahu .

Atomska apsorpciona spektrofotometrija (AAS) je apsorpciona metoda koja mjeri

smanjenje intenziteta monohromatskog zračenja pri prolasku kroz atomsku paru uzorka. Kao
izvor zračenja se koriste lampe sa šupljom katodom koje su napravljene od elementa koji se
određuje.

Uzorci se isparavaju na temperaturama od 2 000 do 6 000 K, a zatim mjeri apsorpcija

elektromagnetnog zračenja odgovarajuće talasne dužine. Zbog visoke osjetljivosti moguće je
određivati više elemenata iz otopine i u vrlo niskom koncentracijskom području.
Koncentracijsko područje je reda veličine 10-6 mg/dm3 (ili ppm). AAS se prvenstveno
upotrebljava za određivanje koncentracije metala u hrani kao što su metali u biljnom
materijalu i ekstraktima biljaka . Uzorci koji su već tekući (npr. voćni sokovi, vino) mogu se
jednostavno analizirati bez prethodne pripreme, odnosno nakon razrjeđivanja vodom ili nekim
reagensom.

Osnovni preduvjet za analizu atomskom apsorpcijskom spektrofotometrijom jest da

uzorak bude homogen i barem u polutekućem stanju. Najčešće se koncentracije određuju iz
baždarnog dijagrama dobivenog pomoću niza standardnih otopina analiziranog elementa
poznatih koncentracija. Noviji AAS opremljeni su kompijuterskim uređajem kojim se
jednostavno programiraju parametri analize i ispis rezultata mjerenja.

10
 Instrument mjeri svaki standard, odnosno uzorak, tri puta, provodi statistiku mjerenja,
konstruira baždarni dijagram i izračunava koncentraciju nepoznatog uzorka. Ispis na štampaču
obično sadrži prikaz baždarnog dijagrama s očitanim apsorbancijama za pojedine
koncentracije standarda te apsorbancije i izračunate koncentracije elemenatu u uzorku.

Važne prednosti AAS su prije svega analiza oko 65 različitih elemenata u cijelom nizu
različitih uzoraka; niske granice detekcije (mg/cm3, mg/dm3, ng/dm3) i moguća analiza
tragova metala i malih količina uzoraka; visoka preciznost i ispravnost; ako su uzorci otopine
ili fine suspenzije predobrada uzoraka je praktički suvišna te je moguća njihova izravna
analiza;. AAS je osjetljivija za određivanja npr. Ca, Mg, Cu, Fe, Zn, Pb, Hg, Cd u biološkom
materijalu. Visoka osjetljivost omogućuje analize tragova analita, analize malih količina
materijala i razrijeđivanje otopina što smanjuje interferencije.

Nuklearnu magnetsku rezonanciju (NMR) je moguće koristiti za mjerenje masti ili

topljivih sastojaka mliječnih proizvoda. Zbog osjetljivosti mjerenja na mehaničke
manipulacije strukture, ova je tehnika dala vrlo dobre rezultate kod ispitivanja mikrostrukture
gruša. Tokom cijeđenja sira praćena je količina vode u sirutki, ali i u grušu ovom tehnikom
kao informacija interakcije vode i gruša. Nuklearna magnetska rezonancija je primijenjena za
proučavanje promjena u strukturi β-laktoglobulina kad je zagrijan kod pH 2 i 7,4 jedinice pri
55 °C , ali i formiranja strukture sladoleda.

1.7. Primjena hromatografskih metoda u analizi hrane

Od hromatografskih tehnika u analizi hrane najviše se koriste hromatografija na

tankom sloju, gasna hromatografija, tečna hromatografija visokog stepena razdvajanja
(HPLC). I u ovom slučaju izuzetno su značajni postupci pripreme uzoraka hrane za
hromatografske analize hrane.

Hromatografija visoke efikasnosti je vrsta tečne hromatografije (Liquid

Chromatography, LC) koja je znatno poboljšana u pogledu selektivnosti i rezolucije
komponenata smjese. To je postignuto primjenom kolone punjene stacionarnom fazom
sastavljenom od sfernih mikro-čestica prečnika 2–5 μm, ili poroznih monolitnih materijala
koji značajno dovode do pada pritiska u koloni.

11
 HPLC koristi izabranu strukturnu osobinu supstanci i tokom analize ne mijenja
njihovu hemijsku prirodu. U zavisnosti od hemijske strukture, sastojci smjese provode
različito vrijeme u koloni jer imaju različite afinitete zadržavanja na nepokretnoj fazi. Nakon
razdvajanja konstituenata smjese slijedi njihovo određivanje preko električnog signala
primjenom odgovarajućeg detektora pri čemu se dobija hromatogram–kriva zavisnosti jačine
signala od vremena.

Površinu zavisnosti direktno određuje koncentracija jedinjenja, a fizičko-hemijske

osobine jedinjenja određuju njegov položaj na hromatogramu, vrijeme zadržavanja
(retenciono vrijeme, tR). Ovaj parametar se mjeri od trenutka kada se uzorak i standard ubace
u kolonu do njihovog izlaska iz kolone. Hromatogram daje informacije o broju komponenata
koje sadrži analizirana smjesa na osnovu broja signala, koncentracijama pojedinih sastojaka
na osnovu relevantnih površina signala (kvantitativna analiza) i jedinjenju koje je prisutno (na
osnovu retencionih vremena – kvalitativna analiza.

HPLC je metoda koja se koristi za prečišćavanje i identifikaciju antocijana koji su

najvažnija grupa vodeno rastvornih pigmenata u biljkama i obuhvataju grupu preko 500
različitih jedinjenja koji su odgovorni za boje mnogih biljaka. Antocijani se mogu razdvojiti
prema polarnosti, tako da se na hromatogramu vide na različitim retencionim vremenima.
Antocijani mogu biti kvantifikovani preko bilo kog prečišćenog standarda. Obično se kao
standard koristi cijanidin-3-glikozid, a kvantifikacija antocijana HPLC metodom se vrši na
talasnoj dužini od 520 nm.

Razdvajanje komponenata iz smjese gasnom hromatografijom (GC) zasniva se na

razlici u koeficijentima raspodjele između stacionarne tečne i mobilne gasovite faze. Gasna
hromatografija (GC) je tehnika koja se najčešće koristi u kombinaciji sa masenom
spektrometrijom (MS). Kompleksne smjese se mogu veoma lako razdvojiti gasnom
hromatografijom, a MS se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer maseni
spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinačne komponente smjese se pojavljuju na
gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vrijeme može poslužiti kao
veličina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne smije koristiti
za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja.

12
 1.8. Primjena imunohemijskih metoda u analizi hrane

Kao jedan od testova za detekciju patogena u hrani na osnovu imunoloških

karakteristika široko se primjenjuje imunoadsorpcioni enzimski test - ELISA (eng. The
enzyme-linked immunosorbant assay). Metod je tako dizajniran da zamjeni detekciju ili
izolaciju na čvrstoj podlozi, relativno je lak za izvođenje, može biti primjenjen za veći broj
patogena, može biti poluautomatski i daje brz rezultat.

U zavisnosti od potreba cilj ovog testa može biti da se detektuje rod, vrsta ili serotip
mikroorganizma. Međutim, pozitivan rezultat dobijen ELISA testom mora biti potvrđen
konvencionalnim testom. Najveća prednost ove metode je obavljanje negativnog skrininga
odnosno mogućnost uključivanja znatno većeg broja uzoraka koji mogu biti ispitani na
prisustvo ili odsustvo određenog patogena, pretpostavljajući da postoji prihvatljiv nivo lažnih
negativnih rezultata. Pozitivni rezultati dobijeni ELISA tehnikama moraju biti potvrđene
analitičkim tehnikama kao što su vodena hromatografija ili plinska hromatografija i sa
fluorescentnim, ultra ljubičastim ili koncentriranim spektrofotometričnim tehnikama
detekcije.

Korisnost ELISA-metode potvrđena je od mnogih autora u dokazivanju vrste mesa i

različitih biljnih proteina koji se često koriste kao dodatni sastojci u proizvodnji mesnih
proizvoda, za detekciju rezidua enrofloksacina u pilećem mišiću i jetri. Korištenjem
primjerenih antitijela i standarda, ELISA-metodom moguće je kvantitativno utvrditi sojine
proteine, proteine graška i gluten u toplinski obrađenim proizvodima. ELISA metoda je u
nekoliko navrata provjeravana u cilju kvalitativnog i kvantitativnog određivanja denaturiranih
sojinih proteina.

13
ZAKLJUČAK

Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz
kolonu (cijev punjena materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem tečnosti
(mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok
mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog
zadržavanja komponenata smjese.

Vrijeme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i

sastava mobilne faze. Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se
retenciono vrijeme i karakteristično je za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska
povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava
rezoluciju hromatograma.

Koriste se uobičajeni rastavarači čisti ili u bilo kojoj kombinaciji (npr. voda, metanol,
organski rastvarači...). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje.
Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumijeva promjenu sastava mobilne faze
u toku eluiranja.

14
LITERATURA

L. R. Snyder, J.J. Kirkland i J. W. Dolan, Uvod u modernu tekuću kromatografiju, John Wiley
& Sons, New York, 2009.

M. C. McMaster, HPLC, praktični vodič za korisnike, Wiley, 2007.

M.W. Dong, Moderna HPLC za praktičare. Wiley, 2006.

S. Ahuja i H. T. Rasmussen (ed), HPLC razvoj metoda za farmaceutiku, Academic Press,

2007.

Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry, Prentice Hall,
1997

15