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PF‑07302048：
SARS‑CoV‑2  刺突糖蛋白  (P2  S)  作为疫苗抗原  VR‑VTR‑10741  的结构和生物物理特性，
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标题：  SARS‑CoV‑2  刺突糖蛋白的结构和生物物理特性
(P2  S)  作为疫苗抗原

研究编号：
不适用

母体化合物编号：  PF‑07302048

替代化合物标识符：  N/A

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辉瑞发现科学
东角道
康涅狄格州格罗顿

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标题：  SARS‑CoV‑2  刺突糖蛋白的结构和生物物理特性
(P2  S)  作为疫苗抗原

首席研究员： (二)  (6)

贡献科学家：  (b)  (6)

编制：

(二)  (6)

由...批准：

(二)  (6)
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标题：  SARS‑CoV‑2  刺突糖蛋白的结构和生物物理特性
(P2  S)  作为疫苗抗原

概要

从编码与  BNT162b2  RNA  相同氨基酸序列的  DNA  表达的  SARS‑CoV‑2  P2  S  的结合和结构分析表明，
编码的  P2  S  抗
原真实地呈现  ACE2  结合位点和  SARS‑CoV‑2  中和靶向的其他表位抗体。

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目录

概要................................................. ..................................................... ...................................3

表格清单...................................................... ..................................................... .....................4

图表 ............................................................... ..................................................... .........4

1.  目标...................................................... ..................................................... .....................................5

2.  简介 ............................................................... ..................................................... .....................5

3.  材料和方法................................................................ ...................................................6

3.1.与细胞表面表达的  P2  S  结合的流式细胞术分析......................................6
3.2.  P2  S  表达和纯化 ............................................................... ...................................6
3.3.  P2  S  与固定化人  ACE2  的结合动力学和中和
通过生物层干涉法制备单克隆抗体 ............................................................... .........6
3.4.  P2  S  的冷冻电镜...................................... ..................................................... .........7
4.  结果与讨论................................................................ ...................................................9

5.  结论...................................................... ..................................................... ...................................12

6.  偏差................................................ ..................................................... .....................12

7.  参考 ............................................................... ..................................................... ...................................12

表格清单

表格1。 CryoEM  数据收集、 3D  重建和细化统

计...................................................... ..................................................... ............8

图表清单

图1。 与细胞表面表达的重组  P2  S  的结合................................................9
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图  2。 用于  P2  S  与  ACE2‑PD  和  B38  mAb  结合的生物层干涉测量传感
图 ............................................... .....................................................  .10
图  3。 分辨率为  3.29  Å  的  CryoEM  P2  S  结构................................................  11

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标题：  SARS‑CoV‑2  刺突糖蛋白的结构和生物物理特性
(P2  S)  作为疫苗抗原

学号： 不适用

职能领域：
医学科学

测试设施：  Pfizer  Discovery  Sciences,  Eastern  Point  Road,
康涅狄格州格罗顿

研究/测试启动日期：  2020  年  4  月  7  日

研究/测试完成日期：  2020  年  8  月  19  日

1.  目标

本研究的目的是表达和表征  BNT162b2  编码的疫苗抗原。

2.  简介

2019  年冠状病毒病  (COVID‑19)  疫苗（BioNTech  代码编号  BNT162，
辉瑞代码编号  PF‑07302048）
是一
种旨在预防  COVID‑19  的研究疫苗， 该疫苗由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒  2  (SARS‑CoV‑2)  引起).

冠状病毒S是病毒中和抗体的主要靶标，
是疫苗研发的关键抗原。  S  是一种跨膜糖蛋白，
负责受体识别、
附着于细
胞以及病毒包膜与宿主细胞膜融合，
从而导致基因组释放。
虽然膜近端  S2  负责膜融合，
但膜远端  S1  及其受体结合
域  (RBD)  可识别宿主受体血管紧张素转换酶  2  (ACE2)（Zhou  等人，
2020  年） 。  RBD  在  S  三聚体上形成膜远
端“头”，
通过铰链连接到身体。
在原生  S  中，
RBD  在打开（向上）
和关闭（向下）
位置之间交替。
尽管当  RBD  处于“低
头”
闭合构象时，
已经描述了有效的中和表位，
但“低头”
受体可及构象暴露了潜在更广泛的中和抗体靶标（Brouwer  等人，
2020  年；
Liu  等人，
2020年；  Robbiani  等人，
2020  年）。

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候选疫苗  BNT162b2  编码的糖蛋白包括脯氨酸  (P2  S)  的两个氨基酸取代，
将跨膜蛋白锁定在抗原性最佳融合前构
象中（Pallesen  等人，
2017  年；  Wrapp  等人，
2020  年）。  P2  S  抗原由  DNA  表达，
其结构特征以及与人类  ACE2  和  
SARS‑CoV‑2  中和抗体的结合特征。

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3.  材料和方法

3.1.与细胞表面表达的  P2  S  结合的流式细胞术分析根据提供的  Expifectamine  293  转染试剂盒方

案，
在  CAG  启动子控制下编码  P2  S  抗原的修饰  pcDNA3.1  Zeo  (+)  构建体在  Expi293F  细胞中表达。

转染后  48  小时收集细胞， 用  TBS  缓冲液洗涤， 并以  4‑5  x  104  的比例用于每种条件。 细胞在室

温  (RT)  中在  TBS  +  4%  BSA  +  0.01  mg/mL  7‑AAD  中孵育  1  小时以检测非活细胞， 并使用  (i)  
1:100  FITC  标记的抗  6xHis  加  10  nM  His  标记的人类  ACE2  肽酶结构域  (ACE2‑PD)；  (ii)  100  
nM  Alexa‑488  标记的抗兔  IgG  Fab  加上  33  nM  抗  SARS‑CoV‑2  Spike  RBD（αRBD， Sino  
Biological  40592‑T62）， 抗  SARS‑Cov‑2  Spike  S1（αS1， Sino  Biological  40150‑R007)，
或
抗SARS  Spike  S2  (αS2,  Novus  NB100‑56578)； 或  (iii)  100  nM  Alexa‑488  标记的抗人  IgG  
Fab  加上  33  nM  CR3022  治疗性抗体  (αCR3022)  （Yuan  等人， 2020  年）、  B38  中和抗体  
(αB38)  或  H4  中和抗体  (αH4)  （Wu  等人等人， 2020  年）。 用  TBS  洗涤细胞， 然后使用  Guava  
EasyCyte  HT  流式细胞术系统在  V  形底  96  孔板中进行分析。 对于每个条件， 测量三个重复， 每个
重复收集  3000  个事件。

3.2.  P2  S表达和纯化

为了表达由  BNT162b2  编码的  SARS‑CoV‑2  P2  S  以进行生物物理表征， 一个编码全长  SARS‑CoV‑2  尖
峰（GenBank： MN908947） 的基因在残基  986  和  987（K986P  和  V987P）
处被两个脯氨酸取代， 然后是一
个C  端  HRV3C  蛋白酶位点和  TwinStrep  标签被克隆到带有  CAG  启动子的改良  pcDNA3.1(+)  载体中。  
TwinStrep  标记的  P2  S  在  Expi293F  细胞中表达。

重组蛋白的纯化基于先前描述的程序，
稍作修改（Cai  等人，
2020  年）。
细胞裂解后，
P2  S  溶解在  1%  NP‑40  洗涤剂中。
然后用  0.5%  NP‑40  中的  StrepTactin  Sepharose  HP  树脂捕获  TwinStrep  标记的蛋白质。  P2  S  通过尺寸排阻色谱
法进一步纯化，
并如先前报道的那样在  0.02%  NP‑40  中洗脱为三个不同的峰（Cai  等人，
2020  年）。
结构表征中使用了
一个由完整的  P2  S  在  150  kDa  左右迁移以及解离的  S1  和  S2  亚基（在略高于  75  kDa  时共同迁移）
组成的峰。

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S1  和  S2  亚基的自发解离发生在整个蛋白质纯化过程中，
从洗涤剂介导的蛋白质提取点开始，
因此  P2  S  制剂也包含解离
的  S1  和  S2。

3.3.  P2  S  与固定化人  ACE2  和生物层干涉法中和单克隆抗体的结合动力学

NP‑40  溶解、 纯化的  P2  S  与  ACE2‑PD  和人中和单克隆抗体  B38  （Wu  等人， 2020  年） 的结合是

在  Octet  RED384  (FortéBio)  上通过生物层干涉法在  25  °C  下测量的。 在  25  mM  Tris  pH  7.5、
150  mM  NaCl、
1  mM  EDTA  和  0.02%  NP‑40  中测量  P2  S  结合。  Avi  标记的人类  ACE2‑PD  被固定在链霉亲和素涂层的传感
器上；  B38  抗体固定在蛋白  G  涂层传感器上。 为了

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在  P2  S  浓度系列中， 在  120  秒的初始基线平衡后， 将传感器浸入  Avi  标记的  ACE2‑PD  或  B38  mAb  的  

10  µg/mL  溶液中  300  秒，以使用阈值函数实现  1  nM  的捕获水平。
然后， 在另一个  120  秒的基线后， 收集结合
数据  300  秒的关联和  600  秒的解离。

使用  Octet  Data  Acquisition  软件版本  10.0.0.87  收集生物层干涉测量数据，
并使用  FortéBio  数据分
析软件版本  10.0  进行处理。 数据被减去参考值并拟合到R2值大于  0.95  的1:1  结合模型， 以确定使用  
Octet  数据分析软件  v10.0  (FortéBio)  的动力学和结合亲和力。

3.4.  P2  S  的冷冻电镜
对于  TwinStrep  标记的  P2  S， 将  0.5  mg/mL  的  4  μL  纯化蛋白应用于新覆盖氧化石墨烯的金  
Quantifoil  R1.2/1.3  300  目网格。 使用  Vitrobot  Mark  IV  以  ‑2  的力吸干样品  4  秒， 然后投入到由液氮冷却
的液态乙烷中。 从两个同样制备的网格中收集了  27,701  张显微照片。 在  ‑1.2  至  ‑3.4  μm  的散焦范围内从每
个网格收集数据， 总电子剂量分别为  50.32  和  50.12  e‑ /Å2 ， 在  6  秒曝光期间分为  40  帧， 分别为  1.26  和  
1.25  e‑ /  Å2 /帧。在  Warp  (Tegunov  &  Cramer,  2019)中执行了动态运动校正、 CTF  估计以及框大小为  450  
像素的粒子拾取和提取， 在此期间超分辨率数据被分箱以提供  0.87  的子。 像素大小A。
所有后续处理均在  总共提取了   RELION  
1,119,906  
3.1‑beta  
个粒
中进行（Zivanov  等人， 2018  年）。 通过  2D  和  3D  分类过滤掉粒子异质性， 产生一组  73,393  个粒子， 这些粒
子细化到  3.6  Å， 具有  C3  对称性。 该数据集的  3D  分类没有粒子对⻬， 用单个  RBD  向上分离出一个类别， 代表  
15,098  个粒子。 剩余的  58,295  个粒子， 在三个  RBD“向下” 构象中， 被精炼以给出  3.29  Å  的最终模型。 来自  
PDB  ID  6XR8  （Cai  等人， 2020  年）的原子模型被刚体拟合到地图密度中， 然后使用  Phenix  中的真实空间细
化（Adams  等人， 2010  年） 灵活地拟合到密度， 交替使用  Coot  中的手动构建（Emsley  等人， 2010  年）。 表1
列出了数据收集、 3D  重建和模型细化统计数据。

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表  1.  CryoEM  数据收集、
3D  重建和优化统计
数据采集

电镜设备 Titan  Krios（赛默飞世尔科技）
300
电压（千伏）
探测器 K2峰会

能量过滤器 Gatan  GIF，
20  EV  狭缝  
标称放大倍率 165,000  x  0.435
像素大小  (Å) （超分辨率）
网格  1  网格  2

电子剂量  (e‑ /Å2 ) 50.32 50.12

剂量率  (e‑ /Å2 /sec) 8.4 8.33
散焦范围  ( m) ‑1.2  至  ‑3.4 ‑1.2  至  ‑3.4
收集的显微照片数量 10,422 17,279
所选显微照片数量 27,701
3D重建
软件  使用的 扭曲，宗教  
粒子数  施加对称性  全局分辨率   58,295
(Å) C3

傅里叶壳校正  =  0.143  应用  B  因子  (Å2 ) 3.29
‑50
求精
软件 凤凰城  2,919  
蛋白质残留物 0.82
地图相关系数
均方根偏差
键长  (Å) 0.011
键角  ( ) 0.962
Ramachandran  图统计  (%)：
首选 90.4
允许 9.59
异常值 0
不良旋转异构体  (%) 11月06日

MolProbity分数 2.96
2.23
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EMRinger评分
冲突分数（所有原子） 13.23

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4.  结果与讨论

为了确认未标记的  P2  S  的表面表达以及  P2  S  与人类  ACE2  结合的能力，
对非透化细胞进行了流式细胞术实验
（图  1）。  RBD、
S1  和  S2  抗体与  Alexa‑488  抗  IgG  Fab  预孵育进行染色，
并使用核酸染料分离活细胞和死细
胞。
为了确认人类  ACE2  的结合，
P2  S  表达细胞用人类  ACE2  的细胞外结构域标记，
并与针对  ACE2  上亲和标签的  FITC  
标记抗体预孵育。
最后，
从  COVID‑19  恢复期患者中分离出的抗  RBD  人中和抗体  B38  和  H4  (Wu  et  al,  2020)以及抗  
RBD  治疗性抗体  CR3022  (Yuan  et  al,  2020)同样被证实可结合表面表达的P2  S。

图  1.  与细胞表面表达的重组  P2  S  的结合

P2  S  抗原在  Expi293F  细胞中表达，
并通过针对全长  S  蛋白的  RBD、
S1  和  S2  区域的抗体染色来证实表面表达。
人类  ACE2  肽酶结构域以及治
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疗性抗体  CR3022  和从  COVID‑19  康复患者中分离的两种中和抗体  B38  和  H4  被进一步证实与表面表达的  P2  S  结合。
使用核酸染料  7‑AAD  鉴定
活体单元格（流量图中的下象限）。
结合到表面表达的  P2  S  在活细胞中的背景在条形图中的复制中被量化。

对于结构和生物物理表征， P2  S  在  Expi293F  细胞中表达， 来自编码与  BNT162b2  RNA  相同氨基酸序列的  

DNA， 并添加了用于亲和纯化的  C  末端  TwinStrep  标签。 纯化后，如方法中所述， P2  S  在  0.02%  NP‑40  中洗
脱为三个不同的峰， 如先前报道的那样（Cai  等人， 2020  年）。来自尺寸排阻柱第一个峰的蛋白质， 包含完整
的  P2  S  和解离的  S1  和  S2，
通过生物层干涉法进行测定（图2）。 三聚体

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P2  S  与人  ACE2‑PD  结合，
抗  RBD  人中和抗体  B38  具有高亲和力（表观KD  =  1  nM）。

图  2.  P2  S  与  ACE2‑PD  和  B38  mAb  结合的生物层干涉传感图

在  Expi293F  细胞中表达的带有  C  端  TwinStrep  标签的  P2  S  被洗涤剂溶解并通过亲和和尺寸排阻色谱法纯化。 来自尺寸排阻柱
第一个峰的蛋白质， 包含完整的  P2  S  和解离的  S1  和  S2，
通过生物层干涉法在  Octet  RED384  (FortéBio)  上于  25  °C  在由  25  mM  
Tris  pH  7.5、
150  mM  组成的运行缓冲液中进行测定NaCl、 1mM  EDTA  和  0.02%  NP‑40。

传感图显示  TwinStrep  标记的  P2  S  与固定化A、
人  ACE2‑PD  和B、
B38  单克隆抗体的结合动力学。  P2  S  的最高测试浓度为  71  nM，
再进行  2  次  
3  倍稀释。
结合曲线全局拟合R2值大于  0.95  的  1:1  Langmuir  结合模型。
实际绑定数据（黑色）
和最适合  1:1  绑定模型的数据（绿色）。
图中提供
了表观动力学参数。

使用  cryoEM  对纯化的  TwinStrep  标记的  P2  S  进行了结构表征。 来自  cryoEM  数据的粒子
的二维分类显示粒子群与  SARS‑CoV‑2  刺突蛋白的预融合构象非常相似（图3A）。 对该数据集的
处理和改进产生了标称分辨率为  3.29  Å  （图3B） 的高质量  3D  地图，其中安装并重建了先前发布的原子模
型（PDB  ID：6VSB）。重建模型（图3C） 与报道的融合前全长野生型  S  （Cai  等人， 2020  年）
及其具有  P2  
突变的胞外域（Wrapp  等人， 2020  年） 的结构非常一致。 数据集的三维分类（图3D） 显示一类粒子位于一
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个  RBD“向上” （可用于受体结合）、 两个  RBD“向下” （闭合） 构象中，占三聚体分子的  20.4%。

其余的都处于所有  RBD“向下” 构象。 与结构的其他部分相比，

“向上”
构象中的  RBD  的分辨率较低，
这表
明  RBD“向上” 和  RBD“向下” 状态之间存在构象灵活性和动态平衡，正如其他人所建议的那样（Cai  等
人， 2020  年；  Henderson ）
等人，2020  年）。

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图  3.  3.29  Å  分辨率下的  CryoEM  P2  S  结构

A.  从  cryoEM  显微照片中提取的  TwinStrep  标记的  P2  S  粒子的代表性二维类平均值。
框边：
39.2  nm。  B.  P2  S  三聚体的  RELION  金标准细化的傅里叶壳相关曲线。  C.  TwinStrep  标记的  P2  S  的  3.29  Å  cryoEM  图，
带有拟
合原子模型，
显示顶部（垂直于三重轴）
和侧面（平行于三重轴）
视图。  CryoEM  模型基于  PDB  6VSB，
并使用  Coot  中的手动重建和  Phenix  中的真
实空间细化将其安装到结构中。
使用在  300  kV  加速电压下运行的  Titan  Krios  电子显微镜收集了约  28,000  张显微照片，
并使用  Warp  和  RELION  
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进行了图像处理和  3D  重建。  D.  复合体的低温  EM  数据处理流程图，
显示  3D  类平均值。
由  3D  分类生成的  P2  S  地图表明  RBD  域定位存在一些异
质性。
每个类别中所代表的粒子群的百分比显示在模型下方。

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5.结论

我们证明  BNT162b2  RNA  序列编码重组  P2  S，
它可以真实地呈现  ACE2  结合位点和  SARS‑CoV‑2  中和抗体靶向的
其他表位。

细胞表面表达的  P2S  与人  ACE2  受体的结合，
并使用流式细胞术在细胞中确认了一组人中和单克隆抗体。
通过低
温  EM  确认从具有  BNT162b2  编码的  P2  S  氨基酸序列的  DNA  表达的蛋白质处于融合前构象。
该分析表明，
具有
重要抗原性的  RBD  可以呈现“向上”
构象，
其受体结合位点富含中和表位，
可在一定比例的分子中使用（ Zost  等人，
2020  年）。
观察到的替代状态反映了  RBD“向上”
和“向下”
位置之间的动态平衡（Cai  等人，
2020  年；
Henderson  
等人，
2020  年）。
表达和纯化的  P2  S  与  ACE2  和中和单克隆抗体的结合进一步证明了其构象和抗原完整性。

6.  偏差

不适用

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