Cat Logo Oficial de Medios de Cultivo

CLAVE:
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

CCAYAC-CT-03/6
CATÁLOGO OFICIAL DE MEDIOS DE CULTIVO HOJA: 1 DE 31
SUSTITUYE A:
VIGENTE A PARTIR DE: FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
CCAYAC-CT-003/5
2023-01-11 2029-01-11
FECHA: 2022-07-19
1. OBJETIVO
Establecer los lineamientos generales y específicos para la preparación y evaluación del desempeño de
los medios de cultivo preparados en el Departamento de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas
de la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC).
TA
2. ALCANCE
UL
Aplica a los medios de cultivo preparados y evaluados en el Departamento de Análisis y Desarrollo de
NS
Pruebas Microbiológicas de CCAYAC.
3. DEFINICIONES
CO
 Medios de mantenimiento: Su propósito es mantener cultivos puros para ser usados
DE
posteriormente en otras pruebas o para conservarlos por periodos prolongados de tiempo. Tales
medios son simples en términos de composición y no contienen componentes que puedan
O
favorecer un crecimiento excesivo.


NT
Medios Selectivos: Contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de microorganismos

indeseables seleccionando de esta manera el o los microorganismos deseados.

ME
Medios diferenciales: Contienen indicadores como colorantes que permiten diferenciar entre
microorganismos como resultado de reacciones bioquímicas que se llevan a cabo durante el
crecimiento de microorganismos, que se pueden observar mediante el cambio de color del
CU
indicador (colorante).
 Medio de enriquecimiento: Es un medio líquido en el cual la muestra es inoculada con la
DO
finalidad de aumentar la cantidad de ciertos microorganismos y al mismo tiempo suprimir el

crecimiento de otros no deseados.
 Medios selectivos y diferenciales: Son medios solidos que contienen ingredientes que
permiten diferenciar microorganismos de interés de otros que no lo son, del universo de
microorganismos presentes en una muestra.
CONTROL DE EMISIÓN
Elaboró: Revisó: Autorizó:
Imelda Rocío Guzmán Imelda Rocío Guzmán
Nombre: Alejandro Galindo García
Cervantes Cervantes
Firma y fecha:
"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

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4. DESARROLLO
Se deben seguir las indicaciones de solicitud de medios, preparación, control de calidad y entrega de
medios de cultivo conforme a lo indicado en los siguientes incisos
TA
A) SOLICITUD DE MEDIOS DE CULTIVO
UL
La solicitud de medios de cultivo se realiza de la siguiente forma:
NS
A.1. El usuario elabora una solicitud de preparación de medios de cultivo en el CCAYAC-F-227
CO
“Solicitud de medios de cultivo”, en original y copia. Anotar el nombre del solicitante, fecha y hora
de solicitud, laboratorio al que pertenece, el nombre y concentración del medio cuando proceda,
la cantidad en unidades de presentación (cajas Petri, tubos, frascos, matraces) y el volumen de
DE
cada unidad de presentación.

A.2. La fecha de recepción de las solicitudes de medios de cultivo es de lunes a viernes.
A.3. Recepción de solicitudes: el personal del área de medios de cultivo recibe el vale y se revisa que
O
cumplan con los datos arriba mencionados y se le asigna a cada medio un número consecutivo
NT
de solicitud de preparación medio.

ME
A.3.1. Se debe llenar el formato CCAYAC-F-474 “Preparación y evaluación del desempeño de

medios de cultivo” con los siguientes campos:
CU
 Medio de cultivo: anotar el nombre del medio solicitado.

 No. de lote: el formato asigna de manera automática el lote correspondiente a la siguiente
DO
nomenclatura: dd.mm.hh.ss, donde dd= día de preparación, mm=mes de preparación,

hh=hora de preparación, ss=segundo de preparación.
 Cantidad a preparar: el volumen solicitado más un excedente para realizar el control de
calidad.
 Fecha de preparación: el día de preparación.
 Realizado por: la persona que preparó.
 Formulación: Escribir el o los ingredientes, marca, lote, y cantidad en g o mL por litro.
 Cantidad requerida para 1000 ml: la computadora realiza el cálculo de la cantidad a pesar.
 Los demás campos son llenados por el personal encargado de preparar medios de cultivo.
 El personal encargado del control de calidad llena los campos mencionados en el CCAYAC-
F-474.
NOTA 1: Los únicos datos generados automáticamente son el número de lote y la cantidad
requerida a pesar por mL los demás datos deben ser llenados por los técnicos o analistas.

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NOTA 2: Para el caso de los medios de cultivo cuya formulación es comercial solo se debe
registrar el nombre del medio, marca, lote y cantidad en g o mL por litro. En caso de que el
medio se prepare por ingredientes se debe llenar cada uno de los ingredientes utilizados.
B) PREPARACIÓN
TA
La información de la composición de los medios de cultivo, soluciones y reactivos que se usan para los
UL
métodos analíticos se encuentra descrita en las fichas técnicas de preparación.
NS
Para consultar las fichas técnicas de preparación de los medio de cultivo, se debe revisar el siguiente
listado. Al hacer click en el nombre de cada medio se desplegara el archivo en formato PDF
CO
LISTADO DE FICHAS DE MEDIOS DE CULTIVO
DE
AGARES
O
CLAVE MEDIO
NT
AG-1 Agar ASTEL

AG-2 Agar Azul de Toluidina
ME
AG-3 Agar Baird Parker

CU
AG-4 Agar BCYE

AG-5 Agar de Hierro Kligler (KIA)
DO
AG-6 Agar de hierro y lisina (LIA)

AG-7 Agar Entérico de Hektoen
AG-8 Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)
AG-9 Agar Movilidad
AG-10 Agar Nutritivo
AG-11 Agar oxford
AG-12 Agar PALCAM
AG-13 Agar Sangre de Cordero
AG-14 Agar Soya Tripticaseina
AG-15 Agar Sulfito de Bismuto
AG-16 Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)

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AGARES
CLAVE MEDIO
AG-17 Agar TBX
TA
AG-18 Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)
AG-19 Agar Urea de Christensen
UL
AG-20 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
NS
AG-21 Agar-hierro-triple azúcar (TSI)
AG-22 Agar Dextrosa Sabouraud
AG-23 Agar para antibióticos #1
CO
DE

O

NT

ME

CU

DO

AG-36 Agar Papa Dextrosa
AG-37 Agar Glucosa Rojo Violeta Billis (RVBAG)
AG-38 Agar MacConkey
AG-39 Agar Cetrimida
AG-40 Agar Sal Manitol
AG-41 Medio de enriquecimiento para Clostrodios
AG-42 Agar Columbia
AG-43 Agar EMB-L
AG-44 Agar Citrato de Simmon

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AGARES
CLAVE MEDIO
AG-45 Agar Neutralizante
TA
AG-46 Agar Glucosa Rojo Violeta Billis (RVBA)
AG-47 Agar Cuenta Estándar
UL
AG-48 Agar Indicador PM
NS
AG-49 Agar Swarm
AG-50 Agar Mueller-Hinton
AG-51 Agar Vogel Jhonson
CO
AG-52 Agar Hígado de Ternera
DE
AG-53 Agar GVPC

AG-54 Agar Letheen modificado
O
AG-55 Agar Extracto de Malta

NT
AG-56 Agar Verde Brillante

AG-57 Agar Eosina Azul de Metileno (AEMB)
ME
AG-58 Agar SIM

AG-59 Agar modificado semi-solido Rappaport – Vassiliadis (MSRV)
CU
AG-60 Agar Listeria acorde a Ottaviani

DO
CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-1 Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa)
CL-2 Caldo Cerebro Corazón
CL-3 Caldo Fraser Completo
CL-4 Caldo Fraser Medio
CL-5 Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB)
CL-6 Caldo L-lisina descarboxilasa
CL-7 Caldo Muller Kauffmann Tetrationato
CL-8 Caldo Rappaport-Vassiliadis
CL-9 Caldo Rojo de Fenol

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CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-10 Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y T1N10
TA
CL-11 Caldo Tioglicolato
CL-12 Caldo Soya Tripticaseina
UL
CL-13 Caldo para antibioticos #3
NS
CL-16
CO
Caldo para antibioticos #39
DE
CL-18 Caldo Dextrosa Sabouraud

CL-19 Caldo Mossel de enriquecimiento para enterobacterias
O
CL-20 Caldo MacConkey

NT
CL-21 Caldo A1
CL-22 Caldo Lauril Triptosa
ME
CL-23 Caldo EC
CL-24 Caldo Triptona 1%
CU
CL-25 Caldo MR-VP

CL-26 Caldo Citrato de Koser
DO
CL-27 Caldo Lactosa Billis Verde Brillante

CL-28 Caldo Lauril Triptosa con MUG
CL-29 Caldo Neutralizante
CL-30 Caldo Soya Tripticaseina Sin dextrosa
CL-31 Caldo Urea
CL-32 Caldo Carne Cocida
CL-33 Caldo Glucosa Purpura de Bromocresol
CL-34 Caldo Extracto de Malta
CL-35 Caldo Ácido
CL-36 Caldo CSTEL
CL-37 Caldo Letheen modificado

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CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-38 Caldo Nitrato
TA
CL-39 Caldo Lactosado
SOLUCIONES
UL
CLAVE MEDIO
NS
SOL-1 Solución Reguladora de Fosfatos (0.25M)
SOL-2 Solución salina fisiológica
SOL-3 Agua Peptonada Alcalina
CO
SOL-4 Agua Peptonada Amortiguada
DE
SOL-5 Solución Peptonada al 0.1%

SOL-6 Solución Peptonada al 0.1% con polisorbato 80
O
SOL-7 Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

NT
SOL-8 Solución amortiguadora al 1% pH 6.0±0.05

SOL-9 Solución amortiguadora 0.1M pH 8.0±0.1
ME
SOL-10 Solución amortiguadora 0.1M pH 4.5±0.05

SOL-11 Solución amortiguadora 10% pH 6.0±0.05
CU
SOL-12 Solución amortiguadora 0.2 M pH 10.5±0.1

SOL-13 Solución amortiguadora 0.1 M pH 7.0±0.2
DO
SOL-14 Solución Reguladora de Fosfatos (0.25M) diluida

SOL-15 Solución Neutralizante Concentrada
SOL-16 Solución Neutralizante Diluida
SOL-17 Agua Peptonada
SOL-18 Solución Reguladora de Fosfatos pH 6
SOL-19 Buffer de Extracción
SOL-20 Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS)
SOL-21 Triton X
SOL-11 Sauton diluido

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REACTIVOS
CLAVE REACTIVO
REC-1 Reactivo de Kovacs
TA
REC-2 Reactivo de β-Galactosidasa
REC-3 Reactivos para la prueba de VP
UL
REC-4 Reactivos para la reacción de Indol
REC-5 Reactivos para la tinción de Gram
NS
REC-6 Reactivo Azul de Bromotimol 0.04%
CO
B.1. PESADO
DE
Leer cuidadosamente la etiqueta o la fórmula del medio y pesar exactamente la cantidad indicada en
una balanza granataria o analítica dependiendo de la cantidad a pesar, la cual debe estar calibrada
y verificada. Medidas de seguridad para pesar, usar máscara anti polvo y guantes desechables de
O
vinilo cuando así se indique en la etiqueta.

NT
B.2. HIDRATACIÓN
ME
Colocar la mitad del volumen de agua tipo I a preparar en un contenedor de al menos el doble del
volumen solicitado.
CU
Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10 a 15 minutos para su completa humectación. Se

puede utilizar un agitador magnético. Adicionar el resto de agua y mezclar procurando que el resto
DO
del polvo adherido a las paredes del recipiente, se resbale e integre al resto del medio.
Si es necesario, calentar ligeramente o calentar a ebullición para la completa disolución del polvo, en
una parrilla caliente con agitación o en la flama utilizando una rejilla y agitando de manera continua,
evitando que el medio se derrame o se pegue al recipiente por calentamiento excesivo; si es
necesario durante la ebullición disminuir la temperatura o la flama o someter en un baño de agua fría
para evitar que el medio se derrame. La disolución total se reconoce cuando al agitar el medio no se
adhieren partículas en las paredes y el medio es transparente.
NOTA: Todo medio es sensible al calentamiento, por ese motivo no debe calentarse más de lo
necesario.

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B.3. DETERMINACIÓN DE pH
Medir el pH del medio con un potenciómetro previamente calibrado con soluciones de referencia pH.
4, 7 y 10. La temperatura del medio y de las soluciones de referencia deben estar a temperatura
ambiente, ya que de lo contrario las lecturas serán imprecisas (verificar la temperatura en el
TA
termómetro integrado del equipo).
Registrar los datos en el formato de registro de pH.
UL
Ajustar si es necesario con soluciones de hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N, para el caso
NS
de soluciones amortiguadoras o diluyentes de acuerdo a la formulación correspondiente.
CO
Para determinar el pH final de medios sólidos, macerar una alícuota con una varilla de vidrio e
introducir el electrodo para determinar el pH.
DE
B.4. ENVASADO
Distribuir en tubos, frascos o matraces la cantidad necesaria del medio de cultivo limitando el volumen
a las ¾ partes de la capacidad del recipiente. Etiquetar los envases con el nombre del medio, fecha
O
de preparación e iniciales de quién preparó. Para los medios donde el volumen es crítico, considerar
NT
la cantidad perdida de volumen durante la esterilización.

ME
Utilizar frascos, matraces o tubos que eviten la evaporación y contaminación del medio con tapa de
rosca de baquelita las cuales durante la esterilización deben estar flojas; alternativamente se puede
CU
utilizar papel aluminio en las tapas. Colocar cinta indicadora de esterilización en los envases.
Para medios líquidos se puede utilizar un dosificador automático. Los dosificadores manuales se
DO
recomiendan para un menor número de tubos.

Para los medios que contiene colorantes se recomienda envasarlos en frascos ámbar.
B.5. ESTERILIZACIÓN
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos o de acuerdo con los procedimientos recomendados para cada
medio o lo que indique el fabricante. El autoclave debe estar previamente evaluada con esporas de
Geobacillus stearothermophylus sometidas a un ciclo de esterilización e incubadas a 60°C ±2°C por
48 horas mensualmente y con ciclos de esterilización validados. Para los medios líquidos que se
vayan a utilizar en el área de esterilidad se debe realizar la esterilización del agua previa a la
preparación y registrarlo en el formato de Preparación de medios líquidos de esterilidad.
No sobrecargar la autoclave ya que se reduce su eficiencia.

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Registrar tiempo, temperatura, presión de los medios a esterilizar en cada ciclo de esterilización en
el formato de registro de esterilización por calor húmedo y en el registro de uso de olla de presión
para tratamientos térmicos diferentes a la esterilización.
Los medios que contienen carbohidratos u otros ingredientes no estables al calor se deben esterilizar
TA
por filtración de membrana de 0.45µm.
UL
B.6. ADICIÓN DE SUPLEMENTOS
Cualquier ingrediente termolábil debe obtenerse e incorporarse en condiciones asépticas al medio de
NS
cultivo estéril, a una temperatura no mayor de 50 ºC o lo que indique el fabricante. Para medios de
cultivo sólidos el suplemento debe estar a temperatura ambiente para evitar la solidificación antes de
CO
su incorporación total al medios.
B.7. VERTIDO EN CAJA PETRI
DE
Distribuir en condiciones asépticas volúmenes de medio fundido a temperatura de 45 a 50 ºC en cajas

Petri evitando la formación de burbujas. Permitir el secado del agar en una campana de flujo laminar
O
horizontal. Almacenar las placas con la base de la caja hacia arriba para evitar que se acumule la
humedad del agar y haya posible contaminación.
NT
B.8. CONSERVACIÓN Y USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

ME
La mayoría de los medios deben conservarse en refrigeración de 2 a 8 ºC con su respectivo registro

de temperatura. Sin embargo siempre se deben seguir las instrucciones indicadas por el fabricante.
CU
El área asignada para el almacenamiento de medios debe ser exclusiva para tal fin, separada de
muestras o cualquier posible fuente de contaminación cruzada, en lugares limpios, secos, protegidos
DO
de la luz directa del sol y polvo perfectamente bien cerrados e identificados. Los medios que contienen
fosfatos o tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, debido a que se pueden precipitar
a temperatura baja. El tiempo y condiciones de almacenamiento depende de cada tipo de medio de
acuerdo con las instrucciones del fabricante; en general se recomienda que los caldos y agares
envasados en tubos o frascos con tapa de rosca bien cerrados, no se usen después de 4 semanas
de su preparación en refrigeración y no más de 2 semanas a temperatura ambiente. Los agares en
placa para control ambiental por no más 4 semanas y para otro tipo de agares lo que indique el
fabricante, en refrigeración siempre y cuando se conserven en condiciones que eviten su
deshidratación. Los medios conservados en refrigeración deben sacarse antes de su uso para permitir
que alcancen la temperatura ambiente y evitar la presencia de agua de condensación.
No se deben utilizar medios sólidos o líquidos que muestren signos de deshidratación o evaporación
respectivamente.

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Fundir el medio sólido en olla de presión sin sobrecargar. No fundir el medio más de una vez.
Una vez fundido el medio debe ser utilizado dentro de las siguientes 3 horas mantenido a 45 ± 1°C.
Si se forma algún precipitado o un cambio anormal en la coloración desechar el medio.
TA
Utilizar los medios que contienen sustancias perecederas o antibióticos inmediatamente después de
su preparación y de preferencia elaborar primero la base que puede almacenarse y el día de su uso
UL
agregar el complemento perecedero.
NS
B.9. ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DESHIDRATADOS
En general los medios deshidratados deben estar almacenados en contenedores bien cerrados en
CO
lugares frescos, secos, protegidos de la luz o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si el
medio ambiente es húmedo y caliente, los medios deben ser almacenados en refrigeración. La
mayoría de los medios de cultivo deshidratados, son estables por al menos 3 años siempre y cuando
DE
sean almacenados adecuadamente, por lo que la compra debe ser planeada para que el medio se
termine en un año.
O
C) CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO

NT
C.1. EVALUACIÓN FÍSICA

Verificar en forma visual la apariencia y color, en los caldos no debe haber turbiedad o material
ME
precipitado, existen excepciones como el caldo tetrationato cuya apariencia física particular y
diferente se especifica en la parte de fórmulas de cada medio de cultivo. Los agares deben de tener
CU
una consistencia firme y de color característico.

Verificar los volúmenes con una probeta calibrada y/o verificada. Registrar datos en la bitácora
DO
CCAYAC-B-536 “REGISTRO DE VOLUMEN FINAL DE MEDIOS DE CULTIVO”
C.2. PRUEBA DE ESTERILIDAD

Incubar el 5% del lote de medio de cultivo preparado a 35 ± 1 ºC por 24 a 48 horas para mesofílicos
aerobios y a 25 ± 1 ºC por 3 a 5 días para mohos y levaduras dependiendo del tipo de medio.
Observar si los medios presentan algún signo de contaminación. Descartar el lote si está
contaminado. Registrar resultados.
C.3. DETERMINACIÓN DE pH
Determinar el pH en los medios de cultivo preparados con un potenciómetro calibrado como lo
describe este catálogo.

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D) EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo utilizados en el área de Microbiologia
farmacéutica, revisar el Anexo 1 de este documento.
TA
Para el resto de los medios de cultivo proceder como se indica a continuación:
UL
D.1. PREPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL INÓCULO.
Para cada una de las cepas control realizar lo siguiente:
NS
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticasa de 24 horas a 35 °C, transferir una
colonia a 10 mL de caldo BHI incubar 18 horas a 35°C.
CO
 Tomar un mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución salina
(0.85%) peptonada al 0.1% (10-1 – 10-10), hasta obtener una densidad microbiana de no más de
100 a 150 UFC/ml.
DE
 Sembrar 1ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en placa
con AST o tomar 0.1ml y sembrarlo por extensión en placa con AST por duplicado.
O
 Incubar las cajas invertidas a 35°C durante 24 horas. Contar las colonias para conocer en que
NT
dilución se encuentra el inóculo deseado.

 Realizar este procedimiento varias veces hasta obtener resultados repetibles. Una vez
ME
establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubándolo bajo las condiciones
establecidas en el método.
CU
NOTA 1: Alternativamente se pueden usar métodos nefelométricos o espectrofotométricos para

el ajuste del inoculo de las cepas.
DO
NOTA 2: Para el uso de inóculos de los liofilizados, seguir las instrucciones de uso del
fabricante.
D.2. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS

CUANTITATIVAS
 Preparar los cultivos de acuerdo, en una concentración de menos de 100 UFC del
microorganismo blanco.
 Seleccionar dos placas que estén secas del medio a probar y dos placas del medio de referencia
AST. Sembrar 1ml del inoculo y sembrar por vaciado en placa o sembrar 0.1ml del inoculo si son
sembradas por extensión en placa.
NOTA: Consultar e interpretar los anexos E y F de la norma ISO 11133 para los microorganismos
de prueba comúnmente usados y recomendados para cada tipo de medio

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Coeficiente de productividad:
TA
PR = (Ns / No)
UL
Dónde
NS
PR = Coeficiente de productividad
Ns = Es la cuenta total obtenida del medio de cultivo a probar
CO
No = Es la cuenta total obtenida del medio de referencia (AST) y deberá ser ≤ 100 UFC/ mL
Interpretación de resultados:
Agares no selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de ≥ 0.7
DE
Agares selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de ≥ 0.5
D.3. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS

O
CUALITATIVAS
NT
ME
Prueba de productividad y especificidad
 Preparar cultivos de trabajo como se describe en el inciso D.1

CU
 Para la prueba de productividad y especificidad, utilizar placas de medio a probar estriando

con asa de 1 µl para cada microorganismo de prueba de manera que se obtengan colonias
DO
aisladas.
 Para selectividad usar un medio de prueba y estriar cada microorganismo de prueba con
una sola línea recta en la misma placa paralelamente sin que se crucen las estrías, deben
ser distinguibles para permitir la observación morfológica típica y tamaño de la colonia.
Incubar las placas bajo condiciones definidas en los métodos de prueba correspondientes.
Interpretación de resultados
El crecimiento de las placas se evalúa como sigue:
- 0 Corresponde a no crecimiento
- 1 Corresponde a crecimiento débil (aun cuando se reduzca el crecimiento o el tamaño de la
colonia)
- 2 Corresponde a buen crecimiento

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La calificación del microorganismo blanco debe ser 2 y tener apariencia típica, tamaño y
morfología colonial (especificidad). Para las pruebas de selectividad dependerá del grado de
inhibición y de tipo de medio. El crecimiento para microorganismos no blanco deber ser
parcialmente inhibidos o completamente inhibidos.
TA
D.4. MÉTODOS PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS LÍQUIDOS. PRUEBAS
UL
CUANTITATIVAS (DILUCIÓN HASTA EXTINCIÓN DEL INÓCULO).
NS
Método adecuado para medios selectivos o no selectivos usados para medios líquidos para
enumeración como NMP CO
Preparar el inóculo de acuerdo a lo siguiente:
 Sembrar 1ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en placa
DE
o 0.1 ml por extensión en placa en AST.

 Incubar las cajas invertidas a 35°C durante 24 horas. Contar las colonias para conocer en que
O
dilución se encuentra el inóculo deseado (≤100 UFC).

 Una vez establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubándolo bajo las
NT
condiciones establecidas en el método de prueba y 2 o más diluciones hasta la extinción del

inóculo.
ME
NOTA: Para el uso del inóculos de liofilizados, seguir las instrucciones de uso del fabricante si
este es el caso no se debe realizar la extinción del inoculo.
CU
D.5. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SELECTIVOS LÍQUIDOS

DO
 Preparar los inóculos para los microorganismos blancos y no blancos de acuerdo a lo establecido
en el inciso D.1
 Para microorganismos blanco el inoculo debe ser de ≤100 UFC
 Para microorganismos no blanco ≥1000UFC
 Alternativamente se puede usar inóculos liofilizados y seguir las instrucciones del fabricante.
 Inocular el medio líquido a probar con los inóculos preparados e incubar de acuerdo al método
de prueba correspondiente. Posteriormente estriar ambos inóculos con un asa de 1 µl en el medio
selectivo correspondiente como XLD.
 Incubar de acuerdo a lo indicado en el método correspondiente.
 Interpretación de resultados
 La productividad del medio líquido es satisfactoria si hay crecimiento confluente en al menos una
línea del microorganismo blanco en el medio específico para el microorganismo.

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 Selectividad del medio líquido es satisfactoria si no hay crecimiento en el microorganismo no

blanco o crecimiento parcial.
TA
D.6. MEDIOS DE PRE ENRIQUECIMIENTO
 Preparar cultivos de trabajo como se describe en el inciso D.1
UL
 Inocular el medio de pre eriquecimiento a probar con un inóculo de ≤100 UFC
 Incubar de acuerdo a lo indicado en el método correspondiente
NS
 Interpretación de resultados
 Se reconoce un resultado satisfactorio si al agitar el tubo se observa la presencia de turbiedad
CO
y/o gas, células agregadas, depósito de desarrollo en la base del tubo o la botella y cambio de
color.
DE
E) TOXICIDAD DEL DILUYENTE (REGULADOR DE FOSFATOS)

O
E.1. Método de prueba cuantitativo para diluyentes

El método determina la habilidad del diluyente para mantener vivos a los microorganismos sin
NT
multiplicarse o reducirse durante un periodo de contacto antes de que sean inoculados en agar o
medio líquido.
ME
E.2. Procedimiento
CU
 Inocular una porción a probar (por ejemplo 9 ml) del diluyente con 1 ml del microorganismo
conteniendo 10 4 UFC/ml y mezclar. Inmediatamente tomar 0.1ml del diluyente inoculado y
DO
sembrar por extensión en placa por duplicado sobre la superficie en agar no selectivo (medio
de referencia) como AST (t0).
 Mantener el diluyente inoculado a temperatura ambiente por el tiempo especificado apropiado
descrito en el método de prueba empleado, entre la preparación de la suspensión inicial y el
momento cuando el inóculo está en contacto con el medio de cultivo (normalmente 45 minutos).
 Mezclar y tomar el mismo volumen (0.1ml) e inocular por duplicado las placas de medio de
referencia (t1).
 Incubar el medio de referencia a una temperatura y tiempo apropiados como 35 ° C por 24
horas.
 Lectura e interpretación de datos
 Después de la incubación contar las colonias en las placas a tiempo t1 y t2 y realizar los
promedios de los duplicados. El número de microorganismos, t1, después de la incubación del
diluyente debe estar dentro de ±30% de la cuenta inicial (t0)
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Promedio de la cuenta al tiempo 45’t45 - Promedio de la cuenta al tiempo 0’ t0 X 100

Promedio de la cuenta al tiempo 0’
E.3. Interpretación de resultados
TA
Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre ± 30%.
UL
Realizar la prueba cada mes y registrar los resultados.
NS
F) ENTREGA DE MEDIOS DE CULTIVO
F.1. Los medios de cultivos ya preparados se deben recoger de preferencia al siguiente día de su
CO
preparación o el mismo día por el solicitante anotando quien entregó, la hora y fecha.
F.2. El usuario deberá firmar de recibido en el formato correspondiente, revisando que todos los datos
de preparación y almacenamiento estén correctos.
DE
F.3. Una vez que los medios preparados salen del área de preparación de medios de cultivo, es
responsabilidad del solicitante la correcta conservación de los mismos (ver. conservación y uso
O
de los medios de cultivo preparados). No pueden ser procesadas quejas de medios de cultivo
NT
cuyo tiempo, temperatura y forma de conservación no se apegue a las instrucciones de este

catálogo o lo indicado por el fabricante.
ME
4.1 POLÍTICAS GENERALES

CU
 En la mayoría de los casos se pueden obtener medios en forma deshidratada. Las fórmulas
pueden estar disponibles en varias marcas comerciales y se deben preparar de acuerdo con las
DO
instrucciones del fabricante.

 Debido a que pueden existir algunas diferencias entre marcas, es necesario que el laboratorio
determine la funcionalidad de los medios rutinariamente como parte de un programa de control
de calidad. Los medios deshidratados pueden usarse a menos que en el método se recomiende
lo contrario, recomiende alguna marca por no estar disponible en el mercado o por haberse
evaluado diversas marcas comerciales.
 Para algunos ingredientes o reactivos que se utilizan en la preparación de medios de cultivo o
soluciones, el fabricante no dispone de una fecha de caducidad declarada en el certificado de
calidad ya que lo considera solo como requisito para productos perecederos que son utilizados
en humanos como alimentos, fármacos o en análisis clínicos.
Por tal motivo, en los casos que se tengan reactivos sin fecha de caducidad declarada por el
fabricante, se considera que la vida media de un reactivo almacenado a temperatura ambiente
es de 5 años, reactivos en refrigeración de 3 años y reactivos congelados de 1 año, todos a partir
de la fecha de entrega del producto, por lo que en caso de utilizar este tipo de reactivos se deberá

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llenar el formato Etiqueta para sustancias químicas no peligrosas, indicando la fecha de recepción
y apertura del insumo, y la caducidad será conforme lo estipulado anteriormente.
 Es recomendable emplear siempre que sea posible medios de cultivo deshidratados comerciales
a menos que el método de prueba indique que se elabore a partir de ingredientes.
TA
 Se deben respetar estrictamente las indicaciones del fabricante y/o las estipuladas en este
documento.
UL
 Los medios de cultivo son muy higroscópicos, por lo que hay que evitar tener los frascos
destapados por mucho tiempo. Abrir un frasco nuevo solo cuando el que este en uso se haya
NS
terminado, anotar en el frasco la fecha de apertura.
 No mezclar medio de cultivo o reactivos de frascos de diferente lote.
CO
 No usar medios apelmazados, con cambios en la coloración o textura, aun cuando no hayan
expirado.
 Los contenedores donde se preparen o se envasen los medios de cultivo deben ser de
DE
borosilicato, libres de inhibidores microbianos, enjuagados con agua tipo I, perfectamente limpios,
libres de residuos de detergente alcalino, para lo cual se debe realizar la prueba de residuos de
O
detergente alcalino, aleatoriamente y al menos dos veces al mes; adicionando al material seco
NT
unas gotas de indicador azul de bromotimol al 0.04% y registrarlos en el formato y/o bitácora
correspondiente.
ME
 El agua tipo I que se utilice para preparar los medios de cultivo debe cumplir con lo establecido
en el CCAYAC-P-040 “Procedimiento para la recolección, uso, distribución, almacenamiento y
control del agua usada en CCAYAC”. Los resultados del análisis microbiológico se registrarán en
CU
la bitácora del Análisis microbiológico de agua tipo I, tipo II y red municipal.

 El laboratorio donde sean procesadas las muestras no debe rebasar de 15 colonias en 15 minutos
DO
de exposición de una placa de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de levadura
 Condiciones del laboratorio: Llevar acabo la prueba en condiciones asépticas. Limpiar y
desinfectar el área y registrar en el CCAYAC-F-586 “Limpieza y sanitización de áreas de trabajo
de microbiología farmacéutica”.
5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Documentos Clave
5.1 Instructivo para el manejo de las autoclaves CCAYAC-I-001
5.2 Instructivo de uso de baños para control de temperatura CCAYAC-I-003
5.3 Instructivo para la operación de incubadoras CCAYAC-I-011
5.4 Instructivo de uso y verificación de potenciómetros CCAYAC-I-017

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Documentos Clave
5.5 Instructivo para lavado y uso de refrigerador y congelador CCAYAC-I-018
5.6 Instructivo de operación para manejo y uso de las balanzas granatarias CCAYAC-I-026
5.7 Instructivo para el uso de contadores de colonias CCAYAC-I-062
TA
6. BIBLIOGRAFÍA
UL
NS
Documentos
6.1 FEUM 13.0, Tomo I, MGA 0571, pp. 463-473. México 2021.
CO
DE
ISO 11133 Microbiology of food, animal feed and water--- Preparation, production, storage and
6.4
performance testing of culture media.
O
Bacteriological Analytical Manual US Food and Drug Administration Center for Food Safety Applied
NT
6.5
Nutrition.
6.6 Buenas prácticas de la OMS para laboratorios de Microbiología Farmacéutica
ME
6.7 Buenas prácticas de la OMS para laboratorios de Control de Calidad de productos Farmacéuticos
CU
7. ANEXOS
DO
ANEXO 1. PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS EN LA PRUEBA DE

ESTERILIDAD, LÍMITES MICROBIANOS Y VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS.
ANEXO 2. ELABORACIÓN DE FICHAS TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO,

SOLUCIONES Y REACTIVOS.

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ANEXO 1.
PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS EN LA PRUEBA DE
ESTERILIDAD, LÍMITES MICROBIANOS Y VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS.
TA
La prueba de promoción de crecimiento se realiza con el fin de garantizar la funcionalidad de los medios
de cultivo y consiste en demostrar la capacidad del medio para permitir el crecimiento de una cantidad
UL
determinada de microorganismos control. Esto se consigue inoculando muestras representativas de cada
lote del medio de cultivo listo para su uso con una cantidad determinada de microorganismos para poner
NS
de manifiesto que estos pueden recuperarse bajo las condiciones de prueba. Adicionalmente en el caso
de los medios de cultivo utilizados para el análisis microbiológico de productos farmacéuticos no estériles
CO
se evalúa el desempeño respecto a las propiedades inhibidoras e indicadoras de los medios selectivos.
1. Preparación de los inóculos

DE
1.1. Inóculos comerciales estandarizados

O
Reconstituir el liofilizado de acuerdo a lo indicado en el instructivo del fabricante para obtener de

NT
10 a 100 UFC de cada microorganismo de prueba cuando vaya a realizarse la prueba de

promoción de crecimiento y más de 100 UFC cuando sean usadas para evidenciar la inhibición
ME
del crecimiento, esto según lo indicado en las tablas 1 a la 4.

CU
1.2. Estandarización de inóculos en el laboratorio (en los casos en que no se dispone de

inóculos comerciales estandarizados).
DO
1.2.1. Preparación del inoculo de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC
6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella
typhimurium ATCC 14028, Kocuria rhizophila ATCC 9341, Staphylococcus epidermidis
ATCC12228.
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticaseína de 24 horas (h) a 32.5
°C± 2.5 °C, transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e incubar de 18h a 24h a 32.5
°C± 2.5 °C, en condiciones de aerobiosis.
 Tomar un mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución
salina (0.85%) peptonada al 0.1% (de 10-1 a 10-10), hasta obtener una densidad
microbiana de no más de 100 UFC/mL.
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en agar soya tripticaseína las diluciones
apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inoculo de no más de 100 UFC / mL

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cuando las cepas son empleadas para evidenciar la promoción de crecimiento en los
medios de cultivo, cuando sean usadas para evidenciar la inhibición de crecimiento en
los medios de cultivo deben ajustarse a más de 100 UFC/mL) De acuerdo a tablas 1 y 2.
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 32.5 °C± 2.5 °C
TA
por 24 horas.
UL
1.2.2. Preparación del inoculo de Clostridium sporogenes ATCC 11437 y ATCC 19404
NS
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticaseína de 24h a 32.5 °C± 2.5
°C, en condiciones de anaerobiosis. Transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e
CO
incubar de 18h a 24h a 32.5 °C± 2.5 °C.
DE

 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en agar soya tripticaseína las diluciones
O
apropiadas para obtener el inoculo deseado, (un inóculo de no más de 100 UFC/mL
NT
cuando las cepas son empleadas para evidenciar la promoción de crecimiento en los
medios de cultivo).

ME
Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de anaerobiosis a 32.5 °C± 2.5
°C por 24 horas.
CU
1.2.3. Preparación del inoculo de Candida albicans ATCC 10231

DO
 A partir de los cultivos desarrollados en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas a 22.5

°C± 2.5 °C, transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e incubar 48 h a 22.5 °C± 2.5
°C, en condiciones de aerobiosis.
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en Agar Dextrosa Sabouraud las diluciones
apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inóculo de no más de 100 UFC / mL
cuando la cepa es empleada para evidenciar la promoción de crecimiento en los medios
de cultivo).
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 22.5 °C± 2.5 °C
por 48 horas.

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1.2.4. Preparación del inoculo de Aspergillus brasiliensis ATCC16404
 A partir de los cultivos desarrollados en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas a 22.5 °C±
2.5 °C, recuperar las esporas con solución salina (0.85%) peptonada al 0.1% y adicionada
TA
con polisorbato 80 al 0.05%
 Tomar un mL de la suspensión anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución
UL
salina (0.85%) peptonada al 0.1% (de 10-1 a 10-5), hasta obtener una densidad microbiana de
no más de 100 UFC/mL.
NS
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado, en Agar Dextrosa Sabouraud las diluciones
apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inoculo de no más de 100 UFC / mL cuando
CO
la cepa es empleada para evidenciar la promoción de crecimiento en los medios de cultivo).
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 22.5 °C± 2.5 °C por
48 horas.
DE
2. Inoculación de los medios para la prueba de esterilidad

O
NT
2.1. Inocular muestras representativas de cada lote nuevo de medio de cultivo con 1mL de la dilución
que contenga no más de 100 UFC (o el volumen indicado por el fabricante) de cada uno de los
microorganismos indicados en la Tabla 1. Paralelamente inocular de la misma forma dos frascos
ME
de medio de cultivo del lote anterior aprobado y dos placas de un agar no selectivo, como AST,
esto con la finalidad de verificar que realmente se inocularon menos de 100 UFC. Los medios
CU
que deben inocularse se indican a continuación:

 Frascos de medio fluido de tioglicolato.
DO
 Frascos de caldo soya tripticaseína.

 Frascos de fluido A.
2.2. Para cada uno de los microorganismos de prueba, usar porciones independientes del medio de
cultivo.
2.3. Incubar los frascos en las condiciones establecidas en la tabla 1 según corresponda a cada
microorganismo, considerando incluir un frasco sin inocular como control negativo el cual se
debe incubar por 14 días.
2.4. Revisar si los frascos inoculados presentan turbidez como evidencia del crecimiento microbiano
y registrar.
2.5. Criterios de aceptación

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 Se debe observar crecimiento microbiano claramente visible, en todos los medios

inoculados en no más de tres días en el caso de bacterias y no más de cinco días en el
caso de hongos a las temperaturas indicadas.
 El control en agar no selectivo debe tener menos de 100 UFC.
TA
 El nivel de turbidez del medio del lote nuevo y el lote previamente aprobado debe ser
equivalente al comparar visualmente.
UL
 El control negativo no presenta crecimiento.
NS
2.6. Si no se cumplen los criterios de aceptación anteriormente descritos, la prueba es insatisfactoria
y el lote de medio se desecha y no se emplea en la prueba de Esterilidad.
CO
Tabla 1 Microorganismos de prueba para promoción de crecimiento para los medios de la prueba de Esterilidad
DE
Medios Tiempo
Temperatura de
de Microorganismos de prueba Condiciones máximo de
Incubación
cultivo incubación
O
ATCC6538 CIP4.83
Tioglicolato (Medio “A”)
Staphylococcus aureus NCTC10788 Aerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días

NT
NCTMB9518
Medio Liquido de
ATCC9027 CIP 82.118

ME
Pseudomonas aeruginosa * Aerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días

NCIMB 8626
CU
ATCC 6633 ATCC11437

Clostridium sporogenes ** Anaerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días
NCTC532 CIP793
DO
ATCC 6633
Caldo Soya-tripticaseina
Bacillus subtilis CIP52.62 Aerobios 32.5 °C± 2.5 °C 3 días

NCIMB 8054
(Medio “B”)
ATCC10231
Candida albicans Aerobios 32.5 °C± 2.5 °C 5 días
IP 48.72 NCPF3179
ATCC16404
Aspergillus brasiliensis IP1431.83 Aerobios 22.5 °C± 2.5 °C 5 días
IMI149007
ATCC6538
Solución al 0.1 por
ciento de peptona
CIP4.83
(FLUIDO “A”)
Staphylococcus aureus Aerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días

NCTC10788
NCTMB9518
ATCC9027
Pseudomonas aeruginosa* CIP 82.118 Aerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días
NCIMB 8626

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Medios Tiempo
Temperatura de
de Microorganismos de prueba Condiciones máximo de
Incubación
cultivo incubación
ATCC 6633
Bacillus subtilis CIP52.62 Aerobios 32.5 °C± 2.5 °C 3 días
TA
NCIMB 8054
ATCC10231
Candida albicans IP 48.72 Aerobios 32.5 °C± 2.5 °C 5 días
UL
NCPF3179
ATCC 6633
NS
ATCC11437
Clostridium sporogenes ** Anaerobiosis 32.5 °C± 2.5 °C 3 días
NCTC532
CIP793 CO
* Kocuria rhizophila ( Micrococcus luteus ) ATCC 9341 Microorganismo alternativo: de Pseudomonas aeruginosa
**: Bacteróides vulgatus ATCC 8482 Microorganismo alternativo: de Clostridium sporogenes
ATCC American Type Culture Collection CIP Collection de l´Institut Pasteur IMI Commonwealth Mycological Institute
DE
NCPF National Collection of Pathogenic Fungi NCIMB The National Collection of Industrial and Marine Bactéria Limited
3. Inoculación de medios de cultivo para recuento microbiano de la prueba de límites
microbianos.
O
3.1. A partir de un inóculo estandarizado que contenga menos de 100 UFC, probar cada lote de
NT
medio preparado ya sea sólido o líquido forma independiente para cada microorganismo.
3.2. Por cada microorganismo de prueba de acuerdo a lo indicado en la tabla 2 inocular dos placas
ME
o tubos del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST (referencia), bajo las
mismas condiciones ambientales y técnicas. Incluir un control negativo del lote nuevo para dar
validez a la prueba.
CU
3.3. Incubar a la temperatura indicada en la tabla 2 durante un periodo no mayor al tiempo mínimo
establecido en la prueba.
DO
3.4. Criterios de aceptación
3.4.1. Medios sólidos.

 Debe haber crecimiento microbiano en el lote nuevo y el previamente aprobado.
 El recuento microbiano en cada placa no debe exceder las 100 UFC.
 El promedio de las cuentas del nuevo lote puede variar en un factor de 2 respecto del lote
previamente aprobado. Para conocer el factor de 2 (intervalo), dividir y multiplicar por 2 el
promedio calculado para un inóculo previamente estandarizado en un medio de cultivo
analizado y aprobado previamente (medio de referencia).
Ejemplo:
Cuenta promedio del medio a evaluar (lote nuevo): 47 UFC

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Cuenta promedio (Lote previamente aprobado de referencia): 44 UFC
Cálculo del factor 2: 44 UFC ÷2 = 22

44 UFC x 2 = 88
TA
El lote nuevo de preparación debe presentar una cuenta promedio entre 22 y 88 UFC, por lo que la cuenta
promedio del medio a evaluar (47 UFC) puede considerarse aceptable.
UL
El control negativo no presenta crecimiento.
NS
3.4.2. Medios líquidos.
 Se debe observar crecimiento microbiano claramente visible, en todos los medios inoculados
CO
en no más de tres días en el caso de bacterias y no más de cinco días en el caso de hongos
a las temperaturas indicadas.
 El control en agar no selectivo debe tener menos de 100 UFC.
DE
 El nivel de turbidez del medio del lote nuevo y el lote previamente aprobado debe ser
equivalente al comparar visualmente.
O

NT
4. Inoculación de medios de cultivo usados para determinación de microorganismos específicos

ME
de la prueba de límites microbianos.

CU
Inocular los medios sólidos o líquidos con el tipo de microrganismo apropiado según la prueba que
vaya a realizarse, de acuerdo a lo descrito en la tabla 3. Las pruebas que se realizan a estos medios
DO
son las siguientes:
4.1. Promoción de crecimiento a medios sólidos o líquidos.

 Se inoculan con no más de 100 UFC del microorganismo de referencia. En el caso de medios
sólidos usar el método de extensión en superficies.
 Por cada microorganismo de prueba de acuerdo a lo indicado en la tabla 3 inocular dos placas
o tubos del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST (referencia), bajo
las mismas condiciones ambientales y técnicas. Incluir un control negativo del lote nuevo
para dar validez a la prueba.
 Incubar a la temperatura indicada en la prueba (ver tabla 3) durante un tiempo no mayor al
mínimo establecido también en la prueba.
 Revisar los medios inoculados en busca de crecimiento microbiano y registrar.
Criterios de aceptación:
 Los mismos que los enlistados en el numeral 3.4 del presente anexo.

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4.2. Determinación de las propiedades selectivas en medios sólidos o líquidos.

 Se inoculan con mínimo 100 UFC. En el caso de medios sólidos usar el método de extensión
en superficies.
TA
 Se inoculan dos tubos o placas del lote nuevo a probar y paralelamente se inocula de la
misma forma dos placas un agar no selectivo, como AST, esto con la finalidad de verificar el
UL
tamaño del inoculo utilizado, ya que el medio podría inhibir el crecimiento de los
microrganismos que deberían crecer en él.
NS
 Incubar a la temperatura especificada en la tabla 3 durante un tiempo no menor al tiempo
máximo indicado en la prueba. Incluir un control negativo del lote nuevo a probar que debe
CO
ser tratado en las mismas condiciones de incubación.
 Revisar los medios inoculados en busca de inhibición del crecimiento microbiano en los
medios selectivos y registrar.
DE
O
 El crecimiento microbiano debe ser inhibido en el medio selectivo.

NT
 El recuento microbiano debe ser mayor a 100 UFC en el agar no selectivo de referencia.
ME
4.3. Determinación de las propiedades diferenciales en medios sólidos o líquidos.

 Se inoculan con no más de 100 UFC del microorganismo de referencia. En el caso de medios
sólidos usar el método de extensión en superficies.
CU
o tubos del lote nuevo a probar, un lote previamente aprobado del mismo medio diferencial y
DO
un lote previamente aprobado de AST (referencia), todos bajo las mismas condiciones
ambientales y técnicas. Incluir un control negativo del lote nuevo para dar validez a la prueba.
 Incubar a la temperatura especificada durante un periodo de tiempo que se encuentre en el
intervalo indicado en la prueba (ver tabla 3).
 Las colonias deber tener apariencia similar en el lote nuevo y en el lote previamente
aprobado, en el caso de que no se disponga de un lote previamente aprobado, se debe tomar
como referencia las características diferenciales típicas descritas en la tabla 3.
 Además se deberán cumplir los criterios enlistados en el numeral 3.4 del presente anexo.
5. Inoculación de medios de cultivo usados para la valoración microbiológica de antibióticos.

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 A partir de un inóculo estandarizado que contenga menos de 100 UFC, probar cada lote de
medio preparado de forma independiente para cada microorganismo.
del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST (referencia), bajo las
TA
mismas condiciones técnicas y ambientales.
 Incubar a la temperatura indicada en la tabla 4 incluyendo un control negativo del lote nuevo
UL
para dar validez a la prueba.
NS
 Debe haber crecimiento microbiano en el lote nuevo y el previamente aprobado.
CO
 El recuento microbiano en cada placa no debe exceder las 100 UFC.
 El promedio de las cuentas del nuevo lote puede variar en un factor de 2 respecto del lote
previamente aprobado.
DE

O
Tabla 2. Promoción de Crecimiento para los medios de recuento microbiano de Límites Microbianos
NT
Tamaño
Microorganismo Condiciones
Medio de Resultado esperado
ME
de prueba de incubación
inóculo
≤100
S. aureus
UFC
CU
≤100 32.5 °C± 2.5 °C

P. aeruginosa
UFC ≤ 3 días
Crecimiento de 50 a 200% del promedio
DO
Agar Soya ≤100

B. subtillis de UFC obtenidas en el medio de
Tripticaseina UFC
referencia.
≤100
C. albicans
UFC 22.5 °C± 2.5 °C
≤100 ≤ 5 días
A. brasiliensis
UFC
≤100
S. aureus
UFC
≤100 32.5 °C± 2.5 °C
P. aeruginosa
UFC 24-48 h
Caldo Soya ≤100
B. subtillis Crecimiento visible (turbidez)
Tripticaseina UFC
≤100
C. albicans
UFC 22.5 °C± 2.5 °C
≤100 ≤ 5 días
A. brasiliensis
UFC

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≤100 22.5 °C± 2.5 °C

C. albicans Crecimiento de 50 a 200% del promedio
Agar dextrosa UFC ≤ 5 días
de UFC obtenidas en el medio de
Sabouraud ≤100 22.5 °C± 2.5 °C
A. brasiliensis referencia.
UFC ≤ 5 días
TA
Tabla 3. Evaluación de los medios para determinación de patógenos específicos de Límites Microbianos
UL
Temperatura
Cepas de Tamaño de Propiedad a
Medio y tiempo de Resultado esperado
prueba Inoculo evaluar
NS
incubación
Caldo Mossel de E. coli Promoción de
≤100 UFC Crecimiento visible (turbidez)
enriquecimiento P. aeruginosa crecimiento
CO 32.5 °C± 2.5 °C
para 24 - 48 horas
S aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
enterobacterias
Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC
DE
Promoción de obtenidas en el medio de referencia.

Agar glucosa rojo E. coli 32.5 °C± 2.5 °C
≤100 UFC crecimiento + E. coli: colonias rojo-púrpura rodeadas de un halo
violeta bilis P. aeruginosa 18 - 24 horas
diferencial de precipitación rojizo.
P. aeruginosa: colonias incoloras.
O
Promoción de
E. coli ≤100 UFC Crecimiento visible (turbiedad)
NT
crecimiento 43 °C± 1 °C,

Caldo MacConkey
24 - 48 horas
S. aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
ME
Promoción de Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC

32.5 °C± 2.5 °C
Agar MacConkey E. coli ≤100 UFC crecimiento + obtenidas en el medio de referencia.
18 - 72 horas
diferencial E. coli: colonias rosadas- rojizas.
CU
Caldo Rappaport Salmonella Promoción de

≤100 UFC Crecimiento visible (turbidez)
Vassiliadis de typhimurium crecimiento 32.5 °C± 2.5 °C
enriquecimiento
18-24 horas
DO
para Salmonella S. aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento

Salmonella Promoción de Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC
Typhimurium crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
Agar Xilosa, ≤100 UFC E. coli: colonias de amarillas a rojo amarillentas.
32.5 °C± 2.5 °C
lisina, Propiedad
E. coli 18-48 horas Salmonella Typhimurium: colonias rojas con
desoxicolato diferencial
centros de color negro.
S. aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
P. aeruginosa ≤100 UFC 32.5 °C± 2.5 °C
Agar Cetrimida crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
18 - 72 horas
E. coli ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento.
S. aureus ≤100 UFC crecimiento + 32.5 °C± 2.5 °C obtenidas en el medio de referencia.
Agar sal manitol
diferencial 18 - 72 horas Colonias amarillas de tamaño mediano.
E. coli ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
Medio de 32.5 °C± 2.5 °C
Promoción de
enriquecimiento C. sporogenes ≤100 UFC 48 horas. Crecimiento visible (turbiedad)
crecimiento
para clostridios Anaerobiosis.

CLAVE:
CCAYAC-CT-03/6
SUSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/5
2023-01-11 2029-01-11
FECHA: 2022-07-19
32.5 °C± 2.5 °C

Agar Columbia C. sporogenes ≤100 UFC 48 - 72 horas
crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
Anaerobiosis.
Caldo Dextrosa Promoción de 32.5 °C± 2.5 °C
C. albicans ≤100 UFC Crecimiento visible (turbiedad)
Sabouraud crecimiento 3 - 5 días
TA
Agar Dextrosa Promoción de 32.5 °C± 2.5 °C Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC
C. albicans ≤100 UFC
Sabouraud crecimiento 24 - 48 horas obtenidas en el medio de referencia.
UL
Tabla 4. Promoción de crecimiento para los medios utilizados en la Valoración microbiológica de antibióticos.
NS
Temp.
Tiempo
Medio incubación CO Microrganismos de prueba
incubación
(°C)
Agar para Kocuria rhizophila ATCC 9341

DE
32-35 24 horas
antibióticos #1 Staphylococcus aureus ATCC 6538
Agar para Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

O
32-35 24 horas
antibióticos #2 Staphylococcus aureus ATCC 6538
NT
Agar para
32-35 5 días Bacillus subtilis ATCC 6633
antibióticos #8
ME
Agar para
32-35 24 horas Bordetella bronchiseptica ATCC 4617
antibióticos #10
CU
Agar para Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

32-35 24 horas
antibióticos #11 Kocuria rhizophila ATCC 9341
DO
Agar para
29-31 48 horas Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
antibióticos #19
Agar para
32-35 5 días Bacillus subtilis ATCC 6633
antibióticos #32
Agar para
36-37.5 48 horas Mycobacterium smegmatis ATCC 607
antibióticos #35
Agar para
36-37.5 48 horas Mycobacterium smegmatis ATCC 607
antibióticos #36

CLAVE:
CCAYAC-CT-03/6
SUSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/5
2023-01-11 2029-01-11
FECHA: 2022-07-19
ANEXO 2.
ELABORACIÓN DE FICHAS TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO,
SOLUCIONES Y REACTIVOS.
TA
A. La información de la composición de los medios de cultivo, soluciones y reactivos que se usan
para los métodos analíticos se encuentra descrita en las fichas técnicas de preparación.
UL
B. En cada ficha de preparación, se incluye el nombre medio de cultivo, solución y/o reactivo, al cual
se le asigna una clave de la siguiente forma: AG= Medios de cultivo agar, CL= Medios de cultivo
NS
caldo, Sol = Soluciones, REC= Reactivos, seguido de un numero consecutivo conforme se vayan
anexando medios de cultivo a la lista. Además se incluye la composición, preparación, apariencia
CO
del medio preparado y observaciones.
Ejemplo:
AG-1 Agar ASTEL
DE
CL-1 Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa)

SOL-1 Solución Reguladora de Fosfatos 0.25 M
REC-1 Reactivo de Kovacs
O
NT
C. Para incluir, modificar o eliminar nueva ficha técnica de preparación en el listado del registro
electrónico se debe enviar una solicitud por correo electrónico a la Coordinación de medios de
ME
cultivo, con copia al encargado del Departamento de Análisis y Desarrollo de Pruebas

Microbiológicas (DMB) preferentemente con la siguiente información:
CU
 Nombre del medio, solución y/o reactivo

 Composición, indicando ingredientes, cantidad y unidades.
DO
 Preparación
 Apariencia del medio preparado
 Observaciones, en caso de tenerlas.
D. Una vez que se recibe la solicitud, el Coordinador de Medios de cultivo elabora la ficha técnica
de preparación asignando la clave correspondiente según se trate como lo indica el numeral B
de este anexo, y la guarda en la carpeta compartida de fichas técnicas de preparación. En caso
de solicitar una eliminación se debe quitar el hipervínculo de la ficha, sin embargo no se debe
eliminar del registro electrónico, conservando así el número consecutivo de la lista.
E. Posterior se debe incluir en el listado indicando clave y nombre del medio, solución y/o reactivo
e incluir el hipervínculo del archivo.
F. Se debe realizar la actualización del Catálogo, como lo indica el Procedimiento para la creación
o actualización, difusión, emisión y control de documentos del Sistema de Gestión de la Calidad.

CLAVE:
CCAYAC-CT-03/6
SUSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/5
2023-01-11 2029-01-11
FECHA: 2022-07-19
8. HISTÓRICO DE CONTROL DE CAMBIOS

CCAYAC-CT-03
Revisión y fecha Persona que Hoja donde
Cambios Relevantes de versión vigente
del documento elabora los se realiza el
con respecto a la anterior
anterior cambios cambio
TA
Todo el Se actualiza conforme a los lineamientos del CCAYAC-P-001 y
documento CCAYAC-IT-017 vigentes.
UL
Se elimina la solicitud programada de medios de cultivo y el
1
CCAYAC-F-490
NS
5 Ahora dice Geobacillus stearothermophylus
Se incluyen las actividades descritas en el CCAYAC-M-311 Método
Eloy Torres Infante 12-17 de prueba para la funcionalidad de los medios de cultivo para uso
CO
Rev: 7
Alicia Soto en el análisis microbiológico de productos farmacéuticos.
2015-12-11
Reséndiz Se eliminan de este catálogo los siguientes medios:
Caldo antígeno flagelar, Medio de esporulación Duncan- Strong
DE
modificado para Clostridium perfringens, Medio de fermentación

Todo el
Spray para Clostridium perfringens, Agar inducción de fase, Agar
documento
Lactobacilli AOAC, Caldo Lactobacilli AOAC, Agar Lactobacilli
O
MRS, MEDIO 24 LEB completo, agar Mac Clung Toabe y Medio

NT
MP.
Todo el
Se actualizó el logotipo institucional
documento
ME
Eloy Torres Infante Se adiciona la tabla de preparación del medio Caldo Lauril Triptosa,
Rev: 0 94
Alicia Soto de acuerdo al volumen de muestra a utilizar.
2018-11-15
CU
Reséndiz Se adiciona la formulación y preparación de los medios Agar Urea

177 - 183 base (de Christensen), Caldo MacConkey, Agar Columbia, Agar
Swarm, Agar BCYE, Agar BCYE modificado y Agar GVPC.
DO
Se incluye el término “Departamento” de Análisis y Pruebas

Microbiológicas conforme al Manual de Organización especifico de
la CCAYAC
Se re estructura el documento completo para indicar la preparación
Todo el de los medios de cultivo mediante las fichas técnicas de
documento preparación las cuales se pueden consultar en el listado de medios
Eloy Torres Infante de cultivo, con ello se eliminan los anexos de preparación de
Rev: 1 Ana Karen medios contenidas en la versión anterior.
2019-07-10 Alquicira Jiménez Se incluye la forma de solicitar los medios de cultivo y/o reactivos,
su preparación, control de calidad y la entrega a los usuarios.
Se re estructuran las políticas generales precisando la caducidad
16-17 de medios y/o reactivos que no cuenten con una fecha declarada
por el fabricante
Se modifica la bibliografía para actualizar las referencias de la
18
FEUM, y se incluyen las BPL de la OMS

CLAVE:
CCAYAC-CT-03/6
SUSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/5
2023-01-11 2029-01-11
FECHA: 2022-07-19
CCAYAC-CT-03
Revisión y fecha Persona que Hoja donde
Cambios Relevantes de versión vigente
del documento elabora los se realiza el
con respecto a la anterior
anterior cambios cambio
Se incluye el Anexo 1 con la información de la promoción de
TA
crecimiento de los medios de cultivo para análisis de productos
farmacéuticos donde se describe como realizar la prueba en los
UL
19-28 medios utilizados en las metodologías de esterilidad, limites
microbianos y potencia de antibióticos, así también ésta sustituye a
NS
lo descrito en el CCAYAC-M-286, ya que se trata de la misma
información.
Se incluye el Anexo 2 para indicar la forma en la que se elaboran
CO
29 y/o modifican las fichas técnicas de preparación de medios de
cultivo, soluciones y reactivos.
Rev: 2 Se incluye en el listado la preparación de la solución: Sauton
Eloy Torres Infante 7
DE
2021-06-30 diluido
Se actualiza el método por actualización de la Farmacopea de los
Rev: 3 Estados Unidos Mexicanos
O
Eloy Torres Infante 18

2021-09-06 Se cambia bibliografía:
NT
De FEUM 12ª edición, 2018 a FEUM 13.0, 2021

Todo el Se actualizan los hipervínculos de las fichas técnicas de
ME
documento preparación por cambio de equipo de computo

Rev: 4 Alejandro Galindo
2022-03-03 García Se incluye en el listado la preparación de la solución: Agar
5 modificado semi-solido Rappaport – Vassiliadis (MSRV) y Agar
CU
Listeria acorde a Ottaviani .

Se modifica la temperatura de incubación a 32.5 °C± 2.5 °C y 22.5
Rev: 5 Alejandro Galindo
DO
Anexo 1 °C± 2.5 °C de los medios de cultivo en la promoción de crecimiento

2022-07-19 García
para homologar con la prueba de límites microbianos.

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CLAVE:

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

favorecer un crecimiento excesivo.

Medios Selectivos: Contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de microorganismos

finalidad de aumentar la cantidad de ciertos microorganismos y al mismo tiempo suprimir el

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

cada unidad de presentación.

de solicitud de preparación medio.

A.3.1. Se debe llenar el formato CCAYAC-F-474 “Preparación y evaluación del desempeño de

 Medio de cultivo: anotar el nombre del medio solicitado.

nomenclatura: dd.mm.hh.ss, donde dd= día de preparación, mm=mes de preparación,

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

AG-1 Agar ASTEL

AG-3 Agar Baird Parker

AG-4 Agar BCYE

AG-6 Agar de hierro y lisina (LIA)

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

AG-25 Agar para antibióticos #4

AG-27 Agar para antibióticos #8

AG-28 Agar para antibióticos #9

AG-30 Agar para antibióticos #11

AG-32 Agar para antibióticos #32

AG-34 Agar para antibióticos #36

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

AG-53 Agar GVPC

AG-55 Agar Extracto de Malta

AG-56 Agar Verde Brillante

AG-58 Agar SIM

AG-60 Agar Listeria acorde a Ottaviani

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

CL-18 Caldo Dextrosa Sabouraud

CL-20 Caldo MacConkey

CL-25 Caldo MR-VP

CL-27 Caldo Lactosa Billis Verde Brillante

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

SOL-5 Solución Peptonada al 0.1%

SOL-7 Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

SOL-8 Solución amortiguadora al 1% pH 6.0±0.05

SOL-10 Solución amortiguadora 0.1M pH 4.5±0.05

SOL-12 Solución amortiguadora 0.2 M pH 10.5±0.1

SOL-14 Solución Reguladora de Fosfatos (0.25M) diluida

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

vinilo cuando así se indique en la etiqueta.

Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10 a 15 minutos para su completa humectación. Se

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

la cantidad perdida de volumen durante la esterilización.

recomiendan para un menor número de tubos.

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

Distribuir en condiciones asépticas volúmenes de medio fundido a temperatura de 45 a 50 ºC en cajas

B.8. CONSERVACIÓN Y USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

La mayoría de los medios deben conservarse en refrigeración de 2 a 8 ºC con su respectivo registro

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

C) CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO

C.1. EVALUACIÓN FÍSICA

una consistencia firme y de color característico.

CCAYAC-B-536 “REGISTRO DE VOLUMEN FINAL DE MEDIOS DE CULTIVO”

C.2. PRUEBA DE ESTERILIDAD

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"

D) EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

dilución se encuentra el inóculo deseado.

NOTA 1: Alternativamente se pueden usar métodos nefelométricos o espectrofotométricos para

D.2. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS

"Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión"