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Techniques d’analyse
Objectifs de l’enseignement
La matière vise à développer aux étudiants les concepts des méthodes instrumentalisées
impliquées dans le contrôle alimentaire. Cet enseignement repose sur 3 aspects :
Les méthodes instrumentales d’analyse étant nombreuses, il sera développé dans le cadre
de ce cours celles qui sont très utilisées dans les industries agro-alimentaires.
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Contenu de la matière
Introduction
B. Méthodes chimiques
1. Gravimétrie
2. Volumétrie
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Introduction
Il est à noter que les aliments insalubres sont à l’origine de près de deux millions de
décès par an dans le monde, dont de nombreux enfants. Les aliments contenant des bactéries,
des virus, des parasites ou des substances chimiques sont responsables de plus de 200
maladies, allant de la diarrhée aigüe aux cancers.
En Algérie, malgré la mise en place de multiples points de contrôle stricts et rigoureux
depuis des décennies, le nombre de cas de TIAC (toxi-infection alimentaire collective) oscille
entre 3000 à 3500 cas entre 1998 à 2014, avec notamment deux pics de 4500 cas en 1999 et
3838 cas en 2014. Notons également, que ces cas de TIAC se sont soldés par une moyenne de
5 décès par an avec deux pics également, l’un en 1998 avec 50 décès et l’autre en 2008 avec
neuf décès.
Au cours de ce module nous traiterons de plusieurs principes et méthodes qui peuvent servir à
ces analyses.
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Chapitre 1.
Rappel des notions élémentaires
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1. Généralités sur les méthodes d’analyse
Le mot « analyse » comporte le suffixe « lyse » qui signifie « décomposer » (exp:
pyrolyse, hydrolyse, électrolyse, celui qui analyse étant l’analyste. Il est commode de
distinguer dans tout échantillon quel qu'il soit les deux termes suivants : ce que l'on cherche à
déterminer : l'analyte ; tout le reste : la matrice. Jusqu'au début du XXe siècle, la chimie
analytique consistait à faire réagir le produit inconnu avec des produits connus pour
déterminer sa nature. L'introduction de méthodes quantitatives, en utilisant les concepts de la
chimie physique, a marqué un renouvellement de la chimie analytique.
La séparation d'un mélange homogène utilise les différences de propriétés physiques entre
les constituants. Par exemple, on extrait facilement le sel d'un mélange sel-sable au moyen de
l'eau, car le sel est soluble dans l'eau et le sable ne l'est pas. Par contre, la limaille de fer et le
sable sont tous deux insolubles dans l'eau : Cependant, seule la limaille de fer est magnétique,
on pourra donc la récupérer par triage magnétique. On peut séparer des constituants liquides
par distillations successives ou fractionnées. Dans certains cas, des cristallisations successives
permettent de séparer les constituants solides. Nous pouvons aussi utiliser la centrifugation
pour séparer le culot du surnageant.
L'approche moderne des méthodes dites « non destructives » où l'échantillon est traité
comme un tout dont la consommation reste négligeable vis-à-vis de la masse totale de celui-
ci, offre évidemment l'économie de l'analyse immédiate, conserve cet échantillon aux fins de
contre analyse si nécessaire, mais se heurte à des difficultés redoutables telles les effets de
matrice et les problèmes de l'étalonnage.
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1.2. Classification des analyses
Les analyses peuvent donc être classées :
Selon le type : analyse qualitative ou quantitative.
Selon le produit cible : analyse organique ou analyse minérale.
Selon la quantité d’échantillons utilisée : macro- ou microanalyse. La quantité peut
être de l’ordre de quelques grammes ou des fractions de milligramme.
Selon l’automaticité : analyse manuelle ou automatique. L’analyse automatique est
beaucoup utilisée dans l’industrie pour suivre et orienter les paramètres d’un procédé.
Selon le matériel utilisé : L'analyse peut être par des méthodes classiques ou
instrumentales.
Extraction
Distillation
- L’analyse quantitative dans les méthodes classiques peut être faite par:
Gravimétrie – poids d’un composant résultant d’une réaction ou variation de poids
pendant la réaction
Par contre dans les méthodes instrumentales on utilise des équipements qui mesurent
une propriété physique ou chimique d’une substance ou un facteur qui permet la
détermination d’une propriété de cette substance.
- Les méthodes instrumentales se divisent en trois catégories ;
Méthodes spectroscopiques – qui utilisent comme mesure la radiation
électromagnétique avec différentes gammes du spectre électromagnétique.
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Les différentes méthodes analytiques s’appliquent à différentes gammes de concentrations.
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1.3. Choix de la méthode
1.3.1. Spécifications en matière de performance
Les méthodes doivent être choisies sur la base de leurs performances compte tenu des
spécifications convenues. Les principales spécifications techniques sont les suivantes:
D'autres caractéristiques qu'on peut être amené à prendre en compte sont la simplicité, la
rapidité et le coût.
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1.3.2. Spécification en matière de référence
o Méthode de référence
o Méthodes courantes/officielles
Elles peuvent elles aussi être stipulées par des organisations commerciales ou par des
autorités réglementaires et sont considérées comme des méthodes qui peuvent être utilisées
quotidiennement pour les travaux ordinaires. Elles auront fait l'objet d'un grand nombre
d'essais comparatifs inter-laboratoires et bien qu'elles ne donnent généralement pas les mêmes
caractéristiques de performance et de qualité que les méthodes de référence, elles sont plus
rapides, plus pratiques et moins coûteuses et elles ont une fidélité et une précision suffisantes
pour la plupart des substances à analyser.
II peut s'agir de méthodes d'analyse qui ont été mises au point à l'intérieur du laboratoire;
bien que certaines puissent être nouvelles, elles sont plus souvent fondées sur une méthode
officielle qui a été simplifiée de manière à être plus facile, plus rapide, plus économique, plus
avantageuse à utiliser.
Dans certains cas, il peut être important de s'assurer que la prise d'essai est représentative
de l'échantillon reçu.
De préférence, les essais multiples doivent être rendus aléatoires dans le lot et l'idéal serait
que l'analyste n'en soit pas informé.
Lorsqu'il est prévu que la plus grande partie des prises d'essai ne contiendront pas de
quantités significatives de la substance recherchée, il est important d'analyser une prise d'essai
à laquelle la matière recherchée a été ajoutée et de montrer que l'analyse donne le résultat
attendu.
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1.4.4. Témoins négatifs
Dans la situation inverse, où la plupart des prises d'essai contiennent des quantités
significatives de la substance recherchée, il importe d'incorporer un nombre de prises d'essai
qui sont essentiellement exemptes de cette substance afin de donner des garanties que les
niveaux de contamination au laboratoire sont suffisamment faibles pour être acceptables.
1.4.5. Etalonnage
Vérification de la graduation et du réglage d'un appareil de mesure par comparaison avec
l'étalon.
En réalisant un grand nombre de dosages sur une substance étalon, lorsque la méthode
semble fonctionner correctement, on peut calculer la moyenne et l'écart type pour la
concentration de la substance recherchée.
1.4.8. Répétition
https://drive.google.com/open?id=1NIxT4NL1fatCvg
vADQUVNBOQbpcrg3VY
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3. Généralités sur les solutions
3.1. Définition
Une solution peut être définie comme un mélange homogène dont les constituants
sont divisés et dispersés l'un dans l'autre au niveau moléculaire. Une solution est toujours
constituée :
Les solutions sont liquides (ou aqueuses lorsque le solvant est l'eau). Les solutés
peuvent être :
La concentration molaire
C'est le rapport de la quantité de matière de (en mol) contenue dans un certain volume de
solution divisée par ce volume de solution exprimé en . C'est donc également la quantité de
matière de contenue dans un litre de la solution. La concentration molaire a donc pour unité
la mol.L-1. La concentration molaire est souvent également appelée molarité ; elle est alors
symbolisée par la lettre M. Ainsi une solution de sulfate de sodium 0,2 M contient 0,2 mol de
sulfate de formule dans un litre ; on dit qu'il s'agit d'une solution à 0,2 mol.L-1 ou
encore 0,2 fois molaire.
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La concentration massique
C'est le rapport de la masse de composé contenu dans un certain volume de solution divisée
par ce volume de solution. La masse est exprimée en kg ou en g et le volume souvent exprimé
en L et parfois en m3. Le terme concentration désigne souvent soit la concentration molaire
soit la concentration massique sans que cela soit précisé; il convient de bien noter l'unité
correspondante qui seule permet de différencier les deux types de concentration.
C'est le rapport de la masse de composé contenu dans un certain volume de solution divisée
par la masse de ce volume de solution. Ce rapport est obligatoirement compris entre 0 et 1. On
a pris l'habitude de l'exprimer en % pour manipuler des nombres compris entre 0 et 100 : par
exemple une solution de à 10% contient 10g de composé pour 100g de solution. Le
pourcentage en masse ne présente d'intérêt que lorsque l'on utilise des solutions très
concentrées.
La fraction molaire
La fraction molaire est peu utilisée pour exprimer les concentrations des solutés dans des
solutions diluées ; en revanche, elle sert pour exprimer la composition des mélanges.
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La normalité
Cette unité de concentration qui a été largement utilisée présente l'inconvénient de dépendre
de la réaction par laquelle on va utiliser cette solution... Ainsi, on définit la normalité d'une
solution acide dans l'eau comme le nombre de mol d'ion susceptible d'être libérés par
un litre de solution. De même, la normalité oxydo-réductrice d'une solution correspond au
nombre de mol d'électrons susceptibles d'être libérés par un litre de solution : dans ce dernier
cas, la normalité dépend de la nature de espèce chimique avec laquelle on peut faire réagir la
solution.
La masse volumique
La masse volumique d’une solution est définie par le rapport de la masse de solution (m) au
volume total qu’elle occupe (V).
𝛒 = 𝐦/ 𝐕 (unité : g/L, kg/L, kg/m3…)
La densité
La densité est le rapport de la masse volumique de la solution à la masse volumique de l’eau.
𝐝 = 𝛒/ 𝛒 𝐞𝐚𝐮
Degré d’acidité
Degré d’acidité est le nombre de gramme de l’acide par 100ml.
Exp : Dans un flacon de HCl à 37° il y a 37 g de l’acide dans 100 ml de solvant.
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4. Méthodes de préparations de solutions
Mise en pratique
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4.2. Méthode par dilution
C0×V0=C1×V1
Lors d’une dilution le facteur de dilution est le rapport de la concentration de la solution mère
sur celle de la solution fille :
Mise en pratique
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Exemple :
Solution
Solution a. Pour prélever le volume V0 de solution mère on utilise une pipette jaugée car le
prélèvement est plus précis.
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Chapitre 2.
Méthodes physico-chimiques et chimiques d’analyses
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A. Méthodes physico-chimiques
1. pH métrie
1.1. Définition
Le potentiel hydrogène, noté pH, est une mesure de l'activité chimique des hydrons
(appelés aussi couramment protons ou ions hydrogène) en solution. Notamment, en solution
aqueuse, ces ions sont présents sous la forme de l'ion hydronium.
Plus souvent, le pH mesure l’acidité ou la basicité d’une solution. Ainsi, dans un milieu
aqueux à 25 °C :
1.2. Calcul du pH
pH = –log [H3O+]
Lorsque la concentration en ions H3O+ change d’un facteur dix, le pH change d’une
unité.
1.3. Echelle du pH
Les acides et bases ne sont pas seuls à se dissocier pour former des ions hydronium ou
hydroxyle, l’eau pure se dissocie elle aussi en formant ces ions :
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L'eau contient normalement un nombre équivalent d'ions hydroxydes (OH-) et d'ions
hydroniums (H30+). Lorsqu'une substance acide ou alcaline est ajoutée dans de l'eau, elle
modifie la proportion d'ions hydroxydes et d'ions hydroniums.
L'eau pure devrait avoir un pH de 7, mais l'eau du robinet a généralement un pH entre 5,5
et 6. L'eau très acide (avec un faible pH) est plus susceptible de dissoudre les produits
toxiques. Ceux-ci peuvent contaminer l'eau et la rendre impropre à la consommation humaine.
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1.4. Mesure du pH
A. Les indicateurs de pH
De nombreuses substances chimiques prennent en solution une couleur qui dépend des
conditions de pH. Cette propriété est mise à profit pour déterminer les caractéristiques des
solutions en y introduisant l’indicateur.
Les principaux indicateurs colorés acido-basiques utilisés au laboratoire ainsi que leurs
caractéristiques :
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Sous forme de papier-pH et bandelettes : l’indicateur est absorbé sur une bandelette ou un
bout de papier sur laquelle on dépose une goutte de la solution à tester. L’intérêt est de
couvrir tout le domaine de pH. Pour arriver à ce résultat, il suffit d’absorber plusieurs
indicateurs colorés en même temps.
Un indicateur universel est un mélange d'indicateurs dont les points de virage sont étalés
de manière à ce que la couleur de la solution varie graduellement sur une large gamme de pH.
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B. Le pH mètre
Le principe
Pour mesurer le pH on a besoin d’un outil de mesure sensible aux ions hydronium qui
déterminent le pH. Il s’agit d’un voltmètre. Le principe de la mesure consiste à prendre
un capteur avec une membrane en verre sensible aux ions hydronium (électrode pH) et à
observer la réaction entre la membrane et l’échantillon : mesure d’un potentiel. Ce potentiel
est comparé à un potentiel de référence délivré par une électrode insensible au pH, par
diffusion d’électrolyte vers l’échantillon au travers d’un diaphragme : électrode de référence
(Ag/AgCl). Pour un usage plus simple, les 2 électrodes sont combinées en une seule électrode.
Le pH d’une solution est alors la différence de potentiel entre les deux électrodes
selon l’équation de Nernst :
E = potentiel mesuré
E0 = constante
R = constante des gaz parfaits
T = température en degrés Kelvin
n = charge ionique
F = constante de Faraday
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Etalonnage
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10) Attendre que la mesure se stabilise. L’étalonnage peut se faire sur 2, 3 points de
pH.
11) Si étalonnage correct appuyer sur ok et choisir le mode pH.
Mesure
Influence de l’environnement
Il est important que la calibration soit faite à la température de mesure car la
température a un effet sur la dissociation de la molécule. Il est a noté aussi que les
électrodes ont des températures max d’utilisation.
Si le solvant n’est de l’eau alors la gamme de pH habituelle ne s’applique pas.
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2. Conductimétrie
La conductivité est directement liée à la mobilité (notée ui) des ions i présents au
sein de la solution, qui est la part de la conductivité indépendante de la concentration. La
propriété de conduction électrique (ou de résistance) est relative au déplacement des ions
(mobilité ionique des ions ui).
Plus un ion est volumineux, plus sa mobilité est faible, et plus sa conductivité est
faible. Il s'ensuit que les cations métalliques possèdent généralement des λ°i (Lamda)
relativement faibles. Pour chaque ion, on définit de plus la conductivité
molaire ionique λi (AiZi) par :
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2.3. Le conductimètre
Une tension alternative (100-1000Hz) de faible amplitude (pour éviter les phénomènes
d'électrolyse et de polarisation des électrodes) est appliquée entre les deux plaques. La
résistance est alors déterminée grâce à un montage électronique complexe (pont de
Wheatstone). On définit la conductance comme l'inverse de la résistance R d'une solution et
celle-ci se note G :
σ = kG
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Étalonnage
La conductivité σ se déduit de la mesure de G à condition de connaître la constante de
cellule k. Il est donc nécessaire de déterminer celle-ci car sa valeur peut varier au cours du
temps notamment à causes de phénomènes d’adsorption d’analytes qui tendent à en diminuer
la surface active. Pour cela, on procède à une phase d’étalonnage au moyen d’une solution
étalon dont la conductivité 𝜎 est tabulée pour chaque température : il s’agit souvent d’une
solution de KCl à 0,1 mol.L-1. Pratiquement, l’expérimentateur ajuste la constante k afin
d’obtenir à l’écran la valeur de la conductivité tabulée à la température d’étude. Une fois
étalonné, on lit directement la valeur de σ sur le conductimètre.
1. Placer la cellule conductimétrique dans une solution étalon de KCl à 0,1 mol.L-1
2. Sélectionner la température adéquate
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3. Appuyer sur le bouton Cal pour commencer la calibration. Faire varier la valeur de la
constante de cellule k pour obtenir la valeur de 𝜎 adéquate à la température de mesure.
4. Valider la valeur de k en appuyant sur ok. Le conductimètre affiche alors 𝜎 et est prêt
à être utilisé.
5. Rincer la cellule avec de l’eau distillée.
Mesure
Influence de l’environnement
La conductimétrie est en relation directe avec la quantité d’ions en solution. Toute
variation de cette quantité aura donc une influence sur la conductance ou résistance de la
solution.
Conductivité de l’eau
La conductivité de l’eau donne une indication de sa qualité comme illustré ci-dessous.
La conductivité de l'eau ultra-pure est d'environ 0,055 mS/cm à 25°C.
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3. Polarographie
3.1. Introduction
La conductimétrie étant faite pour les composés non électro-actifs, pour les composés
électro-actifs on utilise les méthodes statiques comme la potentiomètrie (mesure du potentiel
de manière passive comme le pH-mètre) ou dynamiques (mesure du courant électrique en
fonction du potentiel imposé par l’appareil) comme la voltamètrie ou la polarographie.
Rappel
Un composé électro-actif est un composé qui peut s’oxyder ou se réduire par voie
électrochimique. L’électroactivité d’un composé dépend de sa structure chimique, de la nature
de l’électrode et autres facteurs expérimentaux.
3.2. Définition
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Les spécificités propres à l'électrode à goutte de mercure comparées aux électrodes
conductrices solides viennent des propriétés particulières de ce métal qui, liquide à
température ambiante, permet un renouvellement de la surface active de l'électrode, qui
conduit aisément à la formation d'un certain nombre d'amalgames avec les métaux et qui
permet des réductions à des potentiels très négatifs (réductions impossibles à réaliser sur
électrode de platine ou de carbone vitreux). En oxydation, par contre, l'exploration des
potentiels en polarographie est limitée par l'oxydation du mercure, ce qui explique qu'une
grande partie des applications a concerné des composés électroréductibles.
Dans le cas d'un cas d'un cation métallique, par exemple, la réaction électrochimique
mise en jeu est la suivante :
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On dispose dans la cellule d'électrolyse de 3 électrodes qui plongent dans la solution à
étudier :
Le barbotage dans l’Azote N2 est utiliser pour se débarrasser de l’oxygène qui pourrait
réagir avec les électrodes et altérer la mesure.
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Un avantage important du mercure réside dans le fait qu'à chaque goutte correspond
une nouvelle électrode, identique à la précédente du point de vue géométrique, mais ne
gardant pas mémoire du phénomène électrochimique ayant affecté les gouttes antécédentes.
Il est possible de procéder aux analyses avec un milieu aqueux, mais aussi en milieu
organique. Dans le premier cas, on utilise majoritairement du KCl, mais il existe bien d’autres
électrolytes efficaces. C’est la même chose pour le milieu organique. On peut faire l’analyse
dans de l’alcool, acide acétique, acide sulfurique et bien plus.
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Les courbes obtenues ci-dessous, se présentent sous forme de " vagues " dont la
hauteur du palier de diffusion est proportionnelle à la concentration de l'espèce
tandis que le potentiel de demi-palier est caractéristique de cette espèce.
C'est donc une méthode d'analyse quantitative et qualitative.
Lorsque le potentiel devient très négatif, on observe finalement la réduction du
solvant.
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3.4. Applications de la polarographie
Sensibilité
La polarographie classique est limitée vers les faibles concentrations de l'ordre de 10-5 à
10-6 M.
Pouvoir de séparation
Pour que deux vagues polarographiques soient dissociables, il faut que la différence entre
les potentiels de demi-vague soit supérieure à 100 à 200 mV.
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B. Méthodes chimiques
1. Gravimétrie
1.1. Définition
Il existe deux types courants d'analyse gravimétrique. Les deux reposent sur une
modification de l'analyte pour le séparer du reste du mélange, provoquant ainsi une variation
de la masse.
Cette méthode permet de séparer les composants d'un mélange par chauffage ou par
décomposition chimique de l'échantillon. Cela permet de séparer n'importe quel composé
volatil et conduit à une variation de masse que l'on mesure.
Problème
Par accident, Une bouteille de chlorure de baryum (Sa forme hydratée la plus fréquente
est BaCl2.2H2O.), vient d’être contaminée par une quantité inconnue de KCl en poudre.
Quelle est le pourcentage massique de chlorure de baryum hydraté dans le flacon ?
Solution
=9,51g−9,14g=0,37g H2O
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On obtient :
On la converti en masse grâce à la masse molaire (Ba =208 et H2O= 18 donc =244) :
Conseils
Voici quelques conseils utiles pour réaliser des expériences de gravimétrie et faire les calculs
associés :
Lorsqu'on évapore des composés volatils d'un échantillon, s'assurer d'avoir sécher
jusqu'à obtenir une masse constante.
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1.3. Analyse gravimétrique par précipitation
La gravimétrie par précipitation est une technique d'analyse qui permet de séparer les ions
d'une solution grâce à une réaction de précipitation. L'espèce chimique qu'on ajoute pour
induire la réaction de précipitation, est appelé précipitant ou réactif de précipitation. Le
précipité formé est ensuite séparé des autres composants liquides par filtration, et on utilise la
masse de ce solide, ainsi que l'équation-bilan de la réaction, pour calculer la quantité ou la
concentration en composés ioniques dans la solution.
Problème
Solution
Selon l’équation-bilan :
Selon cette équation-bilan, on s'attend à produire 2 moles de précipité AgCl2 pour chaque
mole de MgCl2 (aq), le composé qu'on cherche à quantifier.
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3. Calcule de la fraction massique :
Conseils
Voici quelques conseils utiles pour réaliser des expériences de gravimétrie par précipitation et
faire les calculs associés :
Les huiles et graisses totales contenues dans l'échantillon sont d’abord extraites à
l’aide d’hexane. Cet extrait est par la suite asséché avec du sulfate de sodium.
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2. Volumétrie
2.1. Définition
Le dosage volumétrique est une technique où la concentration d'une solution inconnue est
déduite de la mesure d'un certain volume d'une autre solution de concentration connue.
2.2. Principe
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Chapitre 3.
Chapitre 3 : Méthodes Physiques d’analyses
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1. Méthodes spéctro-photométriques : UV- Visible
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1.3. Fonctionnement du spectromètre
Tout ou une partie des commandes peuvent être regroupées dans un clavier ou en
quelques touches qui permettent de naviguer dans des menus affichés sur un écran de
contrôle. Certains spectrophotomètres sont complètement pilotés par un logiciel installé sur
un ordinateur personnel ; dans ce cas, il faut se référer au mode d'emploi du programme.
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1.4. Equation de Beer-Lamber
1. Choisir la cuve :
La cuve est choisie en fonction de la longueur d'onde : le verre ne permet pas d'analyse en
dessous de 330 nm, le PMMA en dessous de 300 nm et le polystyrène en dessous de 340 nm.
Les cuves en polymères sont jetables. Le quartz (en fait de la silice SiO2 fondue) permet de
travailler jusqu'à 200 nm. L'épaisseur de le cuve est choisie en fonction de la sensibilité
recherchée (mais plus de 95% des analyses sont faites avec une épaisseur L égale à 1 cm. Si le
volume de l'échantillon est limité, on pourra choisir une cuve rétrécie.
S’assurer que la bonne source est connectée. Deux sources sont nécessaires pour
couvrir le domaine 200 - 800 nm : une lampe dite "tungstène" (symbole W) couvre le proche
UV, à partir de 330 nm et le visible ; une lampe au deutérium (symbole D2) couvre
l'ultraviolet en dessous de 330 nm.
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La figure ci-dessous montre, sur deux spectromètres différents, le genre d'instruction
qu'il faut chercher pour accéder à l'allumage de la source quand un interrupteur dédié n'est pas
présent sur l'appareil.
La longueur d'onde λtravail est fournie par le protocole. Sur le panneau de contrôle du
spectromètre, régler la longueur à la valeur voulue.
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4. Mesure de I0 ou "blanc" :
Faire le blanc : remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les
constituants du mélange à analyser, sauf l'espèce à doser. Autrement dit, remplir une cuve
avec le solvant, le tampon, les éventuels réactifs qui interviennent pendant le dosage. Vérifier
l'absence de coulure sur les faces optiques (non dépolies) de la cuve et la placer sur le trajet du
faisceau lumineux. Fermer le capot. La lumière qui émerge de cette cuve permet au
spectromètre d'évaluer I0 envisagée non pas comme intensité lumineuse fournie par la source
du spectromètre, mais comme intensité arrivant au détecteur lorsque toute les conditions
d'analyse sont réunies, sauf la présence de l'espèce chimique qu'il s'agit de doser. Si
l'absorbance dépasse 1, les constituants du blanc absorbent déjà plus de 90% de l'intensité
lumineuse. Les conditions d'analyse deviennent discutables. Sinon, appuyer sur le touche
100%T ou "zéro".
5. Mesure de I et A
Remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les constituants du mélange à
analyser, y compris l'espèce à doser. L'intensité de la lumière qui émerge de cette cuve
correspond à I0 diminuée de l'absorption due à la l'espèce à doser. Relever l'absorbance lue et
la reporter sur la courbe d'étalonnage ; en déduire la concentration recherchée.
Si la valeur de l'absorbance dépasse 1, il existe un risque que cette grandeur soit sortie
de la zone de linéarité de la loi de Beer-Lambert. Il est préférable de renouveler la
mesure en diluant ou en préparant à nouveau l'échantillon. Refaire le blanc, si
nécessaire.
Si l'absorbance évolue : le contenu de la cuve évolue aussi. Une réaction a lieu, qui
conduit à la formation de davantage de composé coloré (cas fréquent lorsqu'il faut
ajouter un réactif) ou au contraire à la décomposition de la molécule qui absorbe.
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2. Méthodes chromatographiques
A. Généralités
1. Définition
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec
les molécules à séparer. On distingue ainsi: la chromatographie d'adsorption, de partage,
d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie d'affinité.
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3. Choix de la technique
4. Terminologie
Chromatogramme
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Elution
Le temps mort
Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase
stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou
temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne).
Le temps de rétention
Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à analyser
(soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le temps de rétention
est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse données et peuvent servir à
l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est fonction de la quantité du
constituant. Le temps de rétention est indépendant de la quantité d’échantillon injectée. Il est
fonction de la nature et la vitesse de la phase mobile.
Le temps de rétention réduit (tr’) représente le temps passé par le soluté dans la phase
stationnaire.
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Le volume de rétention
Etalonnage
Lors d'un étalonnage interne, on va ajouter dans chaque solution étalons la même quantité
d'un autre composé qui servira de référence. Cette fois on s'intéresse au rapport entre les aires
de l'espèce à analyser et de la référence. Cela permet de palier aux problèmes de non linéarité
entre l'air des pics et la concentration ainsi qu'au fait qu'à chaque injection ce n'est pas
toujours rigoureusement la même quantité qui est injectée. On trace également une courbe
d'étalonnage donnant la concentration des étalons en fonction du rapport aire du composé à
analyser/aire de la référence. On injecte ensuite la solution à analyser, à laquelle on ajoute
aussi la mémé quantité de référence, et grâce à la courbe d'étalonnage on peut en déduire la
concentration recherchée.
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B. Chromatographie liquide classique
La chromatographie sur couche mince (CCM, en anglais TLC pour Thin layer
chromatography) est une technique de chromatographie planaire dont la phase mobile
est liquide. Elle est couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse
(CCM analytique) ou de purification (CCM préparative). Elle comprend :
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Le phénomène d’adsorption est prépondérant (mais il y a également partage si le
solvant est un mélange) pour les phases stationnaires polaires. Dans le cas des phases
inverses, c'est-à-dire hydrophobes, c'est le phénomène de chromatographie de partage qui
prédomine.
Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser
est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon
est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et
qu'elles auront tendance à rester au même endroit.
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C. La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une
substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers
celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont
se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui
est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.
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D. La chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC)
L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile) dans
une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les « grains » sont de très
petite taille).
Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation
de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les
composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire
permet une meilleure séparation des composants. Le seuil de détection est également plus bas.
Les phases mobiles utilisées sont des mélanges d'eau et d'un solvant organique
miscible (acétonitrile, méthanol) ou des combinaisons de solvants organiques (alcools,
hexane, dichlorométhane...) miscibles entre eux.
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3. Electrophorèse
1. Définition
L'électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans un
but analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Elle a quelques
applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie
moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. Elle n'est donc pas
adaptée à la séparation des lipides.
2. Principe
o Sur les acides nucléiques, les charges sont portées par les
groupements phosphate du squelette.
o Sur les protéines, la situation est plus complexe et il existe différents types de
groupements ionisables : La charge nette d'une protéine dépend donc en général de
sa composition en acides aminés et du pH.
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3. Types d’électrophorèses
Selon Tisélius (1937), est réalisée dans un tube en U de section carrée (ceci afin de
pouvoir réaliser des mesures optiques au travers du tube, comme avec une cuve de
spectrophotomètre) : la séparation n'est pas totale, mais les frontières qui se forment sont
mises en évidence par des méthodes optiques (absorption UV, indice de réfraction,
fluorescence...). Cette méthode est utilisée en recherche pour mesurer la mobilité
électrophorétique et pour vérifier la pureté des protéines.
Ces supports ont connu un immense succès, car leur emploi est simple, rapide, peu
onéreux. En outre, il ne nécessite que de très petites quantités de substances. Ainsi, dans le cas
d'un sérum sanguin, quelques microlitres suffisent.
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Quel que soit le support, on utilise une « cuve à électrophorèse » essentiellement
constituée de deux bacs contenant le tampon et une électrode. Anode et cathode sont reliées à
un générateur de courant continu. Les extrémités du support solide trempent dans le tampon
ou lui sont reliées par des ponts en papier filtre. Le support doit être homogène, poreux et
inerte (cette dernière condition n'est jamais totalement réalisée).
Électrophorèse sur papier : Assez peu résolutive, cette technique d'électrophorèse est
surtout destinée à séparer des molécules de petite taille, dont les acides aminés. Des
phénomènes d'interférence liés à la charge des acides aminés et de la cellulose du papier
interviennent de façon notable. Une goutte de solution contenant l'échantillon à analyser est
déposée sur une bande de papier, puis séchée. La bande de papier est humidifiée avec un
tampon convenablement choisi, puis les deux extrémités de la bande sont plongées dans deux
réservoirs contenant le tampon. Chaque réservoir est connecté à une électrode. Un champ
électrique continu est appliqué, et les acides aminés se déplacent en fonction de leur charge
nette. En fin d'électrophorèse, la bande de papier est séchée puis les acides aminés sont
révélés par une réaction colorimétrique telle que celle à la ninhydrine (La ninhydrine possède
la particularité de former un produit coloré avec les acides aminés).
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Électrophorèse sur acétate de cellulose : L'électrophorèse se fait dans des conditions
proches de celles de l'électrophorèse sur papier. Les bandes d'acétate de cellulose sont
fragiles, mais elles limitent la diffusion des molécules à séparer. La révélation des protéines se
fait également par une réaction colorimétrique (rouge de ponceau par exemple). Cette
technique, peu résolutive, permet de séparer grossièrement des groupes de protéines. Elle est
peu coûteuse et permet une analyse rapide des protéines sériques.
Électrophorèse sur gel d’amidon : L'électrophorèse sur gel d'amidon est particulièrement
utile à l'analyse et la séparation des isoenzymes. Le principe de la technique repose sur une
séparation électrophorétiques des protéines sur une matrice poreuse composée d'un gel
d'amidon, de pH précis. Les enzymes présentes sont détectées en incubant le gel dans une
solution contenant un substrat spécifique de l'enzyme donnant lieu à un produit coloré. Les
profils obtenus sont désignés sous le nom de zymogrammes.
Électrophorèse sur gel d' agarose : L' électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode
utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer les protéines, l' ADN, l' ARN en
fonction de leurs poids moléculaires. Les molécules de plus petites tailles se déplacent plus
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Électrophorèse sur gel de polyacrylamide : (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel
Electrophoresis): Les gels, formés entre deux plaques de verre, sont obtenus par
polymérisation d'un mélange d'acrylamide (CH2 = CH-CO-NH2) et de bisacrylamide (CH2 =
CH-CO-NH-CO-CH= CH2), ce qui aboutit à la formation d'un réseau réticulé. Les
concentrations en acrylamide et le ratio acrylamide/bisacrylamide déterminent la taille des
pores et donc les capacités résolutives du gel. Ces techniques peuvent être utilisées pour
séparer des protéines ou bien des acides nucléiques (de courte séquence en général) en
condition native ou dénaturante. L'électrophorèse est réalisée à l'aide d'un montage vertical,
les échantillons étant déposés dans des puits localisés au sommet du gel.
Pour les deux types de polymères, le gel peut se faire en conditions natives ou en
conditions dénaturantes (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant). Dans ce second cas,
on ajoute un agent dénaturant dans le tampon : un détergent, le SDS pour la séparation des
protéines (on parle alors de SDS-PAGE), un agent chaotropique, l'urée, pour les acides
nucléiques.
Electrophorèse bidimensionnelle : On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon
la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS); on sépare ainsi environ 1000 protéines
dans le sérum. On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux
tissus et organes humains. La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse
d'images.
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Immunoélectrophorèse : La révélation est basée sur une réaction "antigène-anticorps". On
mettra de côté l'immunoblot, qui consiste à visualiser des protéines sur un gel (la fixation d'Ac
étant révélée par un second anticorps marqué). Elle utilisele fait qu'à des concentrations
adéquates, du fait de la présence de familles d'anticorps (polyclonaux) et de la bivalence de
ces anticorps, il se forme des agrégats (= réaction d'immunoprécipitation. Ce précipité est
Electrophorèse capillaire : C'est une technique récente qui commence à se développer et qui
offre essentiellement les avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la
très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de
diamètre d'environ 50 µm et de longueur œ 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages
élevés (15-30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de migration très rapides des composés dans le
capillaire et ceux-ci sont détectés par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie
directement sur le capillaire, donc dans un volume très faible. Ceci fournit donc une
sensibilité particulièrement élevée (on injecte seulement quelques nanolitres de l’échantillon).
Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés,
d'oligonucléotides,… le nombre de plateaux est de l'ordre de 500000 par mètre, ce qui fournit
une résolution remarquable (on peut séparer des peptides différant d'un acide aminé, des
mélanges complexes d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est
utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse,…). La technique
peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en présence de micelles de détergents
appropriés.
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4. Emission à flamme et absorption atomique
1. Définition
2. Principe
Absorption atomique :
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L'analyse des atomes ou des ions élémentaires est seulement possible dans un milieu
gazeux où les ions sont bien séparés. Par conséquent, le premier pas de l’absorption atomique
est le plus important et s'appelle l’atomisation, étape pendant laquelle un échantillon en
solution est transformé en vapeur atomique en utilisant une source de chaleur appropriée. La
solution de l’échantillon est chauffée dans l’instrument à une température entre 2000 et 3000
°C pour couper les liaisons chimiques, libérant les éléments et les transformant dans l’état
atomique gazeux.
Emission atomique :
Les atomes de la substance à analyser dans la solution sont aspirés dans la région
de stimulation où ils sont dissous, vaporisés et atomisés par une flamme, une décharge, ou
un plasma. Ces sources d'atomisation haute température fournissent suffisamment d'énergie
pour propulser les atomes à de hauts niveaux d'énergie. Les atomes se désintègrent pour
retourner à des niveaux plus bas en émettant de la lumière.
Pour les atomes stimulés par la lumière, on emploie le nom de fluorescence atomique
(spectroscopie de fluorescence atomique).
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La SEA employant une flamme, également appelée spectroscopie à émission de
flamme (SEF), est caractérisée par une mise en application largement répandue en analyse
élémentaire. Elle peut être utilisée à la fois pour l'analyse quantitative et qualitative, et c'est
une méthode à élément simple. Ses usages les plus importants portent sur la détermination
du sodium, du potassium, du lithium et du calcium dans les fluides et tissus biologiques.
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5. Réfractométrie
1. Définition
2. Principe
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3. Intérêt
4. Utilisation
1. Procédure d'étalonnage (si non étalonné d'usine) Rendre le prisme parfaitement
propre.
2. Déposer quelques gouttes de produit d'étalonnage fourni avec le réfractomètre.
3. Rabattre le volet sur le prisme, en exerçant une petite pression de façon que le produit
soit étalé de manière uniforme et sans bulles d'air.
4. Attendre quelques secondes que le produit soit à la même température que le prisme.
5. Exposer le réfractomètre à la lumière puis regarder à travers l'optique.
6. Noter l'indice de réfraction, si celui-ci n'est pas identique à l'indice du produit
d'étalonnage fourni dans la documentation ajuster avec la vis de réglage.
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6. Polarimétrie
1. Définition
2. Principe
La lumière polarisée a été découverte par Malus en 1809. Une lumière "normale" est
composée d'un champ électrique et d'un champ électromagnétique : on parle aussi d'onde
électromagnétique. Limitons nous au champ électrique, celui auquel l'œil est sensible. Ce
champ peut prendre n'importe quelle direction. Dans une lumière polarisée, le champ
électrique est limité à une seule direction.
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3. Utilisation
4. Intérêt
C’est ainsi que dans les sucreries on mesure la concentration de sucre des betteraves
qui sont achetées. On paye les agriculteurs en fonction de cette contenance en sucre. Il existe
plusieurs variétés de tube de polarimétrie, avant (début 20ème siècle) ils étaient en cuivre. De
nos jours les tubes sont en verre, beaucoup plus petits et le processus est entièrement
automatisé. Le liquide entre par un côté et ressort de l’autre. C’est toujours une technique de
référence pour les sucreries. Système rapide et très fiable.
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Glossaire
HAP
La combustion incomplète de produits organiques entraîne la formation d'hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) dont certains sont des carcinogènes probables pour
l'homme. Les HAP se forment dans les aliments durant le processus de chauffage et de
séchage lorsque les produits de combustion entrent en contact direct avec l'aliment.
De grandes quantités d'HAP peuvent se retrouver dans les huiles raffinées. L'HAP peut en être
extrait par passage sur charbon actif. Une autre source possible de HAP est le dépôt de
pollutions marines sur les poissons et fruits de mer. Il existe pour certaines denrées
alimentaires une limite maximale pour l'un des HAP les plus toxiques : le benzopyrène.
Depuis le 1/7/2012, une norme est également d'application pour la somme de 4 HAP :
benzopyrène, benzanthracène, benzofluoranthène et chrysène.
Les PCB trouvent leur origine dans les activités humaines. Ils ont été utilisés pendant des
décennies dans diverses applications industrielles, telles que le liquide de refroidissement des
transformateurs électriques, des pigments, peintures,... Ils ont été utilisés non comme
congénère individuel, mais sous la forme de mélanges complexes. L’utilisation des PCB est
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actuellement interdite dans l'UE. La prévention et la réduction de l'exposition humaine
s’opère d’une part en s’attaquant aux sources, par exemple en gardant sous contrôle des
processus industriels, en prenant des mesures qui limitent ou éliminent l’émission, … et
également en éliminant les produits contaminés de la chaîne alimentaire. Bien que l'utilisation
des PCB soit interdite, ils peuvent encore se retrouver par exemple dans de vieilles
installations électriques. Un traitement adapté des déchets est dès lors particulièrement
important.
MALDI-TOF
Un instrument de type MALDI-TOF (en anglais Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
- Time of Flight) est un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée
par une matrice (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) et un analyseur à
temps de vol (TOF, time-of-flight mass spectrometry).
Limite de détection
La plus petite concentration d'une substance recherchée qui peut être détectée selon une
méthode d'analyse donnée avec un degré de certitude spécifié.
Limite de dosage
La plus petite concentration d'une substance recherchée qui peut être mesurée selon une
méthode d'analyse donnée avec un degré de certitude spécifié.
Valeur cibe de l'écart-type
Valeur numérique de l'écart-type d'un résultat de mesurage, qui a été désignée comme objectif
pour la qualité du mesurage.
ppm
La partie par million (le ppm), terme beaucoup utilisé en sciences (toxicologie, formulation,
chimie, métallurgie, électronique, géochimie, etc. ), est la fraction valant 10–6, c'est-à-dire un
millionième. On utilise surtout le ppm pour exprimer une fraction massique (1 ppm = 1 mg/kg
).
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