Structural Modifications of 
Lignosulphonates  
 

Dimitri Areskogh 

 
Doctoral Thesis 

Royal Institute of Technology 

School of Chemical Science and Engineering 

Department of Fibre & Polymer Technology 

Division of Wood Chemistry and Pulp Technology 

Stockholm 2011 

 
 
 

AKADEMISK AVHANDLING 
Som med tillstånd av Kungliga Tekniska Högskolan framläggs till offentlig granskning för 
avläggande av teknologie doktorsexamen, fredagen den 13 maj 2011 kl. 10.00 i sal D3, 
Lindstedsvägen 3, KTH, Stockholm. Avhandlingen försvaras på engelska. 
 
Fakultetsopponent: Prof. Arthur J Ragauskas 
Georgia Institute of Technology, Atlanta, Georgia, USA 
 
 
© Dimitri Areskogh 
Stockholm 2011 
 
TRITA‐CHE Report 2011:26 
ISSN 1654‐1081 
ISBN 978‐91‐7415‐923‐3 

 
 








“Reading is the basics for all learning.” 

—Presidential candidate George W. Bush, 

Reston, Virginia, March 28, 2000

 
 
Abstract
Lignosulphonates are by‐products from the sulphite pulping process for the manufacture of 
specialty dissolving pulps and paper. During the liberation of the cellulose, the lignin is 
fractionated and solubilised through covalent addition of sulphonic acid groups at various 
positions in the structure. The formed sulphonated lignin, lignosulphonate is then further 
isolated and refined. 

The amphiphilic nature of lignosulphonates has enabled them to be used as additives to various 
suspensions to improve their dispersion and stability. The by far largest utilisation of 
lignosulphonates is as dispersants in concrete. Here, lignosulphonates act by dispersing cement 
particles to prevent flocculation, un‐even particle distribution and reduced strength 
development. The dispersion is achieved through steric and electrostatic repulsion of the cement 
particles by the lignosulphonate polymer. This behaviour is intimately linked with the overall 
size and amount of charged groups in the dispersing polymer. Traditional modifications of 
lignosulphonates have been limited to removal of sugars, filtration and fractionation. These 
modifications are not sufficient for utilisation of lignosulphonates in high‐strength concrete. Here 
synthetic dispersants and superplasticisers are used which are considerably more efficient even 
at low dosages. To compete with these, additional modifications of lignosulphonates are likely to 
be necessary. The molecular weight and functional group composition have been identified and 
described as the most interesting parameters that can be modified. 

Currently, no suitable method exists to increase the molecular weight of lignosulphonates. 
Oxidation by the natural radical initiating enzyme laccase is an interesting tool to achieve such 
modifications. In this thesis several aspects of the mechanism through which this enzyme reacts 
with lignin and lignosulphonate structures have been elucidated through model compound 
studies. Further studies showed that laccase alone was a highly efficient tool for increasing the 
molecular weight of commercial lignosulphonates at low dosages and in short incubation times. 
Immobilisation of the laccase to a solid support to enable re‐utilisation was also investigated.  

Modification of functional group composition of lignosulphonates was achieved through 
ozonolysis and the Fenton’s reagent, a mixture of hydrogen peroxide and iron(II)acetate. 
Introduction of charged carboxylic groups was achieved through opening of the benzyl rings of 
lignosulphonates. It was found that a two‐stage process consisting of laccase oxidation followed 
by ozonolysis was an efficient technique to create a polymer enriched with carboxylic acid 
groups with a sufficient molecular size. 

Oxidation by the Fenton’s reagent was shown to yield similar modifications as the combined 
laccase/ozonolysis treatment albeit with less pronounced results but with a large level of control 
through variation of a number of reaction parameters. The Fenton’s reagent can therefore be an 
interesting alternative to the aforementioned two‐stage treatment.  

These modifications are interesting for large‐scale applications not only because of their 
simplicity in terms of reaction parameters but also because of the ubiquity of the used enzyme 
and the chemicals in the pulp and paper industry.   

 
 
Sammanfattning
Lignosulfonater är bi‐produkter från sulfitprocessen som används för framställning av ren 
dissolvingmassa för vidare produktion av regenererad cellulosa. Under denna process löses 
ligninet upp i kokvätskan genom introduktion av sulfonsyragrupper, vilket medför att ligninet 
blir vattenlösligt och kan därför separeras från massan.  

Den amfifatiska strukturen hos lignosulfonaterna som innehåller både hydrofila och hydrofoba 
grupper har gett lignosulfonaterna unika egenskaper. Lignosulfonater används idag som 
dispergeringsmedel för olika typer av suspensioner för att förbättra deras dispersion och 
stabilitet. Det överlägset största användningsområdet av lignosulfonater är som 
dispergeringsmedel för betongtillverkning. Här används lignosulfonaterna för att dispergera 
cementpartiklarna för att ge betongen bra flyt och undvika partikelaggregation. Denna 
dispersion sker främst genom sterisk och elektrostatisk repulsion av de laddade 
cementpartiklarna. Dessa två fenomen är intimt förknippade med storleken och laddningen hos 
den dispergerande polymeren. De traditionella modifieringarna av lignosulfonater har varit 
begränsade till eliminering av socker, filtrering och fraktionering. I högstyrke‐betong ställs andra 
krav på dispersion vilket medför att man använder syntetiska dispergeringsmedel med väldigt 
specifika egenskaper vilka är avsevärt effektivare. För att konkurrera med dessa, är ytterligare 
modifieringar av lignosulfonater nödvändiga.  Molekylvikten och andelen laddade grupper har 
därför identifierats som de två mest lämpliga egenskaperna för modifiering av lignosulfonater. 

För tillfället finns det inga metoder för att öka molekylvikten hos lignosulfonater. En intressant 
metod är polymerisering genom enzymatisk oxidering med hjälp av det radikal‐initierande 
enzymet lackas. I denna avhandling har flera aspekter av reaktionsmekanismen hos detta enzym 
undersökts och kartlagts via studier med modellkomponenter. Oxidation av tekniska 
lignosulfonater visade att detta enzym är mycket kapabelt till att öka molekylvikten markant 
även vid låga doseringar. Tekniker för att tillåta återanvändning av enzymet genom 
immobilisering till en support har undersökts.  

Modifiering av mängden laddade grupper hos lignosulfonater skedde genom ozonering och 
reaktion med Fentons reagens, en blandning av väteperoxid och järn(II)acetat. Laddade 
karboxylgrupper visade sig bildas genom reaktioner där bensylgrupper i lignosulfonaterna bröts 
upp. En kombination av oxidation med lackas följt av ozonering visade sig vara en mycket 
intressant tvåstegsmodifiering vilket gav upphov till en högmolekylär polymer berikad med 
laddade karboxylgrupper. 

Oxidering med Fentons reagens visade sig ge liknande resultat som en kombinerad lackas och 
ozonbehandling med märkbart lägre effektivitet men dock med en större grad av kontroll. Detta 
reagens skulle kunna vara ett intressant alternativ till den ovan nämnda tvåstegsmodifieringen. 

Dessa modifieringar är intressanta för storskalig användning då dessa är bör vara lätta att 
implementera men också eftersom både enzymet och kemikalierna är väl bekanta för pappers‐ 
och massaindustrin.   

 
 
List of Publications
This thesis is based on the following papers: 

I. Oxidative polymerisation of models for phenolic lignin end‐groups by laccase 
Areskogh, D.; Li, J.; Nousiainen, P.; Gellerstedt, G;, Sipilä, J. and Henriksson, G. 
Holzforschung, 2009, 64, 21–34. 
 
II. Sulfonation of phenolic end groups in lignin directs laccase‐initiated reactions 
towards cross‐linking. 
Areskogh, D,; Li, J.; Nousiainen, P.; Gellerstedt, G.; Sipilä, J. and Henriksson, G. 
Industrial Biotechnology 2010, 6, 50‐59. 
 
III. Investigation of the Molecular Weight Increase of Commercial Lignosulfonates 
by Laccase Catalysis. 
Areskogh, D.; Li, J.; Gellerstedt, G. and Henriksson, G. 
  Biomacromolecules, 2010, 11, 904–910. 
 
IV. Structural modification of commercial lignosulphonates through laccase 
catalysis and ozonolysis. 
Areskogh, D.; Li, J.; Gellerstedt, G. and Henriksson, G. 
  Industrial Crops and Products 2010, 32, 458‐466. 
 
V. Immobilisation of laccase for polymerisation of commercial lignosulphonates. 
Areskogh, D. and Henriksson, G. 
  Process Biochemistry 2011, 46, 1071‐1075 
 
VI. Fenton’s reaction: a simple and versatile method to structurally modify 
commercial lignosulphonates. 
Areskogh, D. and Henriksson, G. 
  Nordic Pulp & Paper Research Journal, 2011, 26, 90‐98 
 
 

Author’s Contribution 
Paper I‐VI: Principal author. Formulated research strategies with Prof. Gunnar Henriksson.  

   

 
 
Abbreviations
In alphabetical order: 

C3A  Calcium aluminate, (CaO)3Al2O3. 

C2S  Dicalcium silicate, (CaO)2SiO2 

C3S  Tricalcium silicate, (CaO)3SiO2 

C‐S‐H  Calcium silicate tetrahydrate (CaO)3(SiO2)2∙4∙H2O   

ECF  Elemental Free Chlorine 

FT‐IR  Fourier Transform Infrared Spectroscopy 

GC/MS  Gas Chromatography/Mass Spectrometry 

Gypsum  Calcium sulphate dihydrate, CaSO2⋅2∙(H2O) 

HSQC‐NMR  Heteronuclear Single Quantum Coherence Nuclear Magnetic Resonance 

LCC  Lignin‐carbohydrate complex 

LMS  Laccase‐mediatory system 

MALDI‐TOF MS  Matrix‐Assisted Laser Desorption/Ionisation Time‐of‐Flight Mass 
Spectrometry 

Me‐  Methyl group, CH3‐ 

MeO‐  Methoxy group, CH3O‐ 

MtL  Myceliophthora thermophila laccase 

SEC  Size Exclusion Chromatography 

TCF  Totally Chlorine Free 

TvL  Trametes villosa laccase 

   

 
 
 Table of Contents
 

I  Introduction .......................................................................................................................................... 1 

I.1  Aim ................................................................................................................................................ 2 

II  Background ........................................................................................................................................... 3 

II.1  Structure and Chemistry of Lignin ........................................................................................... 3 

II.2  Lignosulphonates ........................................................................................................................ 4 

II.2.1  Production and Structural Properties ............................................................................... 4 

II.2.2  Utilisation ............................................................................................................................. 6 

II.2.3  Concrete Admixtures .......................................................................................................... 6 

II.2.4  Specialty Markets .............................................................................................................. 10 

II.2.5  Modified lignosulphonates .............................................................................................. 10 

II.3  Laccase ........................................................................................................................................ 11 

II.3.1  A Blue Multi‐Copper Oxidase ......................................................................................... 11 

II.4  Structure and Catalytic Properties .......................................................................................... 11 

II.5  Occurrence and Role in Nature ............................................................................................... 13 

II.6  The laccase‐mediator system ................................................................................................... 14 

II.7  Applications ............................................................................................................................... 15 

II.7.1  Laccase in the pulp and paper industry ......................................................................... 16 

II.7.2  Laccase in the textile industry ......................................................................................... 16 

II.7.3  Laccase in alternative applications ................................................................................. 17 

III  Experimental ....................................................................................................................................... 18 

III.1  Materials ..................................................................................................................................... 18 

III.1.1  Enzymes .............................................................................................................................. 18 

III.1.2  Lignosulphonates .............................................................................................................. 18 

IV  Results and Discussion ...................................................................................................................... 19 

IV.1  Model compound studies of the laccase reaction mechanism (Paper I & II) .................... 19 

IV.1.1  The 1‐position ..................................................................................................................... 20 

IV.1.2  The Cα position .................................................................................................................. 23 

IV.1.3  Conclusions from the model compound studies .......................................................... 25 

Laccase oxidation of lignosulphonates (Paper III) ............................................................................. 26 

IV.1.4  The influence of lignosulphonate concentration and structure .................................. 27 

 
 
 IV.1.5  The influence of the enzyme ............................................................................................ 29 

IV.2  Structural modifications of lignosulphonates through laccase oxidation and ozonolysis 
(Paper IV) ................................................................................................................................................ 31 

IV.2.1  Laccase oxidation of DP401 and DP795 ......................................................................... 31 

IV.2.2  Ozonolysis of DP401 and DP795 after laccase oxidation ............................................. 32 

IV.3  Immobilisation of TvL (Paper V) ............................................................................................. 35 

IV.3.1  Oxidation of DP851 by immobilised TvL ....................................................................... 36 

IV.3.2  Lignosulphonate adsorption ............................................................................................ 38 

IV.3.3  Deactivation of the immobilised TvL ............................................................................. 39 

IV.4  Lignosulphonate structural modification by the Fenton’s reagent (Paper VI) ................. 40 

IV.4.1  Fenton’s reagent at acidic pH .......................................................................................... 41 

IV.4.2  Which cation does what? .................................................................................................. 43 

IV.4.3  Fenton’s reagent at alkaline pH ....................................................................................... 43 

IV.4.4  The effect of lignosulphonate concentration ................................................................. 44 

IV.4.5  The effect of hydrogen peroxide concentration ............................................................ 45 

V  Conclusions and Further Perspectives ............................................................................................ 47 

VI  Acknowledgements ........................................................................................................................... 49 

VII  References ........................................................................................................................................... 50 

VIII  Errata‐list ............................................................................................................................................. 55 

 
 
I Introduction 
The industrial utilisation of cellulose for papermaking from lignocellulosic plants has in many 
ways transformed the role of lignin from a necessity in nature to a reject in the industry. Not only 
is lignin one of the most abundant biopolymers on Earth, second only to cellulose and possibly 
chitin 1, it is also a bafflingly complex plant constituent of wood. While the other major wood 
constituent, cellulose occupies a prominent place as a valued industrial product, lignin has been 
reduced to an obscure role as a low‐quality fuel or chemical. 

The reborn realisation in the pulp and paper industry that wood can be used for a variety of 
products besides paper and fuel has led to the adoption of the biorefinery concept, where the 
biomass feedstock is processed into a spectrum of products such as fuel, chemicals, materials and 
energy through sustainable processes. This concept is nothing new to the petroleum industry 
which has been producing fuels, power and chemical products from petroleum for the last two 
centuries 2.   

Ironically, the idea of maximising the utilisation of the wood feedstock was exploited already in 
1898 by Simonsen in his efforts to convert sawdust to ethanol 3. Over the decades, this knowledge 
was however forgotten, but the concept of a biorefinery experienced a rebirth some 30 years ago 
and it is emerging today as a future model of operation for the pulp and paper industry to 
expand its business into new fields. The National Renewable Energy Laboratory (NREL), a 
facility of the U.S. Department of Energy for research and development in renewable energy and 
energy efficiency, states that “to maximize the value generated from a heterogeneous feedstock, 
refineries make use of all component fractions, producing a variety of co‐products in the process 
… and also has tremendous potential to benefit society” 4. 

The role of lignin in a biorefinery is yet to be defined, but it is clear that is essential to exploit its 
value. Although the use of lignin as a replacement or complement to fossil fuels makes sense in a 
traditional paper mill, the concept of a biorefinery is likely to change this. An excellent example 
of this is the water‐soluble lignosulphonates, a by‐product from the sulphite pulping process. 
Their unique properties have led to utilisation of lignosulphonates in a variety of fields as 
additives or binders and as a precursor for further chemical processing.  

Due to the limited quality and performance, lignosulphonates have faced significant competition 
from synthetic plasticisers as concrete additives. Traditional modifications of lignosulphonates to 
improve their performance have been limited to filtration and fractionation to obtain 
lignosulphonates in more specific molecular weight ranges. Although sufficient to give moderate 
improvements in performance, the improvements are not enough to compete with their synthetic 
equivalents as concrete dispersing additives. Other modifications are likely to be necessary.   

No methods suitable for industrial integration to increase the average molecular weight of 
lignosulphonates exist to date. To achieve such an increase, it might be interesting to utilise 
biotechnical tools such as enzymes. One particular group appear promising, the natural radical‐

1 
 
initiating laccases. The recent rapid advancements in heterologous expression and production 
have solved the problem of the low availability of the enzyme for industrial applications. What 
remains to be solved is how laccases can be applied on lignosulphonates and what benefits are to 
be gained. 

I.1 Aim  

The goal of this work described in this thesis is to investigate the various modifications of 
lignosulphonates achieved by laccase and conventional bleaching chemicals. Several aspects of 
laccase oxidation of lignosulphonates are explored through studies with model compounds and 
experiments with lignosulphonates. The main targets for modification are the average molecular 
weight and functional group composition. The proposed modifications of technical 
lignosulphonates are potentially important for improving their performance as additives to 
concrete and also for expanding their industrial utilisation. 

2 
 
II Background 

II.1 Structure and Chemistry of Lignin 

Lignin is next to cellulose the most abundant biopolymer on Earth, manifesting its presence on all 
corners of the planet Earth, on land as well as sea 5. Fortification of the cell wall by lignin is 
considered to be the key innovation in the evolution of terrestrial plants from their aquatic 
ancestors nearly half a billion years ago. The heterogeneous and highly complex aromatic 
polymer loosely termed “lignin” encrusts cellulose microfibrils and other components in the cell 
wall preventing collapse and lending biomechanical support to the cell wall and allowing plants 
to overcome gravity and rise above the ground. The widespread colonisation of terrestrial eco‐
regions by plants with lignified cell walls is excellent evidence of the success of such a design. 

No exact primary chemical and structure of lignin currently exists. In a broader sense, lignin can 
be described as an aromatic polymer of methoxylated phenylpropanoid units linked to each other 
through carbon‐carbon and and ether bonds. Several models of lignins have been proposed over 
the years 6‐9. The fact that only models and no actual structural determination of lignin in situ are 
available indicates not only the complexity of lignin but also the lack of methods to extract lignin 
in its’ native form. With current techniques, only fragments can be extracted and this means that 
the current knowledge of lignin can be considered at best fragmental. Attempts at obtaining the 
full picture of the structure of lignin have so far yielded only a determination of spruce secondary 
wall with Raman spectroscopy 8. The lignin polymer is optically inactive 10 although it contains 
several chiral centres and is generally considered to be branched to facilitate cross‐linking to 
other cell wall components to form lignin‐carbohydrate complexes (LCCs)11,12. The LCCs serve as 
anchoring points where the carbohydrates and lignin are covalently bonded to each other and are 
important for the unique physical properties that wood exhibits as a natural composite material. 

The lignin polymer is synthesized by the polymerisation mainly of three different cinnamyl 
alcohols; p‐coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohol. These lignin monomers, monolignols, are 
produced within the wood cell and exported to the cell wall where they are polymerised. The 
monolignols are the product of the phenylpropanoid pathway starting from the amino acid 
phenylalanine. The end product of the monolignol polymerisation is the lignin polymer (Scheme 
1). The hydroxylation and methylation reactions in the  phenylpropanoid pathway ultimately 
determine which monolignols is formed because the three lignols differ only in the number of 
methoxyl groups. 

3 
 
 Lignin
HO O
HO

OH

Lignin OH
OH OMe
O
MeO O
OH O
HO
CH3
p-coumaryl alcohol
HO HO
O OH O O

OH O
H2N
OH

OMe MeO OMe

phenylalanine OH O O

coniferyl alcohol OH

HO MeO OH
MeO
O OH O OMe
HO
HO OH
HO
MeO OMe OH
OH MeO O OH
OMe
sinapyl alcohol HO  

Scheme 1: Phenylpropanoid pathway for lignin biosynthesis in vascular plants. 
 

II.2 Lignosulphonates  

II.2.1 Production and Structural Properties 

Lignosulphonates are by‐products of the sulphite pulping process for the manufacture of 
specialty dissolving pulps and paper. The wood chips are digested with acidic calcium bisulphite 
for 6‐10 hours at 100‐130 °C in a batch‐wise cooking process. During this process, the native 
lignin is broken down through the degradation of the randomly distributed ether bonds 
throughout the structure 13. The fragments are solubilised in the cooking liquor through covalent 
addition of sulphonic acid groups at various positions in the lignin structure (Figure 1).  The 
sulphonic acid groups are stabilised by the presence of calcium ions. 

After the competition of the cooking stage, the insoluble cellulose is separated from the 
solubilised lignin by filtration. Further processing of the cooking liquor involves precipitation of 
the sulphonated lignin through the addition of excess calcium hydroxide (Howard process), the 
evaporation of water and residual sulphite (in the form of sulphur dioxide) and dilution with 
fresh water followed by ultrafiltration to remove low‐molecular‐weight fractions and sugar 
monomers. The purified calcium lignosulphonate is pH‐adjusted to a specific pH and evaporated 
to a dry matter content suitable for spray drying and packaging (Scheme 2). 
Ca(OH)2

Precipitation
Spent cooking liquor pH adjustment Evaporation Dilution
(Howard process)

Spray drying Evaporation pH adjustment Ultrafiltration

 

Scheme 2: Simplified flow chart of lignosulphonate production from spent cooking liquor from the sulphite 
process. 

4 
 
The co‐existence of the hydrophilic sulphite groups and hydrophobic aromatic structures provide 
lignosulphonates with unique amphiphilic properties. The overall structure of a lignosulphonate 
is not known. Several models have been proposed over the years suggesting that lignosulphonate 
behaves as a coiled or expanded polyelectrolyte at either high or low concentration 14. These 
polyelectrolytes are likely to associate in solution and the high‐molecular weight fractions are 
more branched than the low‐molecular weight ones.  
LS
LS OMe
2+ O 2+
Ca Ca
OH -
- O S O
O
O OH
S HO LS +
Ca
O O
S OH
O OMe
O HO O

MeO OH OMe O S O
O
-
O 2+
Ca MeO OMe
O
- 2+
O S O HO Ca
O LS - LS
O
MeO
2+ OH
O Ca OMe HO S
-
O O
HO O HO O OH
HO O S O O

OH
O OMe
OMe MeO -
OH O S O O S O
OH OH - 2+
O O Ca LS
2+
MeO Ca  

Figure 1: Tentative calcium lignosulphonate structure. The sulphonic acid groups are stabilised by calcium 
ions. Residual lignosulphonate chains are denoted as LS. 
 
This model has been expanded to describe lignosulphonates as  micelle‐type microgels 15 with a 
non‐charged core consisting of  cross‐linked aromatic chains with all the charged groups 
relocated to or near the surface to facilitate interactions with the aqueous surroundings (Figure 
2A) . These particles are likely to exist in solution as irregularly shaped in a wide range of sizes 15.  

This model has been further elaborated  and supported with high‐resolution microscopic 
imagery 16‐19. An expansion of this model was proposed following the discovery of a monolayer 
formation of various lignins when spread on a liquid surface 20 and the sandwich‐like 
arrangement of lignins in the secondary cell wall of wood cells 21. The earlier model of a spherical 
micelle was revised to a flat disc‐like molecule to better conform to these findings 22. No efforts to 
relate this new structure to the well‐known behaviour of lignosulphonates in solution have been 
made to date. Additional studies of lignosulphonates under electric fields displayed a 
conformational change from a compact sphere to a non‐free unwinding coil 23.  

A recent investigation suggests that lignosulphonates are randomly branched cross‐linked 
polyelectrolytes 24 (Figure 2B). According to this suggestion, lignosulphonates consist of a long 
continuous chain acting as a backbone with short side chains. The side chains are possibly further 
branched and may be reconnected to the backbone forming closed loops 24. The breaking of ether 
bonds that occurs during the cooking stage due to acidic hydrolysis and the subsequent 

5 
 
introduction of sulphonate groups to the structure is assumed to occur at positions that form the
short side chains.

A) B) C)

Figure 2: Proposed lignosulphonate structural models as globular micellar-type microgels 15 (A), randomly
branched polyelectrolytes 24 (B) and ellipsoidal flat particles 25 (C).

It is therefore assumed that the longer backbone is more hydrophobic while side-chains are
hydrophilic due to the presence of covalently linked sulphonate groups. This model was based
on scaling analysis that showed how the intrinsic viscosity changed with molecular weight,
something which is not valid for the microgel model where the gel increases in size but more or
less keeps its overall shape with no change in intrinsic viscosity. A randomly branched
polyelectrolyte will change from a spherical to an elongated shape as the molecular weight is
increases with subsequent changes in intrinsic viscosity. Recent small angle X-ray scattering and
rheological studies of lignosulphonates in aqueous solutions have shown that low-molecular-
weight lignosulphonates form ellipsoidal compact and flat particles 25 (Figure 2C).

II.2.2 Utilisation

The annual global production of lignosulphonates amounted to 1.8 million metric tonnes in 2005
, but this accounts for less than 2% of all the lignin produced in the pulp and paper industry.
26

The by far largest utilisation of lignosulphonates worldwide which accounts for as much as 90%
of the worldwide production is as concrete admixtures 27 and for energy production during the
pulping process 28.

II.2.3 Concrete Admixtures

Chemical admixtures have been used in concrete formation throughout the history of
construction. As early as several hundred years B.C., Roman masons added blood and eggs to
cement and water pastes to improve their mixing 29. The modern cement formula, Portland
cement, was formulated during the mid-1800’s.

6
Despite the use of cement since the industrial revolution in the early 1800’s, the mechanism of the 
cement setting when mixed with water is still only partially understood. This process involves a 
series of complicated hydration and crystallisation reactions where the cement particles are 
interlocked and form a strong water‐insoluble binder.  

The actual benefits of admixtures in concrete in modern times were unintentionally discovered in 
the United States after the Second World War in two separate events. One event tells of a leaking 
bearing that released heavy oil into a grinding mill where concrete was produced. This resulted 
in the discovery of air‐entraining compounds 29. The second event tells of an employee at the 
Department of Transportation who had the idea of colouring the concrete in the black central 
lane of a three‐lane‐highway so that the drivers would notice when they were switching lanes. 
The Department of Transportation contractor chose, after a recommendation by a sub‐contractor, 
to use a lignosulphonate‐based dispersant to improve dispersion of the Carbon Black, the 
colouring agent used to obtain the distinct black colour. After several years it was observed that 
the state of the central lane on this particular three‐way highway was significantly better than 
that of the two outer lanes 30. Microscopic studies of the concrete revealed evenly distributed air‐
bubbles throughout the concrete which provided the concrete with greatly improved durability 
against freezing and thawing. Further studies revealed that lignosulphonates also reduced the 
tendency of the cement particles to flocculate without any further addition of water.  

The most important components of Portland cement are calcium silicates C2S and C3S and 
calcium aluminates C3A. They comprise over 80% of the total content of Portland cement and are 
essential for the strength development in the formed concrete. Both silicates react with water 
during the hydration process to form calcium hydroxide and calcium silicate hydrate gel, C‐S‐H. 
These three components play an instrumental role during the initial steps of Portland cement 
hydration further setting and strength development. This process can be broken down to five 
steps 31: 

1. Initial mixing (0‐10 min). The cement particles enter into solution and hydration reactions 
with C2S, C3S, C3A and water start, as a result of which C‐S‐H is formed: 

C2S: 2 (CaO)2(SiO2) + 5 H2O → (CaO)3(SiO2)2 · 4 H2O + Ca(OH)2

C3S: 2 (CaO)3(SiO2) + 7 H2O → (CaO)3(SiO2)2 · 4 H2O + 3 Ca(OH)2

C3A: 2 (CaO)3(Al2O3) + 21 H2O → (CaO)4(Al2O3) · 13 H2O + Ca(O)2(Al2O3) · 8 H2O

 

If the rapid C3A hydration reactions are allowed to proceed unhindered, setting occurs 
too quickly and the formed concrete is not able to develop strength. Therefore, gypsum is 
added to the Portland cement composition to slow down the C3A hydration. 

2. Dormant period (10 min – 3 h). The hydration reactions are significantly slowed down. 
Flocculation of unhydrated silicates occurs at this stage. 
3. Initial setting (3h – 9h). The hydration reactions are rapidly started again as silicates start 
to precipitate. 

7 
 
 4. Hardening. (9h – 15h) Most of the hydrate gel formation occurs in this highly exothermic 
stage which in turn accelerates further hydration reactions. 
5. Slowdown (15h – 2 days). The hydration proceeds more slowly due to the extensive 
covering of the cement particles by the hydrate gel which hinders water from 
penetratating the calcium hydrate silica gel to reach unhydrated parts of the particles. 
When the water can no longer reach unhydrated areas or when it is consumed, the 
hydration stops.  

Water plays a crucial role in concrete preparation; it provides the cement mixture with certain 
rheological properties and takes part in hydration. Cement particles with their surface charges 
are highly prone to flocculation when in contact with a polar solvent such as water. Flocculation 
is detrimental not only for the uniformity of the cement mixture but also for the hydration 
process which begins as soon as the mixture comes into contact with water. The formation of 
flocculation aggregates entraps certain amounts of water which become unavailable to lubricate 
and ensure a flowability of the mixture. To achieve a certain workability of the concrete mixture, 
more water must be added than is necessary to achieve full hydration of the cement particles 31.  
When the excess water that does not participate in the hydration evaporates, porous cavities are 
formed within the paste and these lead to weakening of the mechanical properties and durability 
of the concrete. The addition of plasticisers and water‐reducing agents is therefore crucial.  

Approximately 50% of the lignosulphonates produced worldwide are used as concrete 
admixtures. Here lignosulphonates serve several purposes; they achieve workability of the 
concrete mixture through dispersion of concrete particles, they reduce amount of water necessary 
to achieve a certain workability of the mixture to improve the strength of the set concrete and 
they accelerate or retard the setting and they entrain air in the concrete. 

Lignosulphonates actively participate in the hydration of the cement minerals in Portland cement 
by irreversible adsorption to and incorporation into the calcium silicate hydrate gels 32,33. The 
adsorption retards the C2S, C3S and C3A hydration 34. The initial setting phase can thus be 
significantly prolonged. Retardation of the C3S and C3S hydration is very pronounced even at 
low lignosulphonate concentrations. C3A hydration is highly important as this process is rapid 
and it significantly affects the early hydration and setting of the cement. In the final stage of 
hydration, lignosulphonates are incorporated into the structure of the calcium silicate hydrate gel 
and are thus removed from the solution 34. 

As a consequence of the lignosulphonate adsorption to the cement particle surfaces, steric and 
electrostatic repulsion between the individual particles occurs. Steric repulsion prevents particle 
flocculation by forcing the particles apart. The electrostatic repulsion is being achieved through 
presence of charged groups in the lignosulphonate structure (Figure 3). This mode of action of 
dispersants was first described by Uchikawa et al. 35 and has been generally accepted.  

Using lignosulphonates, concrete with a compressive strength of 40‐50 MPa can be produced 36. 
With the rapidly increasing demands of high‐strength concrete with a compressive strength of 
100 MPa and above (during the construction of The Petronas Towers in Kuala Lumpur 120 MPa 

8 
 
silica fume concrete was used 37), lignosulphonates are being displaced by expensive synthetic
dispersants and water-reducing agents which achieve significantly greater water reduction and
compression strength while maintaining low levels of air entrainment and high workability of the
concrete.

The entrainment of air and excessive retardation are two problems limiting the increase of dosage
lignosulphonate in a cement mixture. Current-generation lignosulphonates differ significantly in
their purity and sugar content to minimise the unwanted reactions in concrete and to allow for
further water reduction 38.

Entrapped
water

Figure 3: Cement particle flocculation and entrapment of water within the floc. Steric and electrostatic
repulsion of the particles is achieved through rearrangement of the charged additive in relation to the cement
particle surface charges. The individual cement particles are pushed apart and the integrity of the floc is
compromised resulting in liberation of the entrapped water.

The synthetic equivalents, the so-called superplasticisers, are based mainly on two groups of non-
renewable petrochemicals. Some examples of the most utilised superplasticisers are
polymelamine formaldehyde sulphite (PMS), β-naphthalene sulphonic acid formaldehyde (BNS)
and methacrylic acid–methacrylate ω-methoxypolyethylenglycol 39 (Figure 4).
SO3H
CH3 CH3
H 3C NH N NH O
H3C H CH3
CH3
H3C
a b c
n n CH3
N N
COOH
O O
n
HN

HO 3S
SO3H
O
1 2 H 3C

Figure
formaldehyde and (3) methacrylic acid–methacrylate ω-methoxypolyethylenglycol superplasticisers. The ratio
of monomeric composition of (3) is indicated by a, b and c.

The high efficiency of superplasticisers is attributed to the large amount of charged groups, up to
0.4 per available position, 31 and their tailored molecular weight, which increases the repulsive
forces by ensuring that there is a constant surplus of charged groups present on the
superplasticiser molecule, despite the number of active sites on the cement particle 40-42. Synthetic
superplasticisers allow a water reduction of up to 40% and are far superior to lignosulphonates,
which allow only a 15% reduction 43. The difference in efficacy between superplasticisers and

9
lignosulphonates, new standards and a constant production of new‐generation superplasticisers 
has resulted in a decrease in the use of lignosulphonates 44. 

The ability of lignosulphonates to function as plasticisers, dispersing agents or surfactants is 
intimately linked with their molecular weight of the lignosulphonate and the presence of charged 
groups within the macromolecule. An increase in molecular weight and purity of the 
lignosulphonate enhances the plasticising effect as well as reducing the viscosity of the concrete 
45 . High molecular weight lignosulphonates are highly efficient in this sense, even at very low 
dosages. These lignosulphonates could be a potential plasticising admixture for self‐compacting 
concrete 45, a form of concrete that does not require vibration for placing and compaction, but is 
able to flow under its own weight, completely filling formworks and achieving full compaction 46. 

II.2.4 Specialty Markets 

The use of lignosulphonates as a precursor for the production of chemicals has had only limited 
success. The conversion of lignosulphonates to vanillin is presently still the most successful 
process of  this kind, despite the fact that it was discovered as early as 1874 47. This process was a 
prerequisite for introducing vanillin as a bulk ingredient in the food industry but, in comparison 
with the amount of lignosulphonates produced by the pulping industry and considering the 
global demand for vanilla, the production of vanillin from lignosulphonates accounts for a far too 
small market to be able to absorb the vast amount of produced lignosulphonates 48. The current 
synthetic production of vanillin from guaiacol is more than sufficient to saturate the existing 
markets. 

The dispersing and binding properties of lignosulphonates have been explored in various fields 
such as animal food pellet formation, gypsum board production, pigment dispersion, complexing 
agents, sludge containers, scale‐inhibitors in wastewater treatment, emulsion stabilisers in oil 
drilling muds and expanders in lead acid batteries 27. 

II.2.5 Modified lignosulphonates 

The modification of lignosulphonates has traditionally been limited to the purification, 
ultrafiltration and sugar removal performed during the production. The structural similarities to 
conventional lignins extracted during Kraft pulping clearly suggest that the traditional bleaching 
chemicals used in a modern pulp mill can be employed to achieve various modifications in terms 
of molecular size and functional group composition. The toolbox of bleaching chemicals and the 
understanding of their mechanisms on lignin structures is extensive and relatively well 
understood, and this permits specific modifications should they be employed on 
lignosulphonates. Significantly fewer enzymatic tools are available for lignin modification due to 
the nature of the lignin itself. The most promising is the oxidoreductive radical‐initiating enzyme 
laccase. 

10 
 
II.3 Laccase  

II.3.1 A Blue Multi‐Copper Oxidase 

The laccase belongs to the group of oxidoreductases, the first class of enzymes in the enzyme 
classification system (E.C. 1). Strictly defined, oxidoreductases are capable of performing electron 
transfer from a donor to an acceptor. Further classification of oxidoreductases divides this class 
into sub‐groups based on the donor and the acceptor. Laccase is found in the group of 
oxidoreductases active on diphenols and similar substrates (E.C. 1.10), utilising oxygen as 
electron acceptor (E.C. 1.10.3). The members of the oxidoreductases share one unique feature; 
they all belong to the group of multi‐copper oxidases with several centres where copper atoms 
are stabilised 49. 

Copper is one of the most widespread transition metals in nature. The rich abundance in nature 
is intimately linked to its oxidation/reduction potential and the key role which 
oxidation/reduction reactions play in nature. Due to the high toxicity, even at a very low 
concentration, elaborate stabilisation of copper is required for it to reside in living organisms.  It 
is the presence of copper and the interplay between the Cu(I) and Cu(II) oxidation states that 
allows the organisms in which it resides to perform complicated oxidation and reduction 
reactions.  

Multi‐copper oxidases contain two mono‐nuclear centres (type‐1 and ‐2, containing one copper 
ion) and one di‐nuclear centre (type‐3, containing two copper ions), each having unique 
spectroscopic features. The type‐1 centre shows high absorption in the visible region (giving the 
enzyme a distinct blue colour when in solution), type‐2 centre has undetectable absorption and 
the type‐3 centre with its pair of copper ions coordinated anti‐ferromagnetically shows strong 
absorption in the near‐ultraviolet region 50.  

Multi‐copper oxidases are found in all three life domains, prokaryotes, eukaryotes and archae. In 
plants and fungi, they are involved in lignin formation and degradation and in yeast and 
mammals with iron metabolism 51.  

II.4 Structure and Catalytic Properties 

The majority of fungal laccases are monomeric, dimeric or tetrameric glycosylated protein 
complexes. Glycosylation is believed to play an important role during its secretion, susceptibility 
towards degradation and thermal stability 52. Besides glycosylation, laccases contain covalently 
linked carbohydrate units (ranging from 10‐45% of the total molecular mass) which are assumed 
to contribute to the conformational stability  by protecting them from proteolysis and 
deactivation by radicals 53,54. The overall molecular weight of laccases varies from 50 to 100 kDa.   

Several three‐dimensional crystal structures of different fungal laccases have been determined 55‐
60 . They all show a striking structural homology but with some minor differences in loop 
organisation and in the appearance of the substrate‐binding pocket. The overall three‐

11 
 
dimensional structure of a laccase consists of three consecutively connected cupredoxin-like
domains twisted in a tight globule (Figure 5A). The copper ion binding site T1 is located in the
third domain and the T2/T3 site is located between the first and third domains (Figure 5B). This
site contains amino acid ligands from both domains 61. Structural sequence comparison of more
than 100 laccases identified four conservative regions which are specific to all laccases containing
a cysteine and ten histidine residues 62 (Figure 5C). Together they form a compartment in which
copper ions are located.

Multiple isoforms of the same laccase are known to be secreted by several white-rot fungi 63,64 .
These can differ significantly in stability, optimal pH and temperature and substrate affinity.
They are encoded by gene families and can be either constitutively expressed or induced by
external factors 65,66.

Laccases have been shown to have remarkably low substrate specificity and large differences in
range of oxidised substrates can be found in different laccases. These enzymes are all capable of
oxidising of wide array of organic and inorganic substrates, including polyphenols, various
substituted phenols and aromatic amines.
His 395 H
A) B) C) N H
N

T1 Cu N N

T1 Cu
Cys 453 His 458
SH
His 454
His 452 NH

N H N
His 109
N H
His 400
O N
T2 Cu T3 Cu
N H NH

T2 Cu T3 Cu
N
H
N N His 66
T4 Cu
His 111
NH
N
H
T4 Cu His 398
N N

His 64 NH
N
H

Figure 5: (A) Ribbon diagram of Trametes hirsuta laccase determined by X-ray chrystallography at 1.8 Å
resolution 61 with the three-domain organisation and copper ions clearly distinguishable. (B) The active site
consisting of four copper ion sites (T1 through T4) is located between the domains. (C) The four copper ions
are stabilised almost excusively by adjacent histidine residues.

The active site of laccases consists of three copper ion sites designated type-1, -2 and 3 (T1
through T3). The type 2 and 3 sites forms a type 2/3 (T2/T3) cluster. The four copper ions located
in these sites are consequently designated Cu T1 through Cu T4. A two-site ping-pong bi-bi
reaction mechanism for laccase has been proposed 67. The reaction begins with the oxidation of
substrate by the Cu T1 which accepts one electron from the substrate and transfers it to the T2/T3
cluster where dioxygen binds. Upon binding to the T2/T3 cluster, dioxygen accepts the electrons
from T1 and is reduced to two molecules of water. This reduction requires four electrons which
mean that four one-electron transfers have to be made from the T1 site (Figure 6). The
extraordinary ability of laccase to reduce oxygen to water without the formation of radicals or
anions is unusual in biological systems.

12
 T1 Cu(II)
Lignin OH

4x T2 Cu(II) T3 Cu(II) H2O

OMe
OH T4 Cu (II)

T1 Cu(I)

Lignin OH

T2 Cu(I) T3 Cu(I) O2
4x
OMe T4 Cu (I)
O  

Figure 6: Schematic representation of the laccase reaction mechanism. In order to complete the full reduction 
of one molecule of dioxygen to water, four substrate molecules are oxidised. 
 
The key to laccase activity is the redox potential of the T1, T2/T3 copper sites. The potential of T1 
site has been determined for a large number of laccases to be within 400‐800 mV 68. The potentials 
for T2 and T3 sites are less investigated and are so far known only for plant laccase from Rhus 
vernicifera (390 mV and 460 mV for T2 and T3 respectively) and fungal laccase from Trametes 
hirsuta (400 mV for T2) 69,70. Based on the potential of the T1 site, laccases are divided into low‐, 
medium‐ and high‐redox potential enzymes. 

II.5 Occurrence and Role in Nature 

The first known isolation of laccase was performed by Yoshida in 1883 from the sap of the 
lacquer tree Rhus vernicifera 71. He was able to isolate a thermolabile compound with what he 
referred to as diastatic properties which consumed oxygen when it was mixed with urushiol.  He 
drew the conclusion that this diastase‐like compound was responsible for the lacquer drying 
process that occurs naturally. More than a decade later, the name “laccase” was coined by 
Bertrand who isolated and purified this compound from the sap of the lacquer tree 72 and also for 
the first time demonstrated their presence in fungi 73 . He also introduced the concept of 
metalloenzymes by erroneously claiming that this newly discovered laccase contained 
manganese, a conclusion he drew from the large abundance of manganese in the sap itself. It was 
however later shown that laccase in fact contained copper 74,75. 

Laccases are widely distributed among terrestrial life forms such as plants and fungi. While their 
role in fungi has been extensively studied and is still a topic under discussion, laccases in plants 
have been less studied. It is well known that in lacquer trees grown in Eastern Asia laccase is 
involved in various defence mechanisms as a response to physical injury to the bark of the tree. A 
white sap (lacquer) is excreted which is oxidised when in contact with oxygen with the 
subsequent polymerisation of the phenols in the sap so that a highly resistant protective structure 
is formed. Laccase has been isolated not only from trees such as sycamore and loblolly pine 76 but 
also from a variety of vegetables and fruits 77 and green shoots of tea 78.  

13 
 
In the fungi kingdom, laccases are present in all seven phylums. The enzyme has been attributed 
a role in a variety of cellular processes including delignification, sporulation, plant pathogenesis, 
pigment production and fruit‐body ripening 79. The most widely studied laccases originate from 
the white‐rot basidiomycetes which are highly efficient lignin degraders.  It is due to their 
abundant presence in the white‐rot fungi that laccases traditionally have been regarded as an 
important participant in the lignin‐degradation process.  Numerous studies of wood decay have 
identified other enzymes that participate in the delignification process. Among these are lignin 
peroxidases and manganese peroxidases, responsible for oxidation of both phenolic and non‐
penolic units, glucose oxidase and glyoxal oxidases for H2O2 production and cellobiose‐quinone 
oxidoreductase for quinine reduction and hydroxyl radical generation 80. It has been 
demonstrated that there is no unique mechanism for lignin degradation and that the setup of the 
required enzymatic tools differs greatly between various microorganisms.  

Laccases have also been associated with lignin biosynthesis participating as an oxidant of 
monolignols, a role traditionally reserved solely for peroxidases81‐83. This theory was first 
proposed by Freudenberg et al. 83 who saw that laccase was able to oxidise lignin monomers to 
form dimers of similar structure to those produced through the chemical degradation of lignins. 
Their theory was abandoned when no successful detection of laccases in plant tissues was 
achieved.  Later investigations were however able to reignite this discussion when it was 
demonstrated that laccase alone could polymerise monolignins in the complete absence of 
peroxidases 84. It was also suggested that laccases were involved in the very early stage of lignin 
biosynthesis and that peroxidases were involved at later stages 84. The investigation of lignin 
biosynthesis (extensively reviewed by Lewis et al. 85) has provided indirect evidence of the 
involvement of a variety of peroxidases, laccases and other oxidases, suggesting that such a 
complex reaction as lignin biosynthesis cannot simply involve one specific group of oxidases. 
This question remains open and is still being widely discussed. Although many enzymes are able 
to oxidise monolignols in vitro, no unequivocal proof of the involvement of any specific group of 
oxidases in lignin biosynthesis in vivo has been presented through loss‐of‐fuction experiments in 
transgenic trees 86.   

Laccases active on lignin have been reported to be mostly extracellular, although the occurrence 
of intracellular laccases in white‐rot fungi has been demonstrated 87,88. Froehler and Ericsson also 
proposed a role for the intracellular as a precursor to the extracellular laccase with little or no 
difference between them other than their location in the cell 87.  

II.6 The laccase‐mediator system 

The heterogeneity and complexity of lignin together with the low redox potential of laccases 
allow them, in contrast to other lignolytic enzymes, to oxidise only those phenolic units in lignin  
which have an ionisation potential within the range of the T1 site 89,90. To explain how laccase is 
still able to be active on such a complex polymer, the laccase mediator theory was developed. 
Earlier it was believed that laccase was involved only in lignin degradation by oxidising phenolic 
end groups in lignin to phenoxy radicals with subsequent linkage breakage. In later experiments, 

14 
 
the presence of low‐molecular‐weight co‐substrates, the degradation of non‐phenolic structures 
was observed 63. The term mediator was soon coined to describe the role of these co‐substrates. 
Their significantly higher oxidation potential (>900 mV) was shown to be essential for expanding 
the activity of laccase on non‐phenolic substrates. Since the first experiment where ABTS, 
diammonium salt of 2,2ʹ‐azinebis(3‐ethylbenzothiazoline‐6‐sulfonic acid) was demonstrated to 
enhance the enzymatic ability of laccase 63, the number of compounds that can be converted by 
laccase has increased significantly. Over the years, a large number of synthetic and naturally 
occurring mediators have been proposed and successfully tried with laccase. Consequently, the 
role of laccase in nature has also been expanded or revised 63,91. 

A laccase mediator participates in a cyclic reaction with laccase (Figure 7) where a high‐potential 
mediator intermediate is formed through laccase oxidation. This intermediate participates in non‐
enzymatic reactions with other substrates not accessible to or oxidisable by laccase alone. Upon 
oxidising the substrate, the mediator returns to its reduced state, thus closing the cycle 92. This 
cycle should, ideally, be repeated a number of times before the mediator is degraded. It should be 
noted that the chemistry by which laccase reacts with the mediator is significantly different to the 
mediator‐substrate chemistry. The misconception that the redox potential of the laccase increases 
when a mediator is used is thus not valid 93. 

O2 Laccase Mediatorox Substrate

H2O Laccaseox Mediator Substrateox

 

Figure 7: The laccase mediator cycle as first proposed by  Bourbonnais 63. 
 
In‐depth studies of a number of mediators such as ABTS 94,95 various N‐O‐ and N‐OH‐containing 
mediators such as HBT (1‐hydroxybenzotriazole), violuric acid, N‐hydroxyacetanilide and 
various polyoxymetals (such as [SiW11V1O40]5–)92,96‐98 show that no compounds currently fit the 
criteria of an ideal mediator. All the proposed compounds either exhibit low stability during the 
enzymatic activation or show no or very low ability to regenerate and thus participate in a series 
of cycles. Despite the recent findings that a few compounds are actually able to participate in a 
substantial amount of cycles 99,100 it appears that a true laccase redox mediator is yet to be 
discovered.  

II.7 Applications 

The potential of laccase as an industrial biocatalyst appears to be significant. Laccase is one of the 
few oxidoreductive enzymes that do not require expensive co‐factors other than dioxygen and 
recent developments in heterologous expression have enabled the large‐scale production of the 
enzyme. Consequently, the enzyme has found its way into a number of industrial processes 
including paper processing, the prevention of wine decolouration, bioremediation and textile dye 
oxidation. Extensive research into the laccase‐mediator system has resulted in a massive effort to 
find technical and industrial applications for such systems.  

15 
 
II.7.1 Laccase in the pulp and paper industry 

Lignocellulose is a natural substrate for laccase and, provided that mediators are used, laccases 
have the potential for breaking non‐phenolic units in lignin without disrupting the integrity of 
the cellulose which is closely linked to lignin in native wood 11. This is particularly interesting in 
the pulp and paper industry. The enormous global production volumes of this industry means 
that even a minor improvement achieved by a LMS process step would have huge implications. 
The current industrial preparation of pulp and paper, the Kraft and sulphite processes relies on 
the separation and degradation of lignin from cellulose through cooking and bleaching with 
conventional chemicals. While the recovery and reuse of the chemicals in the cooking stage is 
practised, the negative environmental impact of the bleaching stage is well documented. 
Although recent developments have yielded significantly less detrimental processes with the 
abolition of elemental chlorine in the early 1990’s and the development of the ECF and TCF 
bleaching processes there appears still to be a need to develop new methods based on laccase.   

Extensive studies have been performed to develop and evaluate LMS for Kraft pulp bleaching 101‐
103 . The results appear promising and they have already found practical application in the 
Lignozym© process 104. The use of LMS with flax pulps has also been explored with successful 
results 105,  displaying the versatility of these systems.  

There is however one major obstacle for the successful implementation of LMS in a modern 
paper mill; the mediator. There is, to date, no readily available and cheap mediator that performs 
several oxidation cycles. In addition, large quantities of mediator are required to achieve a 
bleaching performance comparable to that of conventional chemical processes. For instance, the 
Lignozym© process 104  requires a mediator amount of up to 2% of the dry weight of the pulp. In 
a normal Kraft mill producing 1 000 ‐ 3 000 tonnes of pulp per day, a daily mediator consumption 
of 60 tonnes is required. Considering the significant cost of the enzyme and the mediator as well 
as the minimal environmental footprint of a modern pulp mill, the incentive to replace 
conventional bleaching chemicals with a LMS process step is low. Despite more than two decades 
of research and development of a LMS bleaching stage there has as yet been no commercial 
adaptation of this process on an industrial scale. 

The ability of laccase to form reactive radical species on lignin end groups can also be utilised for 
fibre modification. It has been successfully demonstrated that laccase facilitates adhesion of fibres 
during the manufacturing of wood composite materials such as fibreboards 106,107. 
Functionalisation of lignocellulotic fibres by grafting various phenolic acid derivatives onto Kraft 
pulp fibres is an another possibility use for laccase 108,109.  Although promising, these are areas of 
laccase utilisation that have not yet reached industrial levels.  

II.7.2 Laccase in the textile industry 

The textile industry consumes large volumes of water and chemicals for textile processing. Each 
year, more than 700 000 tonnes of dyestuff are produced 110 which are resistant to a variety of 
chemicals making them difficult to decolourise and detoxify. Current ways of treating dye waste 

16 
 
water are ineffective and expensive 111 making them an ideal target for processes based on laccase 
oxidation which have been demonstrated to be very capable of degrading dyes of various 
structures 112,113. Utilisation of laccase in the textile industry is an expanding field and covers not 
only effluent treatment but also textile bleaching and dye synthesis 114. In 1996, Novozymes 
(Bægsverd, Denmark) launched the first laccase preparation to be used in the fabric industry 
under the name DeniLite®. This preparation utilises a redox mediator (phenothiazine‐
propionate). The product was followed by the laccase‐mediator formulation under the trade 
name Zylite® (Zytex Pvt. Ltd., Mumbai, India). Both formulations are used for the removal of 
indigo from denim jeans clothing.  

II.7.3 Laccase in alternative applications 

In addition to the previously discussed industrial applications, laccase is of interest in a variety of 
fields and applications. In the food industry, laccase can be used for drink clarification and as 
biosensor for the monitoring of phenol formation 115. In the baking industry, laccase is interesting 
for its ability to cross‐link biopolymers in various doughs 116. Other highly interesting 
applications of laccases are in nanobiotechnology for electroimmunoassay sensors 117, organic 
synthesis 118 , biofuel production 117 and keratinous fibre dying 119. 

17 
 
III Experimental
Detailed description of the materials, methods and analytical apparatus is given in the related
papers.

III.1 Materials

III.1.1 Enzymes

Two laccases provided by Novozymes (Bagsværd, Denmark) were used in all the experiments.
The laccases, denoted as NS51002 and NS51003, originated from Trametes villosa (TvL) and
Myceliophthora thermophila (MtL) respectively. The two enzymes had different temperature and
pH optima as well as redox potentials E0 (50°C, pH 5, E0 780 mV for TvL, 40°C, pH 7.5, E0 480 mV
for MtL.

III.1.2 Lignosulphonates

Four lignosulphonate salts supplied by Borregaard LignoTech (Sarpsborg, Norway) were used in
all the experiments. The salts were characterised by the supplier by standard methods (Table 1).
The lignosulphonates were used without further purification.

Table 1: Characteristics of the lignosulfonate salts used in laccase oxidation experiments described in Papers
III-VI.

Phenolic content Organic sulphur

Salt Raw Material Process Counter-ion Mw(Da)
(%) (%)

2+
DP398 Softwood Filtered Ca 28 400 1.9 5.7

Ultrafiltered +
DP399 Softwood Na 46 500 2.1 6.2
Ion exchanged

Ultrafiltered
+
DP400 Softwood Desulphonated Na 9 000 1.9 3
Oxidised

Filtered 2+
DP401 Hardwood Ca 5 900 1.4 4.7
Heat treated

The lignosulphonate DP398 was provided from different batches and was thus also denoted
DP795 and DP851.

18
IV Results and Discussion 

IV.1 Model compound studies of the laccase reaction mechanism (Paper I & 
II) 

The reaction mechanism of laccase has been extensively studied over the years both in lignin 
degradation 104,120‐124 and in biosynthesis 83‐85. Model compound studies of laccases have 
demonstrated the efficacy of the laccase‐mediator systems with an array of mediators, both 
natural and synthetic. These experiments were however aimed to understand and expand the 
degradative aspects of laccase activity, and the potential of laccase for polymerisation has 
attracted significantly less attention. Experiments with mediators such as ABTS 125, polyoxalates 
126 , ferulic acid 127, HBT 128 and also in the absence of mediators 129‐132 have clearly demonstrated 
that laccase is a highly potent tool for the polymerisation of phenol containing compounds. 

To elucidate the polymerisation mechanisms of laccase in the present work, a number of lignin 
end‐group compounds were subjected to oxidation by two laccases, TvL and MtL (Figure 8). The 
oxidation experiments were conducted under the optimal conditions for the respective enzymes 
in Tris‐buffer under constant oxygen saturation. The products were analysed with a variety of 
mass spectrometric and spectroscopic tools. 


OH OH Me  OH 
  Me
1 1 1 1
6 2 6 2 6 2 6 2
5
3 OMe MeO 5 4 3 OMe MeO 5 3 OMe MeO 5 4 3 OMe
4 4
OH OH OH OH
1 2 3 4
Vanillyl alcohol Syringyl alcohol -methylsyringyl alcohol 4-methyl syringol
(4-hydroxy-3-methoxybenzyl (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl (4-(1-hydroxyethyl)-2,6-dimethoxy (4-methyl-2,6-dimethoxy
alcohol) alcohol) phenol) phenol)

 O  OH   SO 3H
Me
1 1 1 1
6 2 6 2 6 2 6 2

5
4 3 OMe MeO 5 4 3 OMe MeO 5 4 3 OMe 5 4 3 OMe
OH OMe OMe OH

5 6 7 8
Vanillin 3,4,5-trimethoxybenzyl 1,2,3-trimethoxy-5-methyl Vanillyl sulfonic acid
alcohol benzene
(4-hydroxy-3-methoxy (4-hydroxy-3-methoxyphenyl-
benzaldehyde) methanesulfonic acid)

 
 SO3H Me  SO3H Me  SO 3H

1 1 1
6 2 6 2 6 2

5 3 MeO 5 4 3
MeO 5 4 3 OMe 4 OMe OMe

OH OH OH

9 10 11
Syringyl sulfonic acid -Methylvanillyl sulfonic acid -Methylsyringyl sulfonic acid
(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl (1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) (1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)
- methanesulfonic acid) ethanesulfonic acid) ethanesulfonic acid)
 

Figure 8: Model compounds oxidised by MtL and TvL in Papers I and II. The nomenclature is as follows; the 
aromatic carbons in the benzyl ring are numbered clockwise from 1 to 6 starting with the carbon to which the 
side‐chain is attached. The side‐chain carbons are denoted with greek letters α, β and γ. To distinguish atoms 
on a secondary monolignol, an index ‘ (prime) is added. 

19 
 
The end groups in lignin occupy several interesting positions which to varying degrees affect the 
coupling pattern when they are subjected to oxidation reactions by laccases. The traditional 
understanding of the polymerisation mechanism of laccase can be summarised in three steps: 
oxidation of a phenolic substrate through one‐electron abstraction, generation of a resonance‐
stabilised phenoxy radical, and thereafter a spontaneous, non‐enzyme catalysed coupling and 
rearrangement. The phenoxy radical formed in the first step is characterised by a relatively long 
life‐time and stability due to the delocalisation of the unpaired electron to various positions along 
the benzylic ring and side‐groups. As a consequence, the phenoxy radical can participate in a 
variety of reactions depending on the position of the unpaired electron. 

The generally low redox potential of laccases limits their action to phenolic substrates. This was 
evident as neither of the two laccases TvL and MtL was able to alone oxidise the non‐phenolic 
trimethoxy benzyl alcohol 6. Although the laccase‐mediator system (LMS) has been 
demonstrated to be a highly efficient tool for oxidation of non‐phenolic lignin units 63,91, the 
chemistry of those reactions is not within the scope of this thesis and has not been investigated.  It 
should however be noted that the mechanisms of the LMS are significantly different from those 
of laccase alone. Whereas laccase oxidation relies on the abstraction of phenolic hydrogen, the 
LMS is able to react with more inert hydrogens such as Hα and Hβ. 

IV.1.1 The 1‐position

Laccase oxidation of vanillyl alcohol 1 enables the unpaired electron to delocalise to 4‐OH, 5, 1 
and 3‐positions in the benzyl ring (Scheme 3). Subsequent radical‐radical coupling is thus 
expected to occur between these positions. GC/MS analysis revealed the formation of 4‐O‐5’ and 
5‐5’ coupling products.   

1 2 3 4
OH

OH OH 
OH 

OH 
1 1 1
1 1 C
6 2 Laccase 6 2 6 2
6 2 6 2
5 5 5 C
O2 5 HC 3 OMe
4 3 OMe 3 OMe 3 OMe 4
3 OMe 5 4 4
4
OH O O
O O

2+2
1+2

OH HO OH
OH

O OMe MeO OMe

OMe OH OH OH

4-O-5' dimer 5-5 dimer

 

Scheme 3: Delocalisation of the unpaired electron and proposed reaction mechanism for 4‐O‐5’ and 5‐5’ 
dimerisation of vanillyl alcohol when oxidised by MtL and TvL. The various resonance forms of the oxidised 
vanillyl alcohol are labelled 1 through 4. 
 

20 
 
Interestingly, the amounts of 4‐O‐5’ and 5‐5’ coupling products obtained were shown to be 
related to the pH at which the oxidation was performed. At pH 5, the optimal pH for TvL, the 
formation of 4‐O‐5’ coupling was promoted, whereas formation of 5‐5’ coupling products 
dominated at pH 7 (the optimal pH for MtL) (Figure 9A, B). This phenomenon was attributed 
exclusively to pH when the same outcome was observed when TvL was run at the optimal pH for 
MtL and vice versa. No explanation of the pH‐dependence of the reaction has yet been proposed 
but the deprotonation of the phenol group of the substrate prior to electron abstraction by laccase 
can provide some explanation.  
HO OH

A) HO OH
B)
MeO OMe
OH OH
MeO OMe
5-5’ dimer
OH OH 2.50
42.77
100 5-5’ dimer
OH
OH
90 OH
OH 2.00
80
Relative Abundance

O OMe

O OMe OMe OH
70
OMe OH 1.50
AU 4-O-5’ dimer
60
4-O-5’ dimer
50
1.00
40 43.10

30
0.50
20

10
0.00
0
42.6 42.8 43.0 43.2 43.4 10.00 15.00 20.00

Time (min) Minutes

C) 152 122 152 122

152 122 152 122

intens. [a.u.]

x 104
122 152 122 152

3.0
603.183
328.964

481.090

2.0
619.174
344.949

467.089

741.194
755.282
497.078

893.373
771.294

877.357

1.0

0.0
300 400 500 600 700 800 900 m/z  

Figure 9: (A) GC,  (B) HPLC and (C) MALDI‐TOF MS spectrograms of vanillyl alcohol 1 oxidation by MtL, 
(dashed) and TvL (solid). 
 
Further probing of the oxidation results with MALDI‐TOF MS analysis revealed formation of 
oligomeric coupling products consisting of up to seven units separated by masses of 152 and 122 
Da (Figure 9C). The mass difference of every second monomer unit suggests a loss of 30 Da from 
every second monomeric unit during polymerisation. HPLC analysis showed that this loss was 
due to a rearrangement and release of the side‐chain at the 1‐position of vanillyl alcohol as 
formaldehyde (Scheme 4).  These findings are in line with previous studies on lignin model 
compounds where  side‐chain elimination reactions were observed during oxidation 133‐138.  It is 
likely that the 4‐O‐5’ and 5‐5’ dimers serve as initiation points for the oligomer which growths 
through the addition of single monomers or dimers. 

21 
 
 1 2 3 4
OH

OH OH  OH 

OH 
1 1 1
1
6 2
1
6 6 C 2
6 2
Laccase 6 2 2
5 5
5 5 C
R 3 OMe
O2 5 C 3 OMe R 3 OMe
4 R 3 OMe R 4 4
R 3 OMe 4
4
OH O O
O O

2+3 1+3

OH
OH
OMe OMe
HO HO MeO
OMe
OH OH
- CH2O O
R OH O - CH2O
R OH
MeO R
O MeO R
OH OMe O
OH
OMe
1-5' bond
1-O-4' bond
 

Scheme 4: Proposed mechanism for formation of 1‐5’ and 1‐O‐4’ bonds when vanillyl alcohol is oxidised by 
MtL and TvL. Formation of these couplings predominates when the 5‐position of the substrate is occupied 
(denoted R). The various resonance forms of the oxidised vanillyl alcohol are labelled 1 through 4. 
 
The repetitive pattern of alternating masses observed in the MALDI‐TOF analysis suggests that 
every second unit is incorporated through the elimination of the side‐group at the 1‐position.  
Since no 1‐O‐5’ or 1‐5’ dimers were identified, it is assumed that coupling to the 1‐position occurs 
only when either the 4‐OH or 5‐position is occupied. It has been postulated that  coupling to 1‐
position occurs in natural lignin, albeit with a low occurence 139,140. Nonetheless, these findings 
are relevant to establish the reactivity of the 1‐position. 

Replacing the hydroxyl group with a sulphonic acid group (SO3H) at the Cα position of vanillyl 
alcohol (vanillyl sulphonic acid 8), did not inhibit formation of oligomeric material. It did 
however effectively prevent side‐chain elimination as no traces of elimination products were 
detected (Scheme 5). The introduction of C (α‐methylvanillyl sulphonic acid 10) yielded similar 
results.  

1 2 3 4
   
  SO 3H
Me  SO 3H Me  SO 3H Me  SO 3H Me
Me  SO 3H
1 1 1C 1
6 2 1 6 2 6 2
Laccase 6 2
6 2
5 5 5 C
3 OMe
O2 5 HC
3 3 OMe
4 5 4 3 OMe 4 OMe 4
3 OMe
4
OH O O
O O

1+3
1+2 2+2 2+3

4-O-5' and 5-5' bonds 1-5' and 1-O-4' bonds

 

Scheme 5: Sulphonation of Cα effectively prevents couplings to the 1‐position when the substrate is oxidised 
by laccase. The various resonance forms of the oxidised sulphonated end group model are labelled 1 through 
4. 

22 
 
IV.1.2 The Cα position 

Model compound experiments with laccase revealed the importance of the Cα position in both 
lignin and lignosulphonates. Based on previous experience of laccase oxidation of syringyl 
alcohol 2 and α‐methyl syringyl alcohol 3 with methoxy groups at the 3‐ and 5‐positions, only the 
4‐OH and the 1‐position are expected to participate in any eventual coupling reactions. 
Interestingly, only dimeric products in small amounts were detected. The main oxidation 
products detected were Cα oxidation products (Figure 10). This oxidation is assumed to occur in 
two steps; disproportionation and tautamerisation. While the disproportionation involves the 
reaction of two radicals, one being reduced back to a phenolate and the other being oxidised to a 
quinone methide, the subsequent tautamerisation is a rearrangement of the oxidised quinone 
methide where the Cα is rearranged to a carbonyl (Scheme 6).  

A) B) Me O

O
OH
Me
MeO OMe
3.00
OH OH
3.00 MeO OMe
OMe
Acetylsyringone
OH
2.50 MeO O
Syringyl aldehyde
2.50 MeO OMe
OH Me OH MeO
MeO O
2.00
2.00 HO OMe
AU

MeO OMe HO MeO OMe

AU

OH OMe 4-O-1’ dimer

OH
1.50
1.50 syringyl alcohol 2 4-O-1’ dimer α-methylsyringyl alcohol 3

1.00 1.00

0.50 0.50

0.00 0.00
10.00 15.00 20.00 10.00 15.00 20.00

Minutes Minutes  

Figure 10: HPLC spectrograms of oxidation product formed from oxidation of (A) syringyl alcohol 2 and (B) α‐
methyl syringyl alcohol 3 by TvL (dashed) and MtL (solid). 
 

1 2
OH
 OH  OH
OH
 OH
1 1
1 C
6 2 Laccase 6 2 Disproportionation
6 2
5 5
+
MeO 3 OMe
O2 5
4 3 OMe MeO 3 OMe
MeO 4 4 MeO OMe MeO OMe
OH O
O OH O

1+2
Tautamerisation

OH
MeO O

O
OMe
MeO OMe
OH
MeO OMe
OH Syringaldehyde

1-O-4' bond
 

Scheme 6: Possible reaction routes of syringyl alcohol after oxidation by laccase. The various resonance forms 
of the oxidised vanillyl alcohol are labelled 1 through 4. 

23 
 
  
The pH was again shown to influence the oxidation reaction as larger amounts of syringaldehyde 
and acetylsyringone were formed at the higher pH (Figure 10). Oxidation of Cα is a potential 
terminal reaction where the oxidation potential of the oxidised syringaldehyde is raised to a level 
close to or above the E0 of MtL 141. This was evident when vanillin 5 with a Cα carbonyl was 
oxidised by TvL and MtL. While the high‐E0 TvL generated oligomeric materials, the low‐E0 MtL 
left the vanillin untouched.  

Laccase oxidation of syringyl sulphonic acid 9 and of α‐methylsyringyl sulphonic acid 11 in 
which the Cα hydroxyl was replaced with a sulphonic acid group left the model compounds 
untouched, suggesting that Cα oxidation is inhibited by the presence of a sulphonic acid group. 
On the other hand, the lack of a non‐occupied 5‐position effectively prevents any coupling 
reactions between these model compounds. These findings are important as they illustrate the 
detrimental outcome of laccase oxidation of lignin end groups containing Cα hydroxyls. 

The presence of end groups containing reduced Cα has been postulated to exist in lignin 142,143. To 
investigate their influence, the model compound 4‐methyl syringol, 4 was oxidised by laccase. 
Lacking a non‐occupied 5‐position and a suitable leaving group at the 1‐position, the possibilities 
for polymerisation appeared less obvious. Nonetheless, oligomeric compounds consisting of up 
to three monomeric units were discovered with MALDI‐TOF MS analysis (Figure 11). 

A)

166 166
Intens. [a.u.]

x 104
166 166 166
166 166 166
6
522.911
538.899
372.748
356.755

705.045
689.057

4
388.735

554.907

871.176
855.189
721.049

0
400 500 600 700 800 900 m/z

B)
Intens. [a.u.]

x 104

166 166 166

6
166 166 166
356.842

4
372.852

538.904
522.916

705.039
689.048

871.161
855.173

0
400 500 600 700 800 900 m/z
 

Figure 11: MALDI‐TOF MS spectrograms of 4‐methyl syringol 4 oxidation by (A) MtL and (B) TvL. 
 
The high degree of substitution of the model compound limits the theoretically possible number 
of linkages to two; α‐α’ and 4‐O‐α’. This implies that delocalisation of the unpaired electron to 
the Cα position occurs. Two probable explanations may be considered; direct electron abstraction 
from the Cα position by laccase or an indirect electron shuttle effect. The inability of laccase to 

24 
 
directly oxidise the Cα was clearly demonstrated when the non‐phenolic model compound 3,4,5‐
trimethoxybenzyl alcohol 6 (Figure 8) remained unchanged after treatment with TvL and MtL.  

The shuttle effect was investigated by oxidising a 1:1 (mol:mol) mixture of 4‐methyl syringol 4 
and its non‐phenolic equivalent trimethoxy benzene 7. Dimers of the model compounds 4 and 7 
were indeed discovered, strengthening the electron shuttle theory (Scheme 7). 
Me Me Me Me CH2

Laccase
+ +
MeO OMe O2 MeO OMe MeO OMe MeO OMe
MeO OMe
OH O OMe OH OMe

4-methylsyringol 4 trimethoxy benzene 6

 

Scheme 7: Localisation of the unpaired electron to the Cα position of trimethoxy benzene through electron 
abstraction by the 4‐methylsyringol radical formed by laccase oxidation. 
 
It appears that a level of self‐mediation occurs in this reaction. Whether an end group in a 
polymer chain is able to perform similar reactions remains to be answered. Although unusual, 
the existence of 4‐O‐α’ linkages in native lignin 144 and oligomeric oxidation products of highly 
substituted phenols has been previously been reported 145‐147. 

IV.1.3 Conclusions from the model compound studies 

Laccase has clearly been demonstrated as a very potent tool for the polymerisation of various 
hardwood and softwood lignin end‐group models. The outcome of the reactions is largely 
governed by the structure of the substrate and the pH during the reactions rather than by the 
structure of the laccase. This is expected since radical coupling is not an enzyme‐catalysed 
reaction. 

The availability of free 5‐positions on the benzyl ring clearly favours the more abundant 5‐5’ and 
4‐O‐5’ couplings. These bond forms new and not previously existing linkages between different 
lignin end groups and are thus termed “productive”. When the 5‐position is occupied, as in 
hardwood lignin or due to inter‐monolignol bonds, additional side‐chain oxidation reactions 
and/or coupling to the 1‐ or α‐position of the substrate occur.  These reactions are termed 
“unproductive” since they either raise the redox potential of the end group or are formed 
through the breakage of existing bonds.   

The aryl‐ether and aryl‐aryl couplings are the most abundant in lignin and as such are easily 
formed as a consequence of laccase oxidation but the occurrence of couplings to 1‐ and Cα 
positions, albeit relatively scarce in lignin, has nonetheless been demonstrated. 

Sulphonation of the Cα‐ lignin is a relatively easily achieved modification of lignin that occurs in 
sulphite pulping. It does not only increase the solubility of lignin, but it also directs the laccase‐
initiated end‐group reactions towards specific types of couplings (Scheme 8).  

25 
 
If laccase is to be used for polymerisation of lignins, it is imperative that the reactions are directed 
towards the formation of new inter‐linkages and not breakage of existing ones. 

Native lignin end group Sulfonated lignin end group

L -
L OH SO3

OMe OMe

OH OH

L OH
OH
L
-
OH - L SO3
L SO3
OMe MeO
OMe
O OH
O O L OH
L
MeO O OMe
L OH OMe
H
MeO L OH MeO OH
OH

HO OMe
5-5'-couplings
HO OH -
L SO3
1-couplings O OMe
Cα -oxidation MeO -
L SO3
MeO OH 5-5'-couplings
4-O-5'-couplings
HO L
HO L OH
Unproductive couplings
L
MeO 4-O-5'-couplings
OH
α-couplings

Productive couplings  

Scheme 8: Possible reaction pathways of laccase oxidation of phenolic end groups in native lignin and 
lignosulphonates. 
 

Laccase oxidation of lignosulphonates (Paper III) 

Four commercial lignosulphonate salts DP398‐DP401 (Table 1) at various concentrations were 
subjected to oxidation by different activity units of TvL and MtL under constant oxygen 
saturation for 24h (Figure 12). In all cases, an increase in the average molecular weight as well as 
a decrease in the phenolic content was observed. 

 Based on previous model compound studies, it is concluded that the polymerisation reactions 
are a consequence of coupling reactions by phenoxy radicals generated by laccase oxidation of 
phenolic end groups.  

26 
 
 A) DP398 B)
DP398
400 000 1.40
1.20

Ph-OH (mmol/g)
300 000 1.00
w
M
0.80
_

200 000
0.60

100 000 0.40

0.20
0 0.00
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24
Time (h) Time (h)

DP401 DP401
150 000 1.60

125 000

Ph-OH (mmol/g)
1.20
100 000
w

0.80
M

75 000
_

50 000
0.40
25 000
0 0.00
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24
Time (h) Time (h)  

Figure 12: (A) Molecular weight averages and (B) phenolic content of lignosulphonates DP398 andDP401 after 
oxidation by TvL at various lignosulphonate concentrations and laccase activity units.  
The following denotions are used;    (1 g/l and 50U),    (10 g/l and 50U),    (100 g/l and 50U),   (1 g/l and 
500U),    (10 g/l and 500U) and    (100 g/l and 500U).  Similar reaction profiles were obtained with MtL as well 
as with the other lignosulphonate salts DP399 and DP400. 
 

IV.1.4 The influence of lignosulphonate concentration and structure 

The laccase oxidation experiments were performed at three different lignosulphonate 
concentrations; 1, 10 and 100 g/l. Two striking observations were made; the average molecular 
weight increased significantly at high lignosulphonate concentrations and the reaction was more 
or less completed during the initial 4 hours. 

At lignosulphonate concentrations below 100 g/l, only minor changes were observed. The 
greatest increase in the average molecular weight was observed in the oxidation of DP401 by TvL 
where a roughly 20‐fold increase was observed. Interestingly, the lowest increase was seen in 
DP400 with only a 2‐fold increase after 24 hours. 

The decrease in the phenolic content was essentially unaffected by the lignosulphonate 
concentration suggesting that there was no direct relationship between these two. The consumed 
phenols probably either form quinone structures or participate in intramolecular coupling 
reactions which are not detected as an overall increase in the molecular weight. Only at higher 
lignosulphonate concentrations does there appear to be a near‐inverse linear relationship 
between the consumption of phenols and the average molecular weight increase. This 
relationship is most likely related to the increased probability at higher concentrations of 
intermolecular reactions where end groups from two individual lignosulphonate chains are 
coupled together (Figure 13).  

27 
 
 OMe SO 3H
HO 3S
OMe O
M eO OMe
O
O OM e

OH OH HO
SO 3H OH
HO SO 3H O
O HO
HO 3S HO OH
HO
O
O HO 3S SO 3H
OM e M eO
O
O HO M eO
HO
OM e SO3H OH
M eO M eO OH
O
O
OM e O
HO 3S
M eO OH HO
OH HO 3S SO 3H
OH O OM e M eO
O OH
OMe OH
O O
HO HO 3S HO 3S
M eO
HO 3S
O O OH
OMe OH
OMe OMe SO3H
HO M eO O
HO 3S OM e HO
SO 3H M eO
O OM e OH
M eO OM e
OH SO3H O SO 3H
O M eO HO
OH OMe
M eO HO
SOH3H
O OMe
HO 3 S O HO
HO O HO OH
HO 3S SO 3H
O
HO OH OMe HO
SO3 H OM e
O OMe
M eO
OH SO 3H SO 3H OH
OMe OH
M eO
O SO 3H
HO O O M eO

OH HO 3S SO 3H
HO 3S
OH OMe
SO 3H OH
O
O
O OM e O SO 3H
HO 3S OH M eO

M eO

HO 3S O HO HO
OH M eO OH
SO3H HO
M eO O O
OMe OH
M eO O SO 3H OH
M eO OM e
M eO
HO OMe HO 3S
OH M eO HO3S SO 3H
OH O M eO HO 3S O OM e
HO3S OMe OH HO OH
HO O
O O
OM e
OH SO 3H
O M eO HO
HO3S OH HO
OH SO3H
OMe M eO
HO HO HO OH
OMe SO 3H OM e
HO3S O HO3S

HO 3S OH
OMe
SO 3H SO3H
HO 3S
HO
HO
O M eO O
M eO OM e
HO O HO3S
HO HO 3S O
HO OH M eO O

OH
O HO
M eO OMe
HO SO3H M eO SO 3H
HO 3S OM e M eO OH
O M eO OH
O O

HO
HO 3S OH O
OH OMe
HO
M eO HO 3S O
O OH OM e
M eO OM e
OMe OH
O
M eO
SO3 H
OH O
O SO 3H
HO 3S OH O
HO 3S

M eO O M eO
HO OM e OH

O
O O M eO
M eO
HO SO 3H
HO 3S
SO3 H
OM e OH O
O

O OM e

SO 3H

High lignosulphonate concentration Low lignosulphonate concentration  

Figure 13: The importance of concentration to avoid intramolecular cross‐coupling of individual chains during 
laccase oxidation of lignosulphonates. 
 
Of the four lignosulphonate salts, only DP400 exhibited low or no susceptibility to laccase 
oxidation. This lignosulphonate, although containing significant amounts of phenols contained 
only low amounts of organic sulphur. The low sulphur levels can be related to the previous 
model compound experiments which demonstrated the importance of the sulphonic acid group 
on the α‐position of a lignosulphonate end group. While the phenols are consumed at a rate 
similar to that of the other salts, no significant increase in average molecular weight of DP400 was 
observed at any concentration. This can be related to the results with model compound where it 
was found that the laccase oxidation of phenolic end groups yielded different results depending 
on the nature of the Cα. A lack of a sulphonic acid group at this position promotes non‐
productive reactions such as a coupling to the 1‐position with the subsequent breakage of the Cα 
side‐chain and oxidation of the Cα hydroxyl to a carbonyl group. These reactions are expected to 
occur on non‐sulphonated end groups in lignosulphonates and, as consequence of a low degree 
of sulphonation, they are dominant over the productive aryl‐aryl and ethyl‐ether couplings. 

The polydispersity index was shown to increase significantly with high laccase amounts (Figure 
14). This is to be expected despite the the nature of the non‐selective radical‐radical couplings of 
the phenoxy radicals. These reactions, although not enzyme‐catalysed, are expected to correlate 
with enzyme amount since the radicals themselves are formed by the enzyme. The following 
coupling reactions occur spontaneously with little or no control, resulting in an increase in the 
polydispersity index. 

FT‐IR‐analysis of the lignosulfonates DP398‐DP401 prior to and after oxidation by TvL (Figure 14) 
revealed only minor differences, suggesting that no structural changes occurred in the 
lignosulphonates other than the increase in molecular weight and reduction of phenols.  

The significant drop in the reaction rate after 4 hours of reaction time can be partly explained by 
the lignosulphonate macromolecular structure. Several such structures have been proposed (see 
Introduction) and these experiments validate some of these, most notably the suggested micelle‐
like structures that lignosulphonates form in solutions with a hydrophilic surface and a 
hydrophilic core 15.   

28 
 
 DP398

4 A
Mw / Mn
_ _

0
0 4 8 12 16 20 24 4000 3000 2000 1500 1000 600
Time (h) cm -1

DP401

3.5
3.0
2.5
A
Mw / Mn
_ _

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 4 8 12 16 20 24 4000 3000 2000 1500 1000 600
Time (h) cm -1
 

Figure 14: Polydispersity indeces and FT‐IR spectrograms of DP398 and DP401 at 100 g/l during oxidation by 
MtL (solid) and TvL (dotted) at 50 ( ) or 500 ( ) activity unit. The black dashed lines in the FT‐IR spectrograms 
represent untreated lignosulphonate salts. 
 
Due to steric constraints, the enzyme can only access the phenolic end groups located on the 
surface of the lignosulphonate micelle. It is therefore probable that the molecular weight increase 
levels out when the phenolic end groups available to the enzyme for oxidation are consumed 
while the remaining groups buried within the micelle remain untouched. At that point, the 
polymerisation reactions are slowed down and the molecular weight increase and the concurrent 
consumption of phenols levels out. 

IV.1.5 The influence of the enzyme 

The difference in redox potential between TvL and MtL was manifested during the oxidation of 
the lignosulphonates DP398‐DP401. A tenfold increase in activity units (U) of MtL was required 
to match the average molecular weight increase achieved by TvL under identical conditions. At 
low MtL activity units (50U), no change in the average molecular weight was observed at any of 
the investigated lignosulphonate concentrations. The most probable explanation is the ability of 
TvL to oxidise a broader range of phenolic end groups due to its significantly higher redox 
potential. 

To investigate the influence of enzyme addition to lignosulphonate, two separate experiments 
were conducted where equal amounts of activity units of TvL was added batch‐wise (at time = 
0h) and continuously (each hour) to a 100 g/l lignosulphonate solution during 4 hours of reaction 
time (Figure 15). 

29 
 
 Batch-wise addition
250 000 3.0

2.5

Ph-OH (mmol/g)
200 000
2.0
150 000
w

1.5
M
_

100 000
1.0
50 000 0.5

0 0.0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Time (h) Time (h)

Continuous addition
250 000 3.0

2.5

Ph-OH (mmol/g)
200 000
2.0
150 000
w

1.5
M
_

100 000
1.0
50 000 0.5

0 0.0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Time (h)
Time (h)  

Figure 15: Average molecular weight increase (left) and phenolic content decrease (right) of batchwise and 
continuous addition of 50U TvL to 100 g/l of DP398 ( ), DP399 ( ), DP400 ( ) and DP401 ( ). 
 
While the batch‐wise experiment reached a plateau after the first hour with apparently no further 
reactions, the addition of Tv each hour resulted in continuing polymerisation reactions under the 
4 hour duration time.  This experiment demonstrates an interesting observation; the ability to 
control the reaction rate through the continuous addition of the catalyst. It could also suggest that 
the life span of laccase is reduced by the presence of lignosulphonates, possibly through enzyme 
deactivation. In that sense, the unique feature of enzymes, their reusability, is lost after only one 
hour of reaction but the reaction can be restarted if fresh laccase is added. This is however only 
possible as long as there is phenols available for oxidation. 

30 
 
IV.2 Structural modifications of lignosulphonates through laccase oxidation 
and ozonolysis (Paper IV) 

Earlier efforts with technical lignosulphonates and laccases clearly confirmed that a significant 
increase in the average molecular weight can be obtained already after 4 hours of reaction time. 
Laccase oxidation of lignosulphonates serves however only to increase the average molecular 
weight. It does not solve the question of how to change the functional group composition, other 
than the phenol content. To introduce additional charged groups and potentially increase the 
performance of lignosulphonates as dispersants, significant modifications of the lignin backbone 
have to be achieved.  

Traditional ozone bleaching has the potential to introduce charged muconic‐ acid‐like structures 
through ring‐opening of the lignin benzyl ring (Figure 16). While the purpose of bleaching is 
lignin degradation to liberate the cellulose, applying bleaching techniques onto lignosulphonates 
serves a different purpose, viz.: to introduce of charged groups into the polymer. 
-
L  SO 3 -
L  SO3
O3 R
1
6 2 1
HO 4
5 2
5 6
3
R 3 OMe O
4
O OMe
OH  

Figure 16: Ring‐opening reactions performed by ozone on a lignosulphonate end group. The R‐ group 
designates H, OMe or cross‐coupling in DP795, DP401 and laccase oxidised DP795 respectively. 
 
Studies in which ozonolysis was employed to solubilise technical lignins 148,149, a significant 
increase in the amount of carboxylic groups was observed. This occurred however at the expense 
of a reduction in molecular weight, which is potentially detrimental to the performance of 
lignosulphonates as dispersants. 

By combining laccase catalysis and ozonolysis, a high‐molecular weight lignosulphonate polymer 
enriched with carboxyl groups can be produced.  For these investigations, two lignosulphonates 
DP795 (different batch of DP398), DP401 and the MtL were chosen. 

IV.2.1 Laccase oxidation of DP401 and DP795 

DP401 and DP795 at 100 g/l were oxidised by 500AU of MtL over a period of 4 hours under 
constant oxygen saturation. As a consequence of the previously reported radical‐radical coupling 
reactions, both the average molecular weight and the polydispersity of the lignosulphonates 
showed an almost 3‐fold increase (Table 2). 

   

31 
 
 Table 2: Molecular mass distributions of lignosulphonates DP401 and DP795 after oxidation by 500U MtL.

DP401 DP795
Time (min) Mw (Da) Mw / Mn Mw (Da) Mw / Mn
0 12 700 2.4 41 700 2.8
60 16 500 3.2 52 200 3.5
120 26 900 3.4 78 900 4.6
180 32 200 3.8 92 500 5.7
240 37 800 4.1 122 300 6.5

FT-IR spectroscopy analysis of the oxidised lignosulphonates revealed only minor changes after
laccase oxidation (Figure 17). The distinct peak at 647 cm-1 (associated with the stretching of S-O
bond) n DP401 and DP795 remained after oxidation (Figure 17).

DP401 DP795
1500 - 1300
1500 - 1300
1200 - 1000 1200 - 1000
1592

1589 647 647

A A 1717

4000 3200 2400 1800 1400 1000 600 4000 3200 2400 1800 1400 1000 600

Wavenumber (cm-1) Wavenumber (cm-1)

Figure 17: FT-IR spectra of lignosulphonates DP401 and DP795 prior to (solid) and after (dashed) 4 hours of
oxidation by MtL.

IV.2.2 Ozonolysis of DP401 and DP795 after laccase oxidation

The ozonolysis reaction was followed by SEC, FT-IR and 13P NMR analysis. As expected, a
significant reduction in the average molecular weight continued throughout the reaction (Table
3).

Table 3: Molecular mass distributions of lignosulphonates DP401 and DP795 after ozonolysis.

DP401 DP795
Time (min) Mw (Da) Mw / Mn Mw (Da) Mw / Mn
0 37 800 4.1 122 300 6.5
20 30 300 2,7 66 900 3.8
40 27 700 2.4 51 400 3.2
60 24 100 2 - -
80 21 700 1.8 - -

32
FT‐IR analysis revealed emerging carbonyl stretching peaks (1717 cm‐1). The skeletal C‐C, 
aromatic C‐H and C=C vibrational peaks (1510‐1420 and 1590 cm‐1 respectively) were clearly 
distorted and reduced after the completion of the ozonolysis (Figure 18). This distortion and 
reduction of the aromatic vibrational peaks was clearly related to a simultaneous increase in the 
carbonyl stretching peaks as the mechanisms through benzyl rings are degraded generate 
carbonyls such as carboxylic‐ and muconic‐acid‐like structures.  Consequently, an increase in the 
C=O stretching signal occurs at the expense of a reduction in the C=C and C‐C ring skeletal 
vibration signals. 

DP401 DP795
1717
1589

1419 1592 1420

1510 1451
1453

1717
1502

40 min
80 min
30 min

A 60 min A
40 min 20 min

20 min 10 min

0 min 0 min

1800 1700 1600 1500 1400 1800 1700 1600 1500 1400

Wavenumber (cm-1) Wavenumber (cm-1)  

Figure 18: FT‐IR spectra of DP401 and DP795 during ozonolysis. The increase in the carbonyl stretching peaks 
at 1717 cm‐1 is clearly visible in both lignosulphonates. 
 
Two‐dimensional HSQC further confirmed the existence of muconic‐ and carboxylic‐acid‐type 
structures. The cross peak of the methoxy C/H (Figure 19A) of the partially methylated muconic 
acids as well as the α‐ and β‐vinyl C/H (Figure 19B) were found in the HSQC spectra of DP401 
and DP795 after laccase oxidation followed by ozonolysis.  

The shifts were in good agreement with previous data from the 2D‐NMR analysis of muconic‐ 
acid‐type structures in lignin 150. The absence of both the α‐ and β‐cross peaks after MtL oxidation 
and prior to ozonolysis suggests that their formation is a direct consequence of the ring‐opening 
reactions by ozonolysis. Quantification of the functional groups through 31P‐NMR showed a 
significant increase in carboxyls (Figure 6), as well as a strong decrease in phenols in both DP401 
and DP795 during ozonolysis (Figure 20). 

33 
 
 35.0 L SO3- 40.0
DP401 Me DP795
O L SO3-
(A) (A) O
O 40.0
OH Me 45.0
OH Me O O
O O 45.0

50.0
50.0

55.0 55.0
L SO3-
L S O3-

60.0
60.0

Me Me Me
O O 65.0 O
OH OH
65.0
70.0 ppm (t1)
ppm (f1)
4.50 4.00 3.50 3.00 4.00 3.50 3.00
ppm (f2) ppm (t2)

100
Me L SO3-
DP401 O L S O3- 95.0 DP795
(B) (B) O
α
O α α
100.0 β 110
β OH Me
OH O O
O O
105.0
α
120
110.0

115.0 β
β 130

120.0
α
140
125.0

ppm (f1) ppm (t1)

7.00 6.50 6.00 7.00 6.50 6.00
ppm (f2) ppm (t2)  

Figure 19: 2D‐HSQC NMR spectra of (A) aromatic and (B) aliphatic regions of lignosulphonates DP401 and 
DP795. 
 
The largest increase in carboxyls was observed in DP401, in which an increase from 0.13 to 0.46 
carbonyl groups per aromatic ring was recorded. The formation of carbonyls is desirable, but the 
degradation of phenols has several implications, the most important being the possibility of 
polymerising the ozonated lignosulphonates with laccase.  As previously investigated, laccase 
treatment of these lignosulphonates consumes up to two thirds of the available phenols to enable 
polymerisation reactions.  

Carboxylic groups Phenolic groups

1.80 1.20

1.60
1.00
Amount (mmol/g)

Amount (mmol/g)

1.40

1.20 0.80

1.00
0.60
0.80

0.60 0.40

0.40
0.20
0.20

0.00 0.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ozonolysis time (min) Ozonolysis time (min)  

Figure 20: 31P‐NMR quantification of carboxylic and phenolic groups during ozonolysis of lignosulphonates 
DP401 ( ) and DP795 ( ). 
 
During these experiments, approximately one‐third of the phenols were consumed during the 
laccase oxidation. Further reduction of phenols by ozonolysis effectively prevents oxidation and 
polymerisation of the lignosulphonates once they have been ozonated. To take full advantage of 
the enzymatic treatment, laccase oxidation should therefore preferably be performed as a first 
stage in a two‐stage treatment of lignosulphonates. 

34 
 
The purpose of a two‐stage treatment to modify lignosulphonates is to generate plasticisers 
structurally similar to those currently available. Among the more interesting are the 
polynapthalene sulphonate and polycarboxylate‐polysulphonate superplasticisers (Figure 21). 
OH

OH H3C H O S O
O
S n
H3C CH3
O
HO m
n
OH
MeO n HO 3S O OH
OH
1 2 3
 

Figure 21: Structures of (1) lignosulphonate plasticiser, (2) polynapthalene sulphonate superplasticiser and (3) 
polycarboxylate‐polysulphonate superplasticiser. 
 
The structural lignosulphonate modifications demonstrated will probably yield lignosulphonate 
structures similar to the aforementioned superplasticisers. It is however uncertain how these 
modified lignosulphonates would behave in practical applications. To evaluate this question, 
thorough dispersing and plasticising studies need to be performed.

IV.3 Immobilisation of TvL (Paper V) 

To investigate the possibility of reusing laccase for the polymerisation of lignosulphonates, TvL 
was chosen for immobilisation. Reusing of the catalyst is undeniably an efficient method not only 
of reducing the cost of the catalyst but also of fully harnessing the inherent properties of a true 
catalyst i.e. the ability to perform multiple reaction cycles without being consumed. The cost of 
the catalyst is likely to represent a significant portion of the total cost and methods of reducing 
the cost are of great interest. The question of whether an immobilised laccase is able to 
polymerise a high‐Mw polymer as well as the non‐immobilised equivalent remains to be 
answered. Previous experiments with immobilised laccase have all used low‐Mw substrates in 
dilute solution which enables them to easily diffuse to and from the immobilised enzyme 151,152. A 
high‐Mw polymer such as lignosulphonate with its unique amphiphilic properties at high 
concentration is a different matter, and this has not previously been investigated. 

In the literature, the efficacy of immobilised laccases on a variety of supports and through a 
number of immobilisation techniques has been thoroughly demonstrated and evaluated, both in 
terms of immobilisation yield and catalytic properties 153.  

For the purpose of the present investigations, the covalent immobilisation technique based on the 
reaction between 3‐aminopropyltriethoxysilane (APTES) and glutaraldehyde (GLUTAL) was 
chosen. This reaction involves a surface derivatised with 3‐aminopropyltriethoxysilane and the 
N‐terminus of a protein residue in the presence of glutaraldehyde (Figure 22). The carbonyl 
group of glutaraldehyde activates the amine group of the N‐terminus of a protein residue. In the 
subsequent reaction, the amine groups on the APTES‐surface generate a Schiff base 154 and most 
notably a covalent linkage between the surface and the protein.  

35 
 
The APTES/GLUTAL immobilisation technique has proven to be a versatile immobilisation 
technique retaining  most of the activity while significantly improving the thermal stability of the 
bound catalyst 153. 
O

HO
Protein residue
NH2 N

O
NH2

O Si O OH N-terminus O Si O

O O

O O

APTES-activated surface  

Figure 22: Protein immobilisation on a 3‐aminopropyltriethoxysilane‐activated surface. 
 
TvL was immobilised on two different supports, APTES‐activated controlled‐porocity carriers 
(CPC) and aluminium oxide (Al2O3) pellets. Different immobilisation yields were obtained 
depending on the porosity of the carriers. The high‐porosity CPC could retain significantly 
higher amounts of immobilised TvL (Table 4). 

Table 4: Yields of protein amount and activity of TvL immobilised onto controlled porosity carrier beads (CPC 
and CPC‐LS) and aluminium oxide pellets (Al2O3) relative the amounts available in the stock solution. 
 

CPC CLC-LS Al2O3

Activity (%) 86.2 43.8 18.7

Protein amount (%) 88.6 68.2 20.2

 
The activity of the immobilised TvL was determined in up to five consecutive cycles using the 
ABTS assay. The green ABTS solution was adsorbed onto the surface of the immobilised carriers, 
but could be completely removed after washing with buffer solution after each oxidation cycle. 

IV.3.1 Oxidation of DP851 by immobilised TvL 

The TvL immobilised on CPC was loaded onto a tubular column reactor. Lignosulphonate DP851 
dissolved in acetate buffer (pH 5) to a concentration of 100 g/l was oxidised in five consecutive 
cycles where 50‐ml batches were recirculated through the column under constant oxygen 
saturation.  

36 
 
 O2

DP851

Figure 23: Immobilised TvL loaded on a column through which a 100 g/l solution of DP851 was recirculated 
under constant oxygen saturation. 
 
After 4h of reaction time, the lignosulphonate solution was removed and the column was washed 
with buffer solution until no discolouration of the residual solution was visible and the oxidation 
was repeated.  While the adsorption of the ABTS assay was shown to be reversible, this was not 
the case when DP851 was oxidised. Already after the first cycle, extensive discolouration was 
observed as a consequence of lignosulphonate adsorption onto the CPC. The adsorption 
appeared to be irreversible, as it remained after the following washing step and no leaching of 
the lignosulphonates into the residual water occurred. The discolouration remained throughout 
the next two cycles until the beads were completely saturated with lignosulphonates.  

SEC analysis of the oxidised lignosulphonate DP851 after each cycle showed a reduction in the 
efficacy of the immobilised TvL to polymerise. After the first two cycles, the average molecular 
weight of the oxidised DP851 significantly dropped and became stable during the remainder of 
cycles at a level close to the initial average molecular weight of the DP851 (Figure 24, legend  ). 

350 000
1.20
300 000
1.00
250 000
0.80
AU

200 000
MW
_

0.60
150 000 2 th cycle
0.40
1th cycle
100 000
0.20
50 000 3nd, 4rd , 5th cycle
0.00
0 _ 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00
Initial M W 1 2 3 4 5
Minutes
O x id a tio n c y c le  
Figure 24: Average molecular weight (left) and SEC eluograms (right) of DP851 oxidation by TvL immobilised 
on CPC ( ). 
 
There are a number of possible explanations of this behaviour such as lignosulphonate 
adsorption, leaching of the immobilised TvL into lignosulphonate solution, and TvL deactivation. 

37 
 
IV.3.2 Lignosulphonate adsorption 

Irreversible adsorption of lignosulphonates onto the highly porous CPC surface may be 
providing an obstacle for the lignosulphonate substrate to diffuse to the immobilised TvL. To 
evaluate the impact of this adsorption, two different strategies were employed; immobilisation 
onto a less porous carrier to facilitate easier removal of adsorbed lignosulphonates and 
immobilisation onto pre‐saturated CPC surface.  

Aluminium oxide (Al2O3) pellets and CPC‐LS (pre‐saturated with DP851 for 24 hours at room 
temperature followed by extensive washing) were chosen for the first and second approach 
respectively. As expected, the amount of immobilised TvL was considerably reduced (Table 4).  

The adsorption was investigated by immersing the immobilised Al2O3, CPC and CPC‐LS in a 
lignosulphonate solution at room temperature for 24 hours. Nearly all the discolouration could 
be removed from the Al2O3 carriers after buffer washing, whereas almost no adsorption occurred 
on the pre‐saturated CPC‐LS.  Activity was investigated with the ABTS assay for five consecutive 
cycles (Figure 25, left insert). 

35 350 000

30 300 000

25 250 000
A c tiv ity (U )

20 200 000
MW
_

15 150 000

10 100 000

5 50 000

0 0 _
1 2 3 4 5 Initial M W 1 2 3 4 5
A B T S o x id a tio n c y c le O x id a tio n c y c le
 
Figure 25: ABTS activity (left) and average molecular weight of DP851 (right) after five oxidation cycles by TvL 
immobilised onto CPC ( ), CPC‐LS ( ) and Al2O3 (  ) carriers. Error bars represent range of deviation of three 
individual measurements. The ABTS activity measurements were repeated for CPC and Al2O3 pellets (  and    
respectively) after immersion in lignosulphonates for 24 at room temperature. Lignosulphonate oxidation was 
also performed with CPC at 30° ( ). 
 
Much lower activities were recorded with CPC before and after immersion in lignosulphonates 
(symbols   and  , Figure 25). Contrary, to CPC, the activity of Al2O3 carriers was essentially equal 
before and after lignosulphonate saturation (symbols    and  , Figure 25). These two experiments 
demonstrate that the adsorption of lignosulphonates does indeed present an obstacle for the 
immobilised laccase to access its substrate. By choosing an immobilisation surface with low 
lignosulphonate‐adsorption properties, this problem can be addressed. This occurs however at 
the expense of lower enzyme immobilisation yield due to the significantly reduced capacity of a 
low‐adsorption surface such as Al2O3 pellets used here. 

The low TvL immobilisation yield was also evident when the carriers were employed to oxidise 
DP851 (Figure 25, left, symbols  ,    and   for CPC, CPC‐LS and Al2O3 respectively). While the 
Al2O3 pellets showed little or no ability to increase the average molecular weight of DP851, the 
CPC‐LS was able to polymerise DP851 in 5 consecutive cycles, albeit at a lower rate in each 
successive cycle. Other mechanisms than lignosulphonate adsorption are evidently in play. 

38 
 
Leaching of the immobilised TvL into the lignosulphonate solution, although possible, can be 
ruled out as it was demonstrated by the ABTS assay experiments that the enzyme remained 
bound to the immobilisation surface after a several oxidation cycles despite extensive buffer 
washing between the cycles (Figure 25). 

IV.3.3 Deactivation of the immobilised TvL 

The rapid reduction in enzyme activity on DP851 after the first two cycles cannot be explained 
solely by adsorption onto the carrier surface. It is hypothesised that lignosulphonates at high 
reaction temperatures deactivate the immobilised laccase by irreversible adsorption or 
denaturation. To investigate this, the oxidation of DP851 by CPC was carried out at 30°C instead 
of 50°C (Figure 25, left, symbol  ). There was a similar tendency for the oxidation reaction to 
slow down after the first two cycles, but the rate at which this occurred was significantly slower, 
suggesting that the enzymatic activity is greater at reduced oxidation temperatures. The 
hypothesis that lignosulphonates deactivate the immobilised TvL at high temperatures appears 
therefore to be supported. The deactivation can be retarded somewhat by lowering the 
temperature.   

A number of articles in the scientific literature report no changes or in some cases greater 
catalytic properties and thermal stability of the immobilised laccase 155,156. To investigate the 
catalytic properties of the immobilised TvL, DP851 was oxidised by equal amounts of 
immobilised and free laccase. The SEC eluogram obtained clearly showed that immobilised TvL 
did indeed retain the catalytic activity of the non‐immobilised TvL to polymerise DP851 (Figure 
26). 

2.80

2.60

2.40

2.20

2.00 600U TvL Starting material

1.80
1.60
AU

1.40
600U TvL on CPC
1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00

Minutes  
Figure 26: SEC Eluogram of DP851 oxidation by free (600 U TvL) and immobilised TvL (600U TvL on CPC). 
 
While the lignosulphonate adsorption can be addressed by choosing a different immobilisation 
support, the problem of the deactivation of the laccase appears to be more difficult to solve since 
the deactivation mechanisms are still not understood. A more structurally stable laccase could 
possibly withstand this deactivation. Before implementing this technique on any large scale, 
attention should be directed to academia and the on‐going pursuit of increased laccase stability 
through e.g. directed evolution and high‐throughput screening 157. 

39 
 
The observed deactivation of the immobilised TvL is an interesting observation since it confirms 
the observations in earlier experiments. When the lignosulphonates DP398‐DP401 were oxidised 
by free TvL (described in Paper III), the reaction was more or less halted after the initial 4 hours 
(Figure 12). In the light of the later findings, it is clear that deactivation of the TvL occurred in the 
earlier experiments and this was the probable explanation of why only a minor increase in the 
average molecular weight of lignosulphonates is observed after the first initial 4 hours of 
oxidation with laccase. 

IV.4 Lignosulphonate structural modification by the Fenton’s reagent (Paper 
VI) 

Although laccase has been demonstrated to be a highly efficient tool to most notably increase the 
molecular weight of lignosulphonates, the cost of the enzyme itself cannot be ignored. The 
successful effects of a conventional ozone treatment on lignosulphonates have been reported in 
Paper IV. However, a disadvantage of employing ozone is the degradation of the 
lignosulphonates. To achieve polymerisation, laccase oxidation must be applied, a treatment that 
require mild and controlled conditions to fully take advantage of the enzyme. Although this is 
generally preferred, the use of traditional bleaching chemicals might be advantageous in certain 
situations. Accordingly, alternative methods of increasing the molecular weight of 
lignosulphonates were investigated using the Fenton’s reagent, a mixture of hydrogen peroxide 
and a ferrous salt capable of generating highly potent radical species (Scheme 9) 158.  

H2O2 + Fe(II) OH• + OH- + Fe(III) (1)

H2O2 + Fe(III) O2•- + 2H+ + Fe(II) (2)

O2•- + Fe(III) O2 + Fe(II) (3)

H 2O 2 OOH- + H+ (pKa 11.6) (4)

OH• O•- + H+ (pKa 11.9) (5)

H 2O 2 + H + H3O 2+ H2O + OH+ (6*)

 

Scheme 9: Different pathways leading to the formation of reactive species (bold) in Fenton’s reaction.  
*  The existence of the hydroxyl cation (OH+, eq. 6) is not uncontroversial and the question of its existence 
( )

remains open. 
 
These species react with a variety of organic compounds including several wood components 
during lignin biodegradation by wood‐degrading fungi 159‐161. In the pulp and paper industry, 
Fenton’s reagent is closely associated with conventional hydrogen peroxide bleaching 162. 

This  section  describes  the  action  of  Fenton’s  reagent  on  lignosulphonates  at  acidic  and  alkaline 
pH and how this powerful radical‐generating system can be used for structural modifications. 

40 
 
IV.4.1 Fenton’s reagent at acidic pH

Lignosulphonates were oxidised by Fenton’s reagent (a mixture of hydrogen peroxide and

iron(II) acetate) at pH 5 for 1h. It has previously been reported that a low pH is optimal for
Fenton’s reaction to reach completion 158,163. During the oxidations of lignosulphonates, the pH
decreased somewhat, probably through the formation of acidic groups.

SEC analysis of the oxidised lignosulphonates revealed a drastic increase in the average
molecular weight, with the exception of DP400 where degradation was observed (Table 5).

Table 5: Average molecular weight, polydispersity and functional group composition of lignosulphonate
DP398-DP401 after 1h of oxidation by the Fenton’s reagent at acidic conditions.

Carboxyl -OH Phenol -OH

Mw (Da) Mw / Mn
(mmol/g) (mmol/g)

DP398

Reference 38 900 2.0 0.11 1.08

Fenton’s Reaction 1h 72 300 2.3 0.29 0.93
without Fe(II) 32 900 1.9 0.18 1.18

DP399

Reference 46 800 1.8 0.09 1.01

Fenton’s Reaction 1h 90 000 2.4 0.20 0.96
without Fe(II) 40 900 1.7 0.21 1.40

DP400

Reference 9 700 1.8 0.18 2.49

Fenton’s Reaction 1h 8 800 1.8 0.33 2.06
without Fe(II) 7 400 1.3 0.30 2.90

DP401

Reference 12 300 1.3 0.26 1.50

Fenton’s Reaction 1h 21 400 1.7 0.34 0.74
without Fe(II) 9 100 1.2 0.31 1.72

These findings are unexpected in the light of the traditional understanding of Fenton’s reagent
and the degradative lignin reactions due to the aggressive hydroxyl radicals (OH•), superoxide
anion radicals (O2•-) and secondary radical and ionic species such as hydroperoxide anions
(HOO-) and oxyl anion radicals (O•-) formed by the reagent (Scheme 9, equations 1 and 5).

It is proposed that the hydroxyl (OH•) and the superoxide anion radical (O2•-) act through
different pathways when in contact with lignosulphonate structures, that the hydroxyl radical
initiates radicalisation of a phenolic lignosulphonate end-group with subsequent coupling
reactions, and that the superoxide anion radical, through addition to the benzyl ring, achieves
ring-opening reactions transforming phenolic hydroxyls to their carbonylic counterparts (Scheme
10, right pathway).

41
If the reaction occurs on a cross‐linked lignosulphonate unit, it is suggested that 
depolymerisation and ring‐opening reactions (Scheme 10, left pathway) occur simultaneously. 

1 2 3

OH  OH
OH OH OH OH
SO3
-
-  -
SO3  SO 3 SO3
-
SO3
-
SO3
-
L L
HO L L L L
HO H2O
1
R=L 6 2 R=H
OMe OH HC C
L OMe OMe OMe OMe
OH HO 5
O O O O
L 3 OMe
4
Depolymerization
O2
OR
O2 2+2
1+2

OH

OH - OH
SO3 OH
L SO3
-
-
SO3
- SO3
L HO OMe L
CH3 OMe
L
L
O MeO OH O
O L O
O -
SO3 MeO OH
-
OH O3 S OH
HO
HO
OMe Ring-opening
Ring-opening

Cross-linking through 5-5' and 4-O-5' bonds

 

Scheme 10: Proposed reaction of the hydroxyl (OH•) and the superoxide anion radical (O2 ) with a 
•‐

lignosulphonate structure. Two pathways are proposed; reactions with a phenolic end‐group (R = H, right 
reaction arrow) and a cross‐linked lignosulphonate unit (R = L, left reaction arrow). The various resonance 
forms of the oxidised lignosulphonate structures are labelled 1 through 3. 
 
If iron(II) acetate is omitted, radical formation is reduced and it is expected that no structural 
changes occur. A significant increase in phenolic hydroxyls was nevertheless recorded as well as 
a slight decrease in the average molecular weight. These reactions are probably a result of the 
activity of cationic oxidation species (H2O3+) on lignin structures (Scheme 11). They are likely to 
be formed by the protonation of hydrogen peroxide under acidic conditions (Scheme 9, equation 
6) 164. 

 OH OH OH OH
OH

 OH OH
O  OH OH
OH L L L L OMe
L
H H2O
+ 1
H2O H 3O 2 + H 2O O
6 H3 O 2
2
O
OMe OMe
OMe R=L R=H OH O
5 O OH OH
O
L 3 OMe
4
Ring-opening
Depolymerization O
L  
+
Scheme 11: Proposed reaction of the cationic oxidation species (H2O3 ) and lignin end group at acidic 
conditions in absence of iron(II) acetate. Two pathways are proposed; reactions with a phenolic end‐group (R 
= H, right reaction arrow) and a cross‐linked lignosulphonate unit (R = L, left reaction arrow). 
 
Despite the absence of iron(II) acetate, radical species are probably still formed due to trace 
amounts of transitions metal ions in amounts sufficient to catalyse Fenton‐type chemistry and the 
subsequent reactions by those radicals. Omission of hydrogen peroxide did not yield any notable 
differences (data not shown), emphasising the importance of this species for Fenton’s reagent.  

42 
 
IV.4.2 Which cation does what?

The chemistry through which the cationic species H2O3+ reacts with lignosulphonate structures
can be related to the chemistry involved in peracetic acid bleaching. Here, ring-opening products
as well as quinone structures are generated through the action of the hydroxyl cation OH+ which
is generated by the acid-catalysed decomposition of peracetic acid (Scheme 12) 165.

O O
+ +
OH + H + OH
3C HO 3C HOH

Scheme 12: Decomposition of peracetic acid to acetic acid and hydroxyl cation.

It has been suggested that OH+ is the active species during peracetic acid bleaching 165. This
species is formed during protonation of hydrogen peroxide (Scheme 9, equation 6), but it is
assumed for the sake of simplicity that the intermediate protonated hydrogen peroxide H2O3+ is
the reactive species during these reactions. This species is expected to react with lignosulphonate
structures before it decomposes to OH+ and H2O.

It should also be noted that the reactions of both the OH+ and H2O3+ cations are expected to lead
so the same end products, so the involvement of the hydroxyl cation cannot be ruled out. This is
however still an open question as the existence of both the H2O3+and OH+ is yet to be established.

IV.4.3 Fenton’s reagent at alkaline pH

For comparison with reactions under acidic conditions, the oxidation of DP398 by Fenton’s
reagent was repeated at an alkaline pH.

Table 6: Average molecular weight, polydispersity and functional group composition of lignosulphonate
DP398 after 1h oxidation by Fenton’s reagent under alkaline conditions.

Carboxyl -OH Phenol -OH

Mw (Da) Mw / Mn
(mmol/g) (mmol/g)
Reference 38 900 2.0 0.11 1.08
Fenton’s Reaction 1h 43 000 1.9 0.21 0.78
without Fe(II) 41 800 2.0 0.26 2.39

The pH of the reaction was set close to the pKa of hydrogen peroxide to promote the formation of
perhydroxyl anion species HOO- (Scheme 9, equation 4). This highly reactive nucleophile is
traditionally considered to be the main agent during the alkaline hydrogen peroxide bleaching of
residual lignin. The mechanisms of these reactions have been thoroughly investigated and
reviewed over the years 162,166-168.

As under acidic conditions, polymerisation was observed, albeit at a much slower rates. The
moderate increase in the average molecular weight at alkaline conditions is probably a
consequence of competing degradation reactions by the perhydroxyl anions and polymerisation

43
reactions by the previously discussed radicals (OH• and O2•‐). It is also probable that the 
lignosulphonate degradation achieved by the perhydroxyl anions would be greater at higher 
reaction temperatures, as during alkaline hydrogen peroxide pulp bleaching. 

IV.4.4 The effect of lignosulphonate concentration 

Oxidation of DP398 by Fenton’s reagent was conducted at both acidic and neutral pH. The 
concentration of DP398 was varied from 6.25 to 100 g/l (Figure 27). Interestingly, at low 
lignosulphonate concentrations (below 25 g/l) extensive depolymerisation occured. This 
depolymerisation is likely due to ring‐opening reactions where phenolic hydroxyls are 
transformed to carboxylic ones. An increase in the lignosulphonate concentration promotes 
polymerisation reactions through radical‐radical coupling. Radicalisation of phenolic end groups 
probably occurs at both low and high lignosulphonate concentrations, but since coupling 
requires at least two radicals in close proximity, dilution of the lignosulphonates significantly 
reduces the probability that this will occur.  

The observation of the effect of lignosulphonate concentration is interesting in the light of the 
earlier laccase oxidation experiments. Both sets of experiments showed the importance of the 
lignosulphonate concentration, which is an integral factor during radical‐radical polymerisation.  
At low concentrations, decomposition of the radicals dominates with few radical‐radical 
reactions due to the infrequent of interactions between two individual species. The opposite is 
valid at high concentrations where decomposition of radicals is probably suppressed by the 
frequently occurring coupling reactions. 

1 pH 5 2 pH 11
80 000 2.4 80 000 2.4
70 000 2.2 70 000 2.2
60 000 60 000
2.0 2.0
50 000 50 000
Mw / Mn
_ _
Mw
Mw / Mn
_
Mw

1.8 1.8
_
_

40 000 40 000
1.6 1.6
_

30 000 30 000
1.4 1.4
20 000 20 000

10 000 1.2 10 000 1.2

0 1.0 0 1.6
Reference 6.25 12.5 25 50 100 Reference 6.25 12.5 25 50 100

[DP398] (g/l) [DP398] (g/l)

1a pH 5 2a pH 11
0.8 1.2 0.8 1.2
Carboxyl -OH (mmol/g)

Carboxyl -OH (mmol/g)

0.7 0.7
Phenol -OH (mmol/g)

Phenol -OH (mmol/g)

0.6 0.6
0.8 0.8
0.5 0.5

0.4 0.4
0.3 0.3
0.4 0.4
0.2 0.2

0.1 0.1
0.0 0.0 0.0 0.0
Reference 6.25 12.5 25 50 100 Reference 6.25 12.5 25 50 100
[DP398] (g/l) [DP398] (g/l)
 
Figure 27: Lignosulphonate concentration versus molecular mass distribution (insert 1,  , left y‐axis), 
polydisperisy (insert 2,  , right y‐axis), carboxyl ‐OH (insert 1a,  , left y‐axis) and phenol ‐OH (insert 2a,  , 
right y‐axis)  of DP398 after Fenton’s reaction of DP398. The refence values are displayed as dashed horizontal 
lines. 

44 
 
  
The pH during the oxidation reaction was shown to play an important role. Both polymerisation 
and ring‐opening reactions were promoted under acidic pH conditions. 

IV.4.5 The effect of hydrogen peroxide concentration 

Fenton’s reaction on DP398 was conducted under both acidic and alkaline pH using different 
amounts of hydrogen peroxide. The lignosulphonate concentration was set to 100 g/l and the 
hydrogen peroxide concentration was varied from 2 to 32 mM. Under both acidic and alkaline 
conditions, polymerisation reactions with the concurrent consumption of phenolic hydroxyls 
predominated up to 8 mM of added H2O2. Above 8 mM H2O2, extensive depolymerisation 
occurred, probably through ring‐opening reactions as the carboxylic group levels increased. 
Reactions at alkaline pH were as before much less pronounced (Figure 28). 

One explanation of these observations is that hydrogen peroxide dissociates to H3O2+ and HOO‐ 
at acidic and alkaline pH respectively. These ionic species become the predominant reactant with 
increasing addition of hydrogen peroxide. The formation of radicals proceeds through the 
oxidation of Fe(II) to Fe(III) and to sustain this reaction, the Fe(III) must be reduced back to Fe(II) 
(Scheme 9, equation 3).  The dissociation of H2O2 to H3O2+ and HOO‐ does however proceed faster 
than these Fe(II) oxidation/reduction reactions. Consequently, products from the reactions with 
these ionic species should dominate. 

1 pH 5 2 pH 11

120 000 3.0 120 000 3.0

100 000 100 000

2.6 2.6

80 000 80 000

Mw / Mn
2.2 2.2

_
Mw
Mw / Mn
_ _
Mw

60 000 60 000
_

1.8 1.8 _
40 000 40 000

20 000 1 .4 20 000 1.4

0 1 .0 0 1.0
0 2 4 8 16 32 0 2 4 8 16 32
[H2O2] (mM) [H2O2] (mM)

1a pH 5 2a pH 11

0.7 2.0 0.7 2.0

Carboxyl -OH (mmol/g)

Carboxyl -OH (mmol/g)

Phenol -OH (mmol/g)

Phenol -OH (mmol/g)

0.6 0.6
1.6 1.6
0.5 0.5

0.4 1.2 0.4 1.2

0.3 0.8 0.3 0.8

0.2 0.2
0.4 0.4
0.1 0.1

0.0 0.0 0.0 0.0

0 2 4 8 16 32 0 2 4 8 16 32
[H2O2] (mM) [H2O2] (mM)
 
Figure 28: Hydrogen peroxide concentration versus molecular mass distribution (1,  , left y‐axis), 
polydispersity (2,  , right y‐axis), carboxyl ‐OH (1a,  , left y‐axis) and phenol –OH (2a,  , right y‐axis) of 
DP398 after Fenton’s reaction on DP398. The refence values are displayed as dashed horizontal lines. 
 
Fenton’s reagent has proven to be a versatile tool for the modification of lignosulphonates under 
acidic and alkaline conditions. Lignosulphonate concentration, reaction pH and, hydrogen 
peroxide dosage can be used to control the reaction towards a desired results. While some of the 

45 
 
reactions performed by the reagent were previously known, there are aspects of Fenton’s reagent 
and its reactions with lignosulphonates discovered here have not previously been investigated. 

The chemicals required for Fenton’s reagent, mainly hydrogen peroxide, are ubiquitous in the 
pulp and paper industry and there no significant environmental issues are expected, either in 
processing or in effluent treatment. The versatility of this system for modification of 
lignosulphonates is extraordinary. By adjusting a series of parameters (lignosulphonate 
concentration, pH, peroxide dosage etc.) different results can be obtained. The studies described 
here are far from complete suggesting that there is plenty of room for optimisation. Therefore, the 
possibilities of scaling up this method appear promising. 

46 
 
V Conclusions and Further Perspectives 
This thesis describes various methods of modifying commercial lignosulphonates in order to 
enhance their performance as technical dispersants or to expand their utilisation to new areas. 
The challenge of increasing the molecular weight of lignosulphonates as well as introducing 
charged groups to the polymer has been largely solved using both enzymatic and chemical tools. 
Much effort has been put into achieving the mechanistic understanding of the oxidoreductive 
enzyme laccase reactions with both lignin and lignosulphonates. Several key features were 
identified as essential to achieve polymerisation of lignosulphonates under reaction conditions 
suitable for large‐scale applications. Successful attempts have also been made to achieve multiple 
usage of the laccase through immobilisation.  

In order to fully investigate the impacts of these modifications on the performance of 
lignosulphonates, further studies of the dispersing properties are critical. There is support for the 
improved dispersing power of lignosulphonates oxidised by laccase 169 as well as the improved 
dispersion of ozonated Kraft lignins 170 in the scientific literature showing that modification of 
lignosulphonates has a significant impact on their final application. This needs however to be 
fully investigated and thoroughly evaluated 

Should the modifications described here be successful, it is not difficult to envision an 
implementation of these methods in an existing sulphite plant. The installation of a reactor with 
immobilised laccase and an ozone generator prior to a pH adjustment (to optimal pH for the 
laccase) as well as an additional ultrafiltration stage (to fractionate the oxidised polymers) should 
suffice (Scheme 13).
Ca(OH)2

Precipitation
Spent cooking liquor pH adjustment Evaporation Dilution
(Howard process)
Ozonolysis

Spray drying Evaporation Ultrafiltration pH adjustment Ultrafiltration

Immobilised
laccase reactor  

Scheme 13: A suggested production flow chart of a new generation of lignosulphonates where modification 
through laccase oxidation and ozonolysis are implemented. 
  
The global concrete production is expected to approach volumes of 4 billion tonnes annually, 
largely driven by the infrastructure investments in the developing world171.  The need for high‐
performance concrete is here expected to be lower than in the advanced economies, and the need 
for lignosulphonates as additives to medium‐to‐low strength concrete should be ample. 
Therefore, any modifications that would improve the performance even marginally are 
potentially interesting. The position that lignosulphonates holds should not however be taken for 

47 
 
granted. This is clearly illustrated in the on‐going displacement of lignosulphonates from the 
high‐performance concrete additive market in favour of a new generation of synthetic 
equivalents. This speed of such development is troublesome, and it indicates the importance of 
the ability to tailor an additive to a specific need. So far, tailoring of lignosulphonates has been 
limited while the synthetic equivalents can be tailored almost without limit.  

Most lignosulphonate utilisation is based on the concrete additive market and a complete 
elimination of lignosulphonates from this market would be a major setback and would leave the 
producers with enormous quantities of lignosulphonates with no apparent usage. In the current 
concept of a biorefinery, the role that lignin plays is far from being defined. Two main 
alternatives have however been identified; fuel or chemicals. To use lignin as fuel in a paper mill 
is tempting, but as long as it is economically viable to upgrade lignin, it makes little sense. With 
constantly rising crude oil prices, increasing energy demands and the lack of a stable and reliable 
means to meet this demand, coupled with a reduction in the utilisation of lignin for chemicals, 
the fate of lignin lies undoubtedly in the fuel market. The fact that this source of fuel is abundant, 
essentially renewable and is more or less carbon dioxide neutral makes utilisation of this fuel 
even more tempting. To oppose this trend, it is therefore imperative that research on 
lignosulphonates continues, not only to enhance its performance but also to expand its utilisation 
to new areas. Although, the challenge is daunting, given the inherent complexity of such a 
biopolymer, lignosulphonates as well as lignins in general are far too interesting biopolymer to 
be doomed to a fate as a low quality fuel. 

With regard to the specific use of lignosulphonates as additives to cement, this thesis has clearly 
demonstrated that significant modifications can be achieved using both enzymes and 
conventional bleaching chemicals. These tools have proven to be versatile enough to obtain 
lignosulphonates with specific properties and this thesis should provide a good foundation for 
further investigations into the specific mechanisms of lignosulphonate/cement interactions. It is 
the hope of the author that this thesis will serve as a contribution to the current knowledge of 
lignosulphonates as well as raise the awareness and understanding of the possibilities to modify 
lignosulphonates through relative simple methods. 

48 
 
VI Acknowledgements 
First and foremost I would like to extend my gratitude to Gunnar Henriksson for supervising me 
over the years and for being an unlimited resource of new ideas and suggestions. 

Göran Gellersted and Jiebing Li are also thanked for good co‐operation within the Biorenew 
research project. 

Partners within the Biorenew project, most notably the LignoTech division of Borregaard, are 
acknowledged for their contribution to this work. 

Financial support from the Biorenew program (EU grant FP6‐NMP2‐CT 2006‐26456) which made 
this work possible is acknowledged.  

All co‐authors are thanked for their efforts. 

The administrative personnel at the Fibre & Polymer department, most notably Inga Persson and 
Mona Johansson are thanked. I truly believe that without you there would be no department to 
speak of.  

Former and present colleagues at the department are thanked for their contribution to the general 
atmosphere and for interesting and fruitful discussions about everything between heaven and 
earth. 

And finally, family and past and present friends are thanked for providing the necessary 
distraction from the scientific work. You are too numerous to be mentioned here by name but 
your contribution to my efforts to remain somewhat sane cannot be overstated.  

   

49 
 
VII References 
(1)  Boerjan, W.; Ralph, J. et al. Annual Review of Plant Biology 2003, 54, 519‐546. 

(2)  Frank, A. F. Oil Empire: Visions of Prosperity in Austrian Galicia Harvard University Press: Cambridge, MA, 
United States, 2005. 

(3)  Simonsen, E. Angewandte Chemie 1898, 11, 962‐966. 

(4)  Lynd, L. R.; Wyman, C. et al.; U.S. Department of Energy: 2002. 

(5)  Martone, P. T.; Estevez, J. M. et al. Current Biology 2009, 19, 169‐175. 

(6)  Freudenberg, K. Science (Washington, DC, U. S.) 1965, 148, 595‐600. 

(7)  Glasser, W. G.; Glasser, H. R. Holzforschung 1974, 28, 5‐11. 

(8)  Atalla, R. H.; Agarwal, U. P. Science (Washington, DC, United States) 1985, 227, 636‐638. 

(9)  Brunow, G.; Kilpeläinen, I. et al. In Lignin and Lignan Biosynthesis; Lewis, N. G., Sarkanen, S., Eds.; 
American Chemical Society Washington D.C., United States, 1998, p 131‐148. 

(10)  Ralph, J.; Peng, J. et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999, 47, 2991‐2996. 

(11)  Lawoko, M.; Henriksson, G. et al. Holzforschung 2006, 60, 156‐161. 

(12)  Matthieu, C.; Katia, R. et al. The Plant Journal 2001, 28, 271‐282. 

(13)  Bryce, J. R. G. In Pulp and Paper, Chemistry and Chemical Technology, 3rd Edition; Casey, J. P., Ed.; Wiley: New 
York, 1980; Vol. 1. 

(14)  Gardon, J. L.; Mason, S. G. Canadian Journal of Chemistry 1955, 33, 1491‐1501. 

(15)  Rezanowich, A.; Goring, D. A. I. Journal of Colloid Science 1960, 15, 452‐471. 

(16)  Yean, W. Q.; Rezanowich, A. et al. In Chimie et Biochimie de la Lignine, de la Cellulose et Hemicelluloses, Actes de 
Symposium International de Grenoble; Grenoble, France: 1964, p 327‐343. 

(17)  Goring, D. A. I. In Lignins; Sarkanen, K. V., Ed.; Interscience: New York, 1971, p 695‐768. 

(18)  Browning, W. C. Applied Polymer Symposia 1975, 28, 109‐124. 

(19)  Rezanowich, A.; Yean, W. D. et al. Journal of Applied Polymer Science 1964, 8, 1801‐1812. 

(20)  Luner, P.; Kempf, U. Tappi 1970, 53, 2069‐2076. 

(21)  Kerr, A. J.; Goring, D. A. I. Canadian Journal of Chemistry 1975, 53, 952‐959. 

(22)  Goring, D. A. I.; Vuong, R. et al. Journal of Applied Polymer Science 1979, 24, 931‐936. 

(23)  Kontturi, A. K.; Kontturi, K. et al. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions 1991, 87, 1779‐1783. 

(24)  Myrvold, B. O. Industrial Crops and Products 2008, 27, 214‐219. 

(25)  Vainio, U.; Lauten, R. A. et al. Langmuir 2008, 24, 7735‐7743. 

(26)  Will, R.; Yokose, K. “Chemical economics handbook, Product review: Lignosulfonates.” Chemical Industry 
Newsletter, SRI Consulting, 2005. 

(27)  Gargulak, J. D.; Lebo, S. E. ACS Symposium Series 2000, 742, 304‐320. 

(28)  Busch, R.; Hirth, T. et al. Biotechnology Journal 2006, 1, 770‐776. 

(29)  Mindess, S.; Young, J. F. Concrete; Prentice‐Hall: Englewood Cliffs, NJ. United States, 1981. 

(30)  Aïtcin, P.‐C. Binders for Durable and Sustainable Concrete Taylor & Francis: New York, N.Y., United States, 
2008. 

(31)  Aïtcin, P.‐C. High‐Performance Concrete; E & FN Spon: New York, 1998. 

(32)  Ramachandran, V. S.; Fledman, R. F. Cement Technology 1971, 2, 121‐129. 

50 
 
(33)  Ramachandran, V. S. Cement and Concrete Research 1972, 2, 179‐194. 

(34)  Collepardi, M. In Concrete Admixtures Handbook. Properties, Science and Technology; Ramachandran, V. S., 
Ed.; Noyes Publications: Park Ridge, N.J. United States, 1995, p 286‐396. 

(35)  Uchikawa, H.; Hanehara, S. et al. Cement and Concrete Research 1997, 27, 37‐50. 

(36)  Blick, R. L.; Peterson, C. F. et al. American Concrete Institute SP‐46 1974, 141‐166. 

(37)  Newman, J.; Ban Seng, C. Advanced Concrete Properties; Butterworth‐Heinemann: Oxford, 2003; Vol. 2. 

(38)  Rixom, M. R.; Mailvaganam, N. P. Chemical Admixtures for Concrete; 3rd ed.; E & FN Spon: New York, 1999. 

(39)  Shonaka, M.; Kitagawa, K. et al. American Concrete Institute, SP 1997, SP‐173, 599‐614. 

(40)  Andersen, P. J. Cement and Concrete Research 1986, 16, 931‐40. 

(41)  Andersen, P. J.; Roy, D. M. et al. Cement and Concrete Research 1987, 17, 805‐13. 

(42)  Jolicoeur, C.; Nkinamubanzi, P. C. et al. American Concrete Institute, SP 1994, SP‐148, 63‐88. 

(43)  Plank, J. Applied Microbiology and Biotechnology 2004, 66, 1‐9. 

(44)  Stern, T.; Schwarzbauer, P. For. Prod. J. 2008, 58, 81‐86. 

(45)  Reknes, K. In International RILEM Symposium on Self‐compacting Concrete Stockholm, Sweden, 1999. 

(46)  BIBM; CEMBUREAU et al., The European Guidelines for Self‐Compacting Concrete Specification, 
Production and Use, 2005. 

(47)  Tiemann, F.; Haarmann, W. Angewandte Chemie 1874, 7, 608‐623. 

(48)  Hocking, M. B. Journal of Chemical Education 1997, 74, 1055‐1060. 

(49)  Messerschmidt, A. Multi‐Copper Oxidases; World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.: Singapore, 1997. 

(50)  Messerschmidt, A.; Huber, R. European Journal of Biochemistry 1990, 187, 341‐352. 

(51)  Nakamura, K.; Go, N. Cellular and Molecular Life Sciences 2005, 62, 2050‐2066. 

(52)  Li, K.; Xu, F. et al. Applied and Environmental Microbiology 1999, 65, 2654‐2660. 

(53)  Berka, R. M.; Schneider, P. et al. Applied and Environmental Microbiology 1997, 63, 3151‐3157. 

(54)  Yoshitake, A.; Katayama, Y. et al. Journal of General Microbiology 1993, 139, 179‐185. 

(55)  Ducros, V.; Brzozowski, A. M. et al. Nature Structural Biology 1998, 5, 310‐316. 

(56)  Ducros, V.; Brzozowski, A. M. et al. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography 2001, D57, 
333‐336. 

(57)  Hakulinen, N.; Kiiskinen, L.‐L. et al. Nature Structural Biology 2002, 9, 601‐605. 

(58)  Hakulinen, N.; Kruus, K. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 2006, 350, 929‐934. 

(59)  Bertrand, T.; Jolivalt, C. et al. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography 2002, 58, 319‐321. 

(60)  Piontek, K.; Antorini, M. et al. Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 37663‐37669. 

(61)  Polyakov Konstantin, M.; Fedorova Tatyana, V. et al. Acta crystallographica. Section D, Biological 
crystallography 2009, 65, 611‐7. 

(62)  Kumar, S. V. S.; Phale, P. S. et al. Biotechnology and Bioengineering 2003, 83, 386‐394. 

(63)  Bourbonnais, R.; Paice, M. G. FEBS Letters 1990, 267, 99‐102. 

(64)  Eggert, C.; Temp, U. et al. ACS Symposium Series 1996, 655, 130‐150. 

(65)  Bollag, J. M.; Leonowicz, A. Applied and Environmental Microbiology 1984, 48, 849‐854. 

(66)  Kojima, Y.; Tsukuda, Y. et al. Journal of Biological Chemistry 1990, 265, 15224‐15230. 

(67)  Petersen, L. C.; Degn, H. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) ‐ Enzymology 1978, 526, 85‐92. 

(68)  Solomon, E. I.; Sundaram, U. M. et al. Chemical Reviews (Washington, D. C.) 1996, 96, 2563‐2605. 

51 
 
(69)  Reinhammar, B.; Vanngard, T. I. European Journal of Biochemistry 1971, 18, 463‐468. 

(70)  Reinhammar, B. R. M. Biochimica et Biophysica Acta, Bioenergetics 1972, 275, 245‐259. 

(71)  Yoshida, H. Journal of the Chemical Society, Transactions 1883, 43, 472‐486. 

(72)  Bertrand, G. Bulletin de la Societe Chimique de France 1894, 11, 717‐721. 

(73)  Bertrand, G. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de lʹAcademie des Sciences 1896, 123, 463‐465. 

(74)  Keilin, D.; Mann, T. Nature (London, United Kingdom) 1939, 143, 23‐24. 

(75)  Tissieres, A. Nature (London, United Kingdom) 1948, 162, 340‐341. 

(76)  Sato, Y.; Wuli, B. et al. Journal of Plant Research 2001, 114, 147‐155. 

(77)  Levine, W. G. In Proceedings of the Symposium on Copper in Biological Systems; Academic Press, New York: 
Harriman, N.Y., United States, 1965, p 371‐387. 

(78)  Gregory, R. P. F.; Bendall, D. S. Biochemical Journal 1966, 101, 569‐581. 

(79)  Leonard, T. J. Journal of Bacteriology 1971, 106, 162‐167. 

(80)  Thakker, G. D.; Evans, C. S. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 1992, 37, 321‐323. 

(81)  Harkin, J. M.; Obst, J. R. Science 1973, 180, 296‐298. 

(82)  Goldberg, R.; Le, T. et al. Journal of Experimental Botany 1985, 36, 503‐510. 

(83)  Freudenberg, K.; Harkin, J. M. et al. Chemische Berichte 1958, 91, 581‐590. 

(84)  Sterjiades, R.; Dean, J. F. D. et al. Plant Physiology 1992, 99, 1162‐1168. 

(85)  Lewis, N. G.; Davin, L. B. et al. Comprehensive Natural Products Chemistry 1999, 3, 617‐745. 

(86)  Boudet, A.‐M. Plant Physiology and Biochemistry (Paris) 2000, 38, 81‐96. 

(87)  Froehner, S. C.; Eriksson, K. E. Journal of Bacteriology 1974, 120, 458‐465. 

(88)  Schlosser, D.; Grey, R. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 1997, 47, 412‐418. 

(89)  Kersten, P. J.; Kalyanaraman, B. et al. Biochemical Journal 1990, 268, 475‐480. 

(90)  Xu, F. Journal of Biological Chemistry 1997, 272, 924‐928. 

(91)  Harvey, P. J.; Schoemaker, H. E. et al. FEBS Letters 1986, 195, 242‐246. 

(92)  Bourbonnais, R.; Leech, D. et al. Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects 1998, 1379, 381‐390. 

(93)  DʹSouza‐Ticlo, D.; Sharma, D. et al. Marine Biotechnology 2009, 11, 725‐737. 

(94)  Xu, F.; Shin, W. et al. Biochimica et Biophysica Acta 1996, 1292, 303‐11. 

(95)  Solis‐Oba, M.; Ugalde‐Saldivar, V. M. et al. Journal of Electroanalytical Chemistry 2005, 579, 59‐66. 

(96)  Gamelas, J. A. F.; Tavares, A. P. M. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2005, 33, 57‐64. 

(97)  Xu, F.; Deussen, H.‐J. W. et al. European Journal of Biochemistry 2001, 268, 4169‐4176. 

(98)  Xu, F.; Li, K. et al. Progress in Biotechnology 2002, 21, 89‐104. 

(99)  Bourbonnais, R.; Rochefort, D. et al. Tappi Journal 2000, 83, 68. 

(100)  Fabbrini, M.; Galli, C. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2002, 18, 169‐171. 

(101)  Bourbonnais, R.; Paice, M. G. et al. Applied and Environmental Microbiology 1997, 63, 4627‐4632. 

(102)  Crestini, C.; Argyropoulos, D. S. Bioorganic & Medicinal Chemistry 1998, 6, 2161‐2169. 

(103)  Ibarra, D.; Camarero, S. et al. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2006, 81, 1159‐1165. 

(104)  Call, H. P.; Mucke, I. Journal of Biotechnology 1997, 53, 163‐202. 

(105)  Camarero, S.; Garcia, O. et al. Enzyme and Microbial Technology 2004, 35, 113‐120. 

(106)  Felby, C.; Hassingboe, J. et al. Enzyme and Microbial Technology 2002, 31, 736‐741. 

52 
 
(107)  Hüttermann, A.; Mai, C. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 387‐384. 

(108)  Lund, M.; Ragauskas, A. J. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 699‐703. 

(109)  Chandra, R. P.; Ragauskas, A. J. Enzyme and Microbial Technology 2002, 30, 855‐861. 

(110)  Lazar, T. Color Research & Application 2005, 30, 313‐314. 

(111)  Cooper, P. Journal of the Society of Dyers and Colourists 1993, 109, 97‐100. 

(112)  Abadulla, E.; Tzanov, T. et al. Applied and Environmental Microbiology 2000, 66, 3357‐3362. 

(113)  Hou, H.; Zhou, J. et al. Process Biochemistry (Oxford, United Kingdom) 2004, 39, 1415‐1419. 

(114)  Setti, L.; Giuliani, S. et al. Enzyme and Microbial Technology 1999, 25, 285‐289. 

(115)  Minussi, R. C.; Pastore, G. M. et al. Trends in Food Science & Technology 2002, 13, 205‐216. 

(116)  Selinheimo, E.; Kruus, K. et al. Journal of Cereal Science 2006, 43, 152‐159. 

(117)  Kuznetsov, B. A.; Shumakovich, G. P. et al. Biosensors & Bioelectronics 2001, 16, 425. 

(118)  Riva, S. Trends in Biotechnology 2006, 24, 219‐226. 

(119)  Aaslyng, D.; Rensen, N. H. et al. Patent # [5948121], USPTO 1998 

(120)  Kawai, S.; Umezawa, T. et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 1988, 262, 99‐110. 

(121)  Crawford, R. L. Lignin Biodegradation and Transformation; Wiley‐Interscience: New York, N.Y., United 
States, 1981. 

(122)  Higuchi, T. Wood Science and Technology 1990, 24, 23‐63. 

(123)  Castro, A. I. R. P.; Evtuguin, D. V. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2003, 22, 13‐20. 

(124)  Higuchi, T. In Plant Cell Wall Polymers; American Chemical Society: 1989; Vol. 399, p 482‐502. 

(125)  Rittstieg, K.; Suurnaekki, A. et al. Biotechnology Progress 2003, 19, 1505‐1509. 

(126)  Kim, S.; Silva, C. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2010, 1‐7. 

(127)  Mattinen, M.‐L.; Kruus, K. et al. FEBS Journal 2005, 272, 3640‐3650. 

(128)  Potthast, A.; Rosenau, T. et al. Holzforschung 1999, 53, 175‐180. 

(129)  Ko, C.‐H.; Chen, S.‐S. Bioresource Technology 2008, 99, 2293‐2298. 

(130)  Kurisawa, M.; Chung, J. E. et al. Biomacromolecules 2003, 4, 1394‐1399. 

(131)  Ikeda, R.; Sugihara, J. et al. Polymer International 1998, 47, 295‐301. 

(132)  Desentis‐Mendoza, R. M.; Hernández‐Sánchez, H. et al. Biomacromolecules 2006, 7, 1845‐1854. 

(133)  Pajunen, A.; Karhunen, P. et al. Acta Crystallographica, Section C: Crystal Structure Communications 1996, C52, 
1815‐1817. 

(134)  Pew, J. C.; Connors, W. J. Journal of Organic Chemistry 1969, 34, 580‐584. 

(135)  Lundquist, K.; Kristersson, P. The Biochemical Journal 1985, 229, 277‐279. 

(136)  Bollag, J. M.; Liu, S.‐Y. et al. Soil Biology & Biochemistry 1982, 14, 157‐163. 

(137)  Ishihara, T.; Ishihara, M. Mokuzai Gakkaishi 1975, 21, 323‐325. 

(138)  Larsson, S.; Miksche, G. E. Acta Chemica Scandinavica (1947‐1973) 1969, 23, 3337‐3351. 

(139)  Ralph, J.; Peng, J. et al. Tetrahedron Letters 1998, 39, 4963‐4964. 

(140)  Peng, J.; Lu, F. et al. Phytochemistry 1998, 50, 659‐666. 

(141)  Kratzl, K.; Claus, P. et al. Wood Science and Technology 1974, 8, 35‐49. 

(142)  Brunow, G.; Lundquist, K. et al. In Analytical Methods in Wood Chemistry, Pulping, and Papermaking; 
Sjöström, E., Alén, R., Eds.; Springer‐Verlag Berlin And Heidelberg Gmbh & Co. Kg: Berlin, 1999, p 77‐124. 

53 
 
(143)  Holmgren, A.; Brunow, G. et al. Organic & Biomolecular Chemistry 2006, 4, 3456‐3461. 

(144)  Sjöström, E. Wood Chemistry: Fundamentals and Applications; 2nd ed.; Academic Press: New York, 1993. 

(145)  Balogh, V.; Fetizon, M. et al. Angewandte Chemie, International Edition in English 1969, 8, 444‐445. 

(146)  Bocks, S. M.; Brown, B. R. et al. Proceedings of the Chemical Society 1962, 117. 

(147)  Cook, C. D. Journal of Organic Chemistry 1953, 18, 261‐266. 

(148)  Månsson, P.; Öster, R. Nordic Pulp & Paper Research Journal 1988, 3, 75‐81. 

(149)  Wang, R.; Chen, C.‐L. et al. Holzforschung 2004, 58, 622‐630. 

(150)  Evtuguin, D. V.; Rocha, G. et al. In 10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp Stockholm, 2008. 

(151)  Durán, N.; Esposito, E. Applied Catalysis B: Environmental 2000, 28, 83‐99. 

(152)  Hu, X.; Wang, P. et al. Bioresource Technology 2009, 100, 4963‐4968. 

(153)  Durán, N.; Rosa, M. A. et al. Enzyme and Microbial Technology 2002, 31, 907‐931. 

(154)  De Melo, J. V.; Bello, M. E. et al. Electrochimica Acta 1999, 44, 2405‐2412. 

(155)  Zhu, Y.; Kaskel, S. et al. Chemistry of Materials 2007, 19, 6408‐6413. 

(156)  Leonowicz, A.; Sarkar, J. M. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 1988, 29, 129‐135. 

(157)  Alcalde, M.; Bulter, T. et al. Journal of Biomolecular Screening 2005, 10, 624‐631. 

(158)  Walling, C. Accounts of Chemical Research 1975, 8, 125‐131. 

(159)  Henriksson, G.; Zhang, L. et al. Biochimica et Biophysica Acta, Protein Structure and Molecular Enzymology 
2000, 1480, 83‐91. 

(160)  Henriksson, G.; Ander, P. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 1995, 42, 790‐796. 

(161)  Suzuki Melissa, R.; Hunt Christopher, G. et al. Environmental microbiology 2006, 8, 2214‐23. 

(162)  Rydholm, S. A. Pulping Processes; Wiley‐lnterscience: New York, NY, United States, 1965. 

(163)  Zepp, R. G.; Faust, B. C. et al. Environmental Science and Technology 1992, 26, 313‐319. 

(164)  Levitt, L. S. Journal of Organic Chemistry 1955, 20, 1297‐1310. 

(165)  Lai, Y.‐Z.; Sarkanen, K. V. Tappi 1968, 51, 449‐453. 

(166)  Bailey, C. W.; Dence, C. W. TAPPI 1969, 52, 491‐500. 

(167)  Gartner, A.; Gellerstedt, G. Journal of Pulp and Paper Science 2000, 26, 448‐454. 

(168)  Gellerstedt, G. In Pulp and Paper Chemistry and Technology; Ek, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G., Eds.; 
Walter de Gruyter: Berlin, New York, 2009; Vol. 1: Wood Chemistry and Wood Botechnology  

(169)  Nugroho Prasetyo, E.; Kudanga, T. et al. Bioresource Technology 2010, 101, 5054‐5062. 

(170)  Oster, R. Nordic Pulp & Paper Research Journal 1988, 3, 82‐86. 

(171)  “World Cement & Concrete Additives to 2012 ‐ Demand and Sales Forecasts, Market Share, Market Size, 
Market Leaders”, The Freedonia Group, 2008. 

 
   

54 
 
VIII Errata‐list 
Paper I: 

Page 22, Section ”Enzymes”, lines 5 and 6: 
“…0.4 for NS51002 and 0.7 for NS51003…” should read “…0.7 for NS51002 and 0.5 for 
NS51003…”. 
Page 25, Table 1: 
Compound III should not contain a methyl group at the Cα carbon. 

Page 25, left column, line 1: 
…low pH will lead to…” should read “…high pH will lead to…”. 
Page 28, left column, lines 16‐17: 
 “…high‐oxidation potential NS51003...” should read “…low‐redox potential NS51003...”. 
Page 28, left column, lines 18‐19: 
“…low‐oxidation potential NS51002...” should read “…high‐redox potential NS51002...”. 
 

Paper III: 

Page 907, right column, line 2: 
“… oxidize non‐phenolic end groups…” should read “…oxidize phenolic end groups with high 
oxidation potential…” 
Page 907, right column, line 4: 
“…only phenolic end groups…” should read “…only low‐oxidation potential phenolic end 
groups…” 
Page 908, right column, line 1: 
“…phenolic and nonphenolic end groups…” should read “…high‐ and low‐oxidation potential 
phenolic end groups…” 
 

Paper IV: 

Figure 10, compound 3: 

H H H H H H H H
H3C CH3 H3C CH3
H n H m H n H m
COOH COO-SO 3H COOH SO 3H

3 3
 should be    

55