Genetics 

Final Exam Review

Histones:
● 5 subunits: H1, H2a, H2b, H3, H4
● 1:2:2:2:2 = H1 by itself, the others form an octamer

Chromatin Structure:
● Chromatin: 60% protein (30% histones, 30% NHPs); 30% DNA; 10% RNA
● Nucleosome
○ Basic structural unit of euk chromosome
● ­10nm fiber, all the histones are very close to each other (not linker extended)
○ PR: 6
○ Octamer(and 2 wraps) + linker+ H1
● Solenoid
○ 30 nm fiber
○ Form solenoid using H1 and nucleosomes (6 per turn)
○ PR: 37
● Looped domains AKA Euchromatin
○ .5 um
○ Folded loops
○ PR: 1000
○ Each loop is the size of a replicon=100,000 bp
● Heterochromatin
○ Form a flower, many loops
○ PR: 8000
○ Two types
■ Facultative: can become euchromatin
● Involved in a form of gene regulation
■ Constitutive: always folded, centromeres, telomeres

Packing Ratio:
● = [Unfolded length] / [folded length]
○ No dimensions (ensure both numbers are same units)
● Represents how many times DNA is folded
● Smaller= less compressed DNA, and more accessible
● Packaging: method to regulate potential for expression: 1st level of control

Replication and Maintenance of Chromatin:
● Epigenetics: heritable difference in phenotype w/o a difference in genotype or DNA seq
○ Due to environmental changes in chromosome structure that are heritable
○ Chromatin modification is epigenetic: so you need a way to replicate it so you can
inherit it
● Modifications: ends of protein are susceptible to modifications
 ○ acetylation: activates (by HATS; removed by HDACs)
○ uniquination: not common
○ methylation: inactivates (By HP1/SuVs)
○ phosphorylation: unfolds chromatin for acetylation
○ these are semi­permanent changes; different tissues modified @ diff. times
● Replication
○ Parental nucleosome splits up into H3/H4 tetramer and 2 H2a/H2b dimers. The
old tetramer (which contains modifications) goes to one of the replicated DNA
helices while the other gets a newly synthesized tetramer. The dimers go to a
pool of dimers that old/new mix. Then the dimers go and fill in the nucleosomes,
so you can have either new or old tetramer and pairs of dimer that are new­new,
new­old, or old­old (pg 300)
○ Because half of the tetramers are newly synthesized, they don’t contain
modifications that old tetramers contain. These modifications are replicated.
■ Process for inactive chromatin (= Heterochromatin):
■ HP1 (Heterochromatin Binding Protein) will methylate adjacent to an old
methylated tetramer
■ HP1 recruits SuV through protein­protein interactions. SUV allows HP1 to
shift and keep methylating adjacent nucleosomes until reaching a
boundary element
■ Active chromatin (= Euchromatin) may be modified by acetylations via
HATs
● Maintainence/remodeling
○ NRC: nucleosome remodeling complex: remodels nucleosome to loosen things
up (become more expressed); ATP dependent
■ activators bind to DNA sites and recruit NRC which alters nucleosome
postion which allows the transcription machinery to bind to core promoter
■ different models: complex can slide nucleosome, restructure, or transfer
■ ex) SWI/SNF can do all three
○ Acetyl/Deacetylation
■ activators bind to DNA binding sites and aceylate Lysines of histones. This
makes it negative, so histones don’t want to bind, and you lose packing
(30 → 10) so promoter is accessible (done by HATS)
■ HDACS: removal of acetyl groups

3 Eukaryotic RNA Polymerases
these pols don’t interact directly with DNA in Euks; they involve GTF/activators, etc that bring PIC
● RNA Pol1
○ Nucleolus
○ transcribes some snRNA and rRNA: 18s, 28s,5.8s
○ NO TATA box
○ has an UCE (upstream control element) that basically acts as an enhancer seq.
and a Core element that overlaps the transcription initiation site
 ● RNA Pol2
○ nucleoplasm
○ mRNA
○ Has promoter like cis acting DNA sequence elements:
■ TATA Box: TATAAA @ ­25
● where PIC is built
■ CAAT Box: CCAAT @ ­75
■ GC Box: GGGCGG @ ­50 ­ ­100
■ has initiator seq: YAY @ +1 (spans initiation site)
○ has an enhancer seq, upstream element where activators can bind, and the
TATA box where GTFs can bind
○  
● RNA Pol3
○ nucleoplasm
○ tRNA, 5s rRNA, snRNA
○ they used linker scanning to find the important regions here: looked for loss of
function regions
○ but the important regions in RNA P3 are INTERNAL to the gene= ICR

Enhancers
● special DNA sequences are orientation dependent and can work from far distances
● help raise the basal level of transcription by having TF/activators bind to them
Activators and Coactivators
● GTFs: needed for basal level of transcription, bind to DNA seq.
○ used by all 3 RNA Pols.
● activators: chromatin remodeling, activate transcription, activation by recruiting
○ affect efficiency of transcription initiation
● coactivators,  have 2 domains: DNA binding domain, and transcription activation domain
○ binding DNA motifs
■ Zn finger: Zn binds 4 AA (2 Lys, 2 His) and set up an a helix and B ribbon
on opposite ends
● fits into major groover and interacts with exposed nucleotides
● found in TF3A: 7 binding sites, 9 fingers
■ Leucine zipper: forms coil coil interactions
● Leucines lined up and created a hydrophobic center and + charged
sides that interacts with ­ Pi backbone
● coactivators: large, multiprotein complex that does not bind directly to DNA but
participates in activations by interacting with both activators and TF
● repressors: have 2 domains; DNA binding, and repressing; counteract action of
activators
● regulatory factors bind to DNA seq (not TATA or ‘promoters’) and regulate certain fnc;
most bind at enhancer seq.
○ ex) CTF (CAAT transcription factor) binds to CCAAT box
 ○ ex) SP1 binds GC box

PIC:
●GTFs make up the PIC which allows a basal level of transcription (bit higher than basal
level in Pol 1, 3)
○ for pol1 and 3, basal level is about full level of transcription
● RNA Pol 1 (for rRNA)
○ UBF (= Upstream Binding Factor; this is an assembly factor): UBF binds to UCE
(directly binds to DNA)
○ SL1 (TAF): brought in by UBF through protein­protein interactions. Has TBP SU
which hovers above core
○ RNA Pol I: brought in by SL1 and starts
● RNA Pol 2 (for mRNA)
○ TF2D: binds to TATA box
■ Consists of TAF (TBP associated factor) + TBP (TATA binding protein;
actually binds to DNA)
■ TF2D binds in the minor groove and causes a small kink in DNA ­­ serves
in recognition for PIC building
○ TF2A and TF2B bind to TF2D,
■ TF2A: upstream of TATA; activates by removing TAF 1 (inhibitory TAF)
■ TF2B: downstream of TATA; determines direction of transcription
○ TF2F: Heterotetramer
■ 2 Large SU: Helicase activity­­ starts initiation
■ 2 Small SU: Behave like sigma factors­­ bring in RNA Pol II
○ TF2 E, H, J help with promoter clearance: force Pol2 to leave PIC and start
transcription
■ TF2E: Binds downstream of i site; has some helicase activity
■ TF2H: Major unit of promoter clearance
● ATPase activity: moves with Pol2 for elongation
● Helicase activity
● Kinase activity: phosphorylation (helps unfold chromatin for
replication) on serines and threonines
■ TF2J: thought to also be involved
● RNA Pol 3 (tRNA, 5S rRNA)
○ tRNA:
■ TF3C (Assembly factor) binds to Box A and B (Internal Control Elements)
■ TF3B (= TAF; initiation factor) binds upstream; contains TBP and serves
as location for initiation site; doesn’t bind to ICE DNA
■ RNA Pol 3: brought in by TF3B through protein­protein interactions
■ RNA Pol 3 starts behind the ICE A and B because those are internal to the
gene. Starting within gene would lead to loss of genetic information.
○ 5s rRNA:
■ TF3A (Assembly Factor) binds to box C
 ● Facilitates binding of TF3C
■ TF3C (Assembly Factor): binds to box A
■ TF3B (Initiation Factor): binds to TF3A/C (Does NOT bind to DNA)
■ RNA Pol III: brought in by TF3B

Major Protein complexes in replication/transcription:
● RNA Pol
● HATs/HDAC
● NRC (SWI/SNF)
● PIC

DNA sequence elements
● Reverse Genetics
○ Method used in Euk. to find out which sequences are important for transcription
○ Alterations in the gene → alterations in phenotype
○ Isolate DNA for a gene, make mutations, put DNA back in, observe phenotype
■ In Vivo: ­­­need to look up
■ In Vitro:
○ Classical Genetics: Make random mutations and observe phenotype →
characterize gene
■ Too many genes in Euk. for this method to be effective
● Linker scanning: method used to confirm consensus sequences/important DNA aspects
of ‘promoters’
○ Sequentially create a cluster of mutations at different locations, and keep moving
them until you affect transcription.
■ If transcription occurs, that area is unimportant
■ Loss of transcription: important sequence
○ Found two major areas that didn’t lead to transcription and they overlapped with
TATA, CAAT and GC box, so it  confirmed them as important

Combinatorial Gene Regulation
● Combining a few regulatory proteins to regulate transcription of multiple genes
● ex) pg 551: transcription of gene A is controlled by activators 1­4 and transcription of B is
controlled by activators 2, 4, 6

Galactose Utilization in Yeast
Know: binds activators to UASg (Upstream Activation Sequence = enhancer). These activators
have two domains: binding domain (Binds to DNA) and activating domain (Uses action at a
distance via looping to increase transcription levels by binding to PIC)
Gal4 is expressed in the absence of glucose and makes gal4p protein (Zn finger motif) which
goes and activates UASg which is similar to enhancer seq. and leads to divergent transcription
of the genes to make galactose.Another gene, gal80 makes gal80p which binds to gal4p and
represses (quenches) gal4’s activation= no transcription. With galactose present, gal3 gene
makes gal3 protein which converts glucose into an inducer that binds to gal80p and stop
quenching gal4p
­glucose causes the activation of repressor Mig1p which binds to URSg and blocks Gal4p for
transcription

Regulation by Steroid Hormones & Signal Transduction
● in animals, environmental effects don’t cause rapid changes in the body because we
have hormones that maintain homeostasis
● a hormone is an effector molecule that is produced by one cell and causes a
physiological change in another
● steroid hormones can pass through the membrane and bind to a cytoplasmic receptor
and then both can travel to the DNA and bind and affect it directly
● polypeptide hormones can’t travel through the membrane so they bind to cell surface
receptors and then activate a cascade of events
○ activate adenyl cyclase which produces cAMP (2nd messenger) which can go an
activate kinases which phosphorylate things and activate/inactivate them
○ this is called signal transduction: indirectly affects gene expression and amplifies
the effect of a signal molecule
● global regulation: single receptor/ligand pair activate multiple transcription factors which
can then affect multiple genes (broad)
○ you can also have a more specific kind where multiple receptor/ligand pairs
activate a single factor which affects a single gene
RNA PROCESSING: chapter 13, ph: 337­352

Splicing
● Euk transcription products must be processed before they can be translated because the
primary transcript contains introns and exons
● Introns: have no protein­encoding genetic information. Some introns encode for
information that pertains to splicing/self­removal
● Exons: have protein related genetic information that must be fused together after introns
are spliced out
● Splicing can happen with the help of a complex (= Spliceosome; mRNA) or by
self­catalysis (Group 1 and 2 Introns; rRNA, tRNA, and organelles)

Spliceosomal Introns: mRNA
● Primary transcript of mRNA must be processed: addition of 5’ cap, 3’ poly A tail, and
intron removal
● introns start with 5’ GU­RAGU, end with YNYYRAY­Y 11  NYAG­3’
● splicing occurs in complexes called spliceosomes [ribozyme] which have pre­mRNA
bound to snRNPs (snRNA+protein) which are really abundant in cells
● Process:
○ U1 snRNP binds to 5’ splice junction (GU) by bp interactions of snRNA in sRNP to
mRNA of splice site [forms commitment complex]
○ U1 helps recruit U2 through protein­protein interactions and it binds to the branch
site which is an A nucleotide upstream of the 3’ splice site
○ U4/U6 and U5 interact and binds to U1 and U2 causing the intron to loop and
bringing the two ends closer together
○ U4 and U1 both leave, forming the active spliceosome (U6 and U2 have the major
catalytic activity and form the core
○ double transesterification occurs; lariat structure formed, and intron spliced out,
releasing ligated exons
○ lariat is degraded by debranching enzyme and the sRNPs are recycled
○ each step requires ATP

Double Transesterification Reaction
● process by which one Phosphodiester bond is cleaved by hydrolysis and another one is
formed by condensation
● P bond between Exon1 and 5’ splice site (G) is cleaved and then the 5’ end of the intron
(G) is joined to the A branch point through an unusual 5’­2’ new phosphodiester bond that
results in a branch chain
● the second transesterification: the 3’ end of the intron is cleaved from the 2nd exon and
then a phosphodiester bond is formed between the two exons
● this results in the two exons ‘ligated’ together and a lariat structure of inton
*keep in mind that there is no actual ligasing or cutting taking place, the exons are connected
through a phosphodiester bond that is the result of a transesterification
see video: https://www.youtube.com/watch?v=El0jT5bAf9Y

Alternative Splicing
● form of RNA processing control
● used to produce different functional mRNAs and therefore different proteins (isoforms)
○ products are made from the same gene but differ structurally and functionally
● splicing to remove different variations of introns, leaving you with products of varied exon
combinations
● *on his slide: must keep the first gene and last gene because they have initiation and
termination information
○ total possible mRNA: all the combinations, make sure you include singe gene
skips, double gene skips, and triple gene skips (tip: the number of combinations is
2  number of genes minus the first and last
○ to find the total protein products: go through all mRNA transcripts and disregard
genes that follow the gene with a stop codon in them and then look for repeats

Alternative Polyadenylation
● another form of RNA processing
● similar to  polyadenylation because can produce different products
● an example of both polyadenylation and splicing: production of tissue specific products in
the CALC gene

Sex determination in drosophila flies:
● led to the question of why introns exist
○ intron early theory: introns are the basis for how genes come together, so there is
a selective advantage for having introns
■ introns → genes
○ intron late theory: introns are selfish DNA and try to perpetuate their existence­
they are mobile so they insert themselves into DNA to be replicated
■ genes → introns
● number of genes: our prediction for the number of genes we’d have was really far off,
only about 26,000 so very few in comparison, but we have alternative splicing and other
complex mechanisms that make us cool
● Flies:
○ males: don’t produce the sxl protein so they have a different splicing which results
in an incomplete tra protein synthesis which results in default male
characteristics to form
○ females: produce the sxl protein which binds to an exon that normally has a stop
codon in (like for male flies) and skips it, so it produces another alternative
splicing variation which leads to the formation of the tra protein and then female
like characteristics

Group 1 Introns: produces rRNA (17s, 5.8s, 26s): tetrahymena
 ● done through self­splicing= no spliceosome involved
● is a ribozyme
● has guanosine cofactor: 3’ OH of G is the attacking group and it cleaves the 5’ splice site
of the intron.
○ transesterification occurs: G adds onto intron’s 5’ site and the OH adds onto the
exon’s 3’ site
○ 2nd transesterification: exon 1 with OH at 3’ site attacks the exon 3’ splice site so
it creates another phosphodiester bond between the two exons and a 3’­5’ bond is
created in the inton
● the intron is left with a G nucleotide at the 3’ end which can bond to an internal nucleotide
and circularize through a 3rd transesterification

group 2: tetrahymena and organelles introns
● ribozyme
● same processing events as spliceosome (2’ 5’ bond, lariat, 2 transest., etc) but no
external aid­ internal splicing
● secondary structures have radial spokes and this gives it it’s 3D structure to help with
splicing
● also common motif for organelles: chloroplast and mitochondria
Intron Processing: slide 95 is good

GROUP 1 Introns= rRNA GROUP 2 Introns= Nuclear mRNA

organelles and tetrhymena (spliceosome)

dbl transesterification (can do dblr transesterfication dbl transesterification

a 3rd to circularize)

no lariat structure becauses lariat, A attacks lariat, A attacks

G attacks

self splicing self splicing Spliceosome needed

use 3’OH to make bond use 2’OH to make bond use 2’OH to make bond

tRNA Maturation/Processing
● tRNAs are transcribed by RNA Pol III
● Primary transcript contains a 5’ Leader Sequence, a 3’ Trailer Sequence and
sometimes introns
● Needs to be processed:
1. ­ 5’ leader sequence is cleaved by RNAase P (Ribozyme);
­ 3’ trailer sequence is cleaved by an Endonuclease (most organisms) or RNAase
D in E. Coli
 ­ Intron is cleaved by an Endonuclease and tRNA is rejoined by RNA Ligase
**Intron serves as a form of temporal regulation: blocks the anticodon
until it is spliced
2. ­ Bases are modified
­ CCA (where AA’s are added) is added to 3’ end by tRNA Terminal
Transferase: a polymerase­like enzyme that doesn’t use a template
3. → These steps create a mature tRNA which can then be recognized by tRNA
synthetase for AA addition

Intron Comparison (handout p. 98)

rRNA Maturation
● rRNAs are transcribed by RNA Pol I
● E. Coli
○ E. Coli rRNA Operon produces a polycistronic transcript which produces 16S,
23S, and 5S rRNA products, along with some tRNA
○ 16S/23S rRNA produce very big stem loops; Cleaved by RNAase III
○ 5S rRNA is cleaved by RNAase E
○ tRNA follows normal processing mechanisms/events
● Eukaryotic rRNA
○ Produced by ribosomal operon that is usually tandemly repeated many times
■ Forms: 18S, 5.8S, and 28S subunits (5S subunit is NOT from an operon
­­ from RNA Pol III)
○ NTS: Non­transcribed sequence: Separates ribosomal operon units and contains
the “promoter”
○ Between 5’ ­­­ 18S ­­­ 5.8S ­­­ 28S: ITS (Internal Transcribed Spacers) and ETS
(External Transcribed Spacer)
■ Removed sequentially by endonuclease cleaves
■ ITS is not very conserved and so it is used to determine phylogeny
○ 5.8S and 28S base­pair and create a unit that is equivalent to the 23S subunit in
E. Coli

mRNA Maturation
● Produced by RNA Pol II
● In prokaryotes, mRNA transcription simply ends when RNA Pol encounters a termination
signal
● In Eukaryotes: Polymerase will transcribe past a 3’ Consensus Sequence (AAUAAA)
for clipping which brings in a Clipping Enzyme Complex to cleave the primary
transcript. Clipping is assisted by a further downstream G/U Consensus. A Poly(A) Tail
is then added by Poly(A) Polymerase
○ Process:
1. Complex Assembly
­ Cleavage and PolyAdenylation Specificity Factor (CPSF) binds to
 AAUAAA consensus
­ Cleavage Stimulating Factor (CstF) binds to G/U consensus and
directly contacts CPSF
­ CFI and CFII (Cleave Factors) are recruited through protein­protein
interactions by CPSF/CstF. These actually make the cut in the mRNA
­ Poly(A) Polymerase (PAP), a terminal transferase, is brought in by
CPSF
2. Cleavage
­ CFI/II cut the mRNA and CstF dissociates. mRNA is degraded
­ Cut leaves a 3’­OH
3. Oligoadenylation
­ PAP starts adding As to 3’ tail at a very slow rate (5 nuc/min)
­ Needs ATP as a substrate
4. PAB II Binding
­ Poly A Binding Protein (PAB II) binds to CPSF/PAP complex and
increases A addition rate to 1500 nuc/min
5. Poly(A) Extension
­ Tail is extended to desirable length
● Eukaryotes: 5’ Capping
○ 5’ Cap protects mRNA from degradation by exonucleases
○ It consists of a G nucleotide linked by an unusual 5’ ­­ 5’ ppp bond
○ Process:
1. Primary Transcript:
­ Normal: 5’ ­­­ pppXpYp...etc
2. Phosphotransferase: removes a p
­ leaving: p + ppXpYp...etc
3. Guanylyl Transferase
­ Recognizes the ppXpYp
­ Using GTP, it adds G + p to ppXpYp in a 5’ → 5’ linkage
4. Methyl Transferase + SAM
­ Adds Me to: Cap O site (on G nucleotide by Guanine 7 Me Transferase);
to Cap 1 Site (by 2’­O­Me Transferase), and to Cap 2 site

Translation
DNA 5’ → 3’ strand produces a 5’ → 3’ mRNA (DNA­like) strand through RNA Pol II
5’ → 3’ mRNA strand produces a N­terminus → C­terminus protein through Ribosomes
● mRNA encodes for proteins using 3­nucleotide “subunits” called Codons
● Translation is the process which converts the mRNA like strand into a protein using
Ribosomes which adds amino acids to the C­terminus

DNA: Nucleic Acids → RNA: Nucleic Acids → Protein: Amino Acids
 ● It was hypothesized that an adapter molecule will be needed to convert mRNA
(nucleotides) to proteins (AAs)
○ = tRNA
● First Genetic Code: mRNA connects to tRNA through Codon­Anticodon Base­pairing
interactions.
● Second Genetic Code: CCA (3’ end) of tRNA connects to an Amino Acid through usage
of tRNA Synthetase

Ribosomes (>60% RNA)
In E. Coli: 70S ribosome is made up of a 50S LSU and a 30S LSU (SU separated using EDTA =
Mg2+)
● LSU: made up of 5S rRNA, 23S rRNA, and 31 proteins (L1, L2,...L31)
● SSU: 16S rRNA and 21 proteins (S1, S2,...S21)
● Urea denatures these proteins and reveals that these rRNA function as ribozymes
Eukaryotes: 80S ribosome is made up of 60S LSU and 40S SSU
● LSU: 5S rRNA, 28S/5.8S rRNA
● SSU: 18S rRNA
LSU rRNA uses Peptidyl Transferase to catalyze AA addition to C­terminus of a protein

Reading Frames
Each strand of mRNA has 3 possible reading frames: depending on where you define your first
nucleotide of a codon, you get 3 completely different AA sequences
● Open Reading Frame (ORF): a reading frame that creates no termination codons for a
significant length; indicates that a protein is probably synthesized from that reading frame
● Significant Open Reading Frame (SORF): a reading frame that goes ~100 AA a
termination codon
● Unassigned Reading Frame (URF): a reading frame that codes for an unknown protein

Splicing and Reading Frame Problems:
1. Search for Intron/Exon boundaries by first identifying ORFs
a. When an ORF hits a termination codon, search for a GU consensus near it. This
is the 5’ Exon splice site (assuming spliceosomal introns)
5’ Splice Site Consensus: 5’ ­ (A/C)AG|GT(A/G)AGT
2. After finding the 5’ end of the Intron, start searching for a 3’ Splice site AG consensus
3’ Splice Site Consensus: (C/T)n_AG|G ­ 3’
3. Identify the next ORF after the 3’ splice site. This will be the reading frame of the second
exon
4. Find the branch site within the intron using the branch site AC consensus
Intron Branch­Site Consensus: TACT(A/G)A(C/T)

tRNA
● Contains 76­95 nucleotides:
○ Acceptor Stem: accept the AA at the 3’ CCA
 ○ DHU (Dihydroxy Urethane = modified U) arm/stem loop
○ Anticodon arm with Anticodon
○ Extra arm (optional)
○ T pseudo C arm
● Secondary structure consists of two coaxial helices where arms 2/4 (DHU and TpsiC
arm) H­bond

tRNAs, Wobble Rules, and Degeneracy
64 Codons ­ 3 Termination Codons (UGA, UAG, UAA) = 61 different codons, while there is only
20 different Amino Acids
Degeneracy: Multiple codons encode for single AAs
3’ Base in Codon can “wobble” ­­ this is due to hydrogen bonding abilities of the various bases

Wobble Rules:

E. Coli Yeast Mitochondria

3’ Codon 5’ A.C. 3’ C. 5’ A.C. 3’ C. 5’ A.C.

A, G U* A U* C, U G

G C G C A, G U*

C, U G C, U G A, G, C, U U

A, C, U I C, U I A, G C

Note: Mitochondria have a different genetic code due to different wobble rules
● No single codon­specific recognition
● Some tRNAs are charged (acylated) with different AAs
○ CUX → thr
● Some tRNAs are missing
● UGA termination codon is now a trp codon in mt.
tRNAs: Second Genetic Code
● 3’ CCA end of the tRNA attaches its specified Amino Acid
○ AA is added by the enzyme tRNA Synthetase (20 total synthetases: one/AA)
■ tRNA Synthetase recognizes specific tRNA Identity Elements to bind the
correct tRNA, and then it charges them with the proper Amino Acid
■ Involves the Aminoacyl Adenylate (=Carbonic Phosphate Anhydride)
intermediate
● Breaking the anhydride bond releases large amounts of energy
and drives this reaction to completion
○ Process:
1. Amino Acid + ATP → Aminoacyl Adenylate + pp
2. Aminoacyl Adenylate + uncharged tRNA (complexed with tRNA
synthetase) → Aminoacyl (= charged) tRNA + AMP

Mutations in Translation
● Transition vs. Transversion
○ Transition Mutation: goes from a purine → purine or pyrimidine → pyrimidine;
easier to happen chemically
○ Transversion Mutation: Going from a purine → pyrimidine or pyrimidine →
purine; more likely to happen mathematically
● Missense Mutation: change one nucleotide → go from one amino acid to another
○ Neutral Mutation: Changing one amino acid → another similar amino acid
● Silent Mutation: change one nucleotide but still specify the same amino acid
○ Doesn’t seem too bad but can still lead to Codon Bias between equivalent
codons (If one codon is less prevalent than another, this may lead to a
disadvantage)
● Nonsense Mutation: changing one nucleotide → amino acid to a stop codon
○ STOP codons: UAG, UAA, UGA
● Frameshift Mutation: insertion or deletion of 1­2 b.p → changes reading frame
○ An insertion of 2 may be compensated by a deletion of 2, etc.

Reverse and Suppressor Mutations:
WT → Primary = Forward Mutation → Mutant Phenotype → Secondary = Reverse = Back
mutation → WT
● Primary mutation originally leads to a mutant phenotype
● Although rare, a secondary mutation can restore the wild­type phenotype
● True Reversion: original nucleotide or AA is restored by a second mutation; very rare
● Partial Reversion: a similar amino acid is created by a second mutation in the same
codon; still rare
● Suppressor Mutations are much more common:
○ Intragenic Suppression: a compensating secondary mutation is within the
same gene as the original mutation
○ Intergenic Suppression: compensating secondary mutation is in a different
 gene. The proteins produced from both the original gene and the compensating
gene interact → finding intergenic suppressors gives us a way to ID protein
interactions

Informational Suppressors
● These are a type of intergenic suppressors. However, these are NOT “compensating”
mutations because they cause further errors during transcription/translation
○ The secondary mutations to suppress primary mutations/restore wildtype
phenotype take place in either the tRNA genes, rRNA genes, or RNA Polymerase
genes (Focus is on tRNA)
● Three kinds:
○ Nonsense Suppressors
○ Missense Suppressors
○ Frameshift Suppressors

Nonsense Suppressors
● Nonsense mutation: an AA is changed to a termination codon
● We need to prevent termination of transcription in order to suppress the nonsense
mutation
○ Termination is governed by RF1 and RF2 (Release Factors) which are able to
successfully bind at termination codons IF there are no tRNAs which can
successfully bind first
○ In order to do this, we will make use of forbidden anticodons; the tRNA which
these forbidden anticodons are derived from will govern which AA is added in
place of the specific termination codons
○ Using these forbidden anticodons leads to ALL of those termination codons being
occupied, not just the mutant. In order to prevent mass failure, we must pick
forbidden tRNAs that are efficient enough to suppress the mutation, but not super
efficient.
● Forbidden tRNAs are usually derived by a single b.p. substitution in their anticodons
● Amber Suppressors
● Ochre Suppressors­­need to finish this section
● Opal Suppressors

Missense Suppressors
● Missense mutation: one AA is changed to another by a single B.P. substitution
● In order to suppress this, need to use a tRNA that is charged with the “wrong” AA that is
similar enough to the original AA
● Four ways to generate:
1. Start with a normal tRNA that is charged with the desired AA. Perform a single
b.p. substitution in the anticodon that will now recognize that mutated codon
2. Start with a normal tRNA that contains that anticodon that recognizes the mutated
codon. Mutate the identity elements of this tRNA so that it will now be recognized
 by the tRNA synthetase of the desired AA.
3. Start with a normal, uncharged tRNA that has the anticodon which can recognize
the mutated codon. Mutate the tRNA synthetase that normally charges with the
desired AA. Make this tRNA synthetase recognize the tRNA with our desired
anticodon
4. Start with a normal, uncharged tRNA that has the anticodon which can recognize
the mutated codon. Mutate the tRNA synthetase that normally recognizes this
anticodon. Make it charge this tRNA with the wrong AA
● tRNA synthetase mutations are much more severe than mutating the tRNAs themselves.

Frameshift Suppressors
● Frameshift mutation: insertion/deletion causing a change of reading frame
● In order to suppress this, modify a tRNA anticodon via insertion → 4bp or 5bp anticodon
○ This will now suppress frame shifts if it is just efficient enough to fix original
frameshift, while not interfering too much with rest of translation

Protein Synthesis
RNA interactions overview:

Peptide bond formation is catalyzed through peptidyl transferase in the LSU rRNA (ribozyme)
Protein synthesis happens in three steps:
● Initiation
 ● Elongation
● Termination

Initiation: Prokaryotic
● 1: Initiation Factors bind to SSU
○ IF­1: dissociates SSU and LSU of the ribosome. Initiation complex will form on the
SSU
○ IF­3: binds to SSU of ribosome. Prevents reassociation of LSU and aids in mRNA
binding
○ IF­2: binds to SSU; also binds GTP
● 2: Met is converted to fMet (Formyl Methionine) by Transformylase
○ Transformylase adds a formyl group: serves as a chemical blocking group on
N­terminus of protein → AA can only be added to C­terminus
● 3: mRNA + fMet bind to SSU
○ Assisted by IFs (fMet by IF­2)
○ mRNA binds to rRNA by RNA base­pairing at the Shine­Dalgarno Sequence (=
ribosome binding site; consensus sequence)
● 4: IF­1 and IF­3 are released upon addition of fMet → LSU binds to SSU
● 5: LSU binding → GTP hydrolysis → IF­2 + GDP released
○ This leaves the 70S initiation complex: fMet is in P site and there is an empty A
site

Initiation: Eukaryotic
● Major difference: uses Scanning to position mRNA at correct initiation codon
● Process:
○ 1: eIF6 binds to LSU and prevents reassociation of ribosomal subunits
○ 2: 40S initiation complex is formed on SSU
■ eIF3 binds to SSU; aids in mRNA binding
■ eIF2­GTP binds to SSU and facilitates Met­tRNA (hovers over SSU, but
cannot bind due to no mRNA)
○ 3: mRNA binding and Scanning
■ eIF4A/B remove secondary structure (hairpin) of mRNA
■ CBP (eIF4E) (Cap­Binding Protein) causes mRNA Cap to bind to SSU
■ Ribosome SSU migrates and “scans” for correct AUG with consensus
(Kozak Sequence: GCC(A/G)CCAUGG)
■ Met­tRNA binds to correct AUG
○ 4: LSU binding
■ eIF5: removes eIF3 and eIF­2­GDP (hydrolyzed)
● eIF2B regenerates eIF2: kicks out GDP for fresh GTP
■ LSU binds → 80S initiation complex is formed with Met­tRNA in P site and
empty A site

Elongation
 ● Happens in three steps:
○ 1. tRNA binds at A site
■ Peptidyl tRNA is at P site
■ *EF­Tu here
○ 2. Peptidyl transferase forms a peptide bond between AAs at P and A site
■ AA chain is coming off tRNA at A site
○ 3. Translocation:
■ *EF­G here
■ The newly uncharged tRNA at the A site moves to the E site
■ The tRNA that has the peptide chain coming off it moves from the A site to
the P site
■ A new, charged tRNA comes in at the A site
■ This process is repeated multiple times
● Factors:
○ EF­tu: bound to aminoacyl­tRNA along with GTP. When aminoacyl­tRNA binds to
codon at A site, GTP is hydrolyzed and EF­Tu is released
■ → EF­Tu helps bind charged tRNA to A site (and a GTP is used)
○ EF­G: uses GTP to create EF­G­GTP complex. Hydrolysis → translocation
● Note: Eukaryotes have different elongation factors (eEFs)

Termination of Translation
● Elongation happens until a ribosome comes upon a stop codon (UAG, UAA, UGA)
● Since no tRNAs can bind to the stop codon, no tRNA can bind here
● The ribosome recognizes these stop codons using Release Factors
○ RF1: recognizes UAA, UAG
○ RF2: recognizes UAA, UGA
○ RF3: uses GTP hydrolysis to stimulate termination events
● Eukaryotic Release Factors:
○ eRF1: recognizes UAA, UAG, UGA
○ eRF3: stimulates termination via GTP hydrolysis
● Termination process:
○ 1. Polypeptide is released from the tRNA that is at the P site through peptidyl
transferase
○ 2. tRNA is released from ribosome
○ 3. SSU and LSU dissociate from RFs and mRNA
○ 4. fMet/Met are usually cleaved from complete polypeptide

Antibiotics Affecting Protein Synthesis
● Usually block initiation/elongation steps of protein synthesis
● Tetracycline (Prok.): aminoacyl­tRNAs are unable to bind SSU of prokaryotic ribosome
● Chloroamphenicol (Prok.): Inhibits peptidyl transferase
● Erythromycin (Prok.): Inhibits translocation
● Cycloheximide (Euk.): Inhibits peptidyl transferase
 ○ Used in chemotherapy for cancer cells
● Fusidic Acid (Prok.): Inhibits translation elongation by blocking dissociation of EF­G­GDP
● Kirromycin (Prok.): blocks EF­Tu­GDP release in → prevents new peptide bonds

Calculating GTP needed for protein synthesis:
● # of AA ­ 1 = # of Peptide Bonds
● GTP needed = (2 x [# of Peptide Bonds]) + 1 (from initiation) + 1 (from termination)
= (2 x [(# of AA)­1)]) + 2
= 2 x [# of AA]
● Example: in a 53 AA protein:
○ 2*(53­1) + 2 = 106 GTP