LA CENTRIFUGACIÓ

LA CENTRIFUGACIÓ
• Les centrifugues són un equip
estàndard en la majoria de
laboratoris biològics, químics, i
mèdics.
• Anem a veure el seu fonament,
els diferents tipus de
centrífugues i els diferents
mètodes de centrifugació.
 1.QUÈ ÉS LA CENTRIFUGACIÓ
• Mètode mecànic de separació de suspensions o emulsions gràcies a
l’acció de la força centrífuga.
• La centrifugació, el que fa és accelerar el procés de sedimentació que
es produiria de forma natural per la força de la gravetat.
• La força centrífuga és la que s’exerceix sobre un cos quan aquest
gira al voltant d’un eix. Esta força, té una magnitud que és
directament proporcional a la massa del cos, el radi de gir i la
velocitat de gir.
 1.QUÈ ÉS LA CENTRIFUGACIÓ
COEFICIENT DE SEDIMENTACIÓ.
• Cada partícula te un coeficient de sedimentació (ѕ), paràmetre que
s’obté de dividir la seua velocitat de sedimentació (ʋt)en (m/s) per
l’acceleració aplicada (a) en (m/s²). El resultat té unitats de temps i
s’expressa en Svedbergs(S).
• La resposta dels diferents components de la mescla a la centrifugació,
va a dependre de la seva velocitat de sedimentació, la qual cosa depèn
de la seua massa, encara que també es veu afectada per la seua forma i
grandària.
 1. QUÈ ÉS LA CENTRIFUGACIÓ
• La força exercida sobre les partícules, és la força centrífuga
relativa (FCR) o força g: una FCR de 400g indica que la força
centrífuga és 400 vegades major que la gravetat.
• La fórmula que relaciona la FCR amb la velocitat angular i el
radi de gir és:
FCR= k . (rpm)². r = Xg

• K: 1,12 . 10⁻⁵
• r: radi en cm entre l’eix de la centrifugadora i el centre del
tub
• Xg: nº de vegades la força de la gravetat
 1. QUÈ ÉS LA CENTRIFUGACIÓ
• La fórmula permet calcular la
velocitat de rotació en diferents
tipus de centrífuga, coneixent el radi
de gir i la FCR, podem calcular les
rpm.
• Existeixen Normogrames que
relacionen aquests 3 paràmetres
unint-los amb una línia.
 1. QUÈ ÉS LA CENTRIFUGACIÓ
• EXEMPLE: Calcula el nombre de g assolit per un rotor de centrífuga de 5cm
de radi, que gira a una velocitat de 10000rpm.
FCR= k . (rpm)². r = 1,12 x 10⁻⁵ x (10000)² x 5 = 10000² x 5 / 89365 = 5595g

PODEU COMPROVAR-HO AMB EL NORMOGRAMA, QUIN VALOR VOS DONA?

 2.LA CENTRIFUGADORA
• Consten d’un rotor, que gira al voltant
d’un eix central.
• El rotor conté unes fundes o beines, on
es col·loquen els tubs.
• El rotor pot girar a diferents velocitats o
rpm (revolucions per minut).
• Gràcies a la força centrífuga, les
partícules s’allunyen del eix de rotació de
forma radial.
 2.LA CENTRIFUGADORA
oExisteixen diferents tipus de centrifugadores però en totes elles els
comandaments ens permeten programar:
• El temps de centrifugació. IMP: quan es col·loquen els tubs, cal
equilibrar el pes del rotor: posarem
• Les rpm (velocitat de gir).
els tubs en baines oposades
diametralment. D’aquesta forma
s’eviten vibracions i que es trenquin
els tubs.
oEn una centrifugació estàndard obtenim:
• Precipitat o pellet: component de major densitat que sedimenta.
• Sobrenedant: component de menor densitat que queda sobre el precipitat
 2.1.PARTS DE LA CENTRIFUGADORA
• TAPA: evita l’accés a les mostres quan es realitza la centrifugació.
Són automàtiques (no s’obrin si està en funcionament).
• ROTOR: pesa que gira impulsada pel motor i sobre la qual es
col·loca la mostra. Han de ser materials lleugers i resistents a altes
velocitats de gir. Els millors són de titani i fibra de carboni.
• BASE: fabricada en material pesat, de manera que dona estabilitat.
Normalment en ella es troben els controls
• TACÓMETRE: pantalla que ens mostra les rpm i el temps restant.
• CONTROLS: per a seleccionar rpm i el temps de centrifugació.
• ON/OFF
 A

D D
 2.3.TIPUS DE CEINTRIFUGADORES
• Hi ha diferents varietats de centrífugues en funció de la mostra que es
vol separar i les diferents velocitats de rotació. Podem classificar les
centrífugues atenent a diversos criteris:
• Segons la velocitat de centrifugació.
• Segons del tipus de rotor.
• Segons la seva funció.
 2.1.1.SEGONS LA V DE CENTRIFUGACIÓ
CENTRIFUGADORA DE BAIXA VELOCITAT(o sobretaula)
• De petita grandària
• Aconsegueixen velocitats màximes de 4000-15000rpm.
• No solen tenir sistema de refrigeració.
 2.1.TIPUS DE CEINTRIFUGADORES
CENTRIFUGADORA D’ALTA VELOCITAT
• Aconsegueixen velocitats màximes de 18000-
25000rpm.
• Estan refrigerades.
• Algunes compten amb un sistema de buit per a
mostres molt sensibles que s’alteren en contacte
amb l’O2.
• Són útils per a separar suspensions de partícules
molt petites, com fraccions cel·lulars en Biologia
Molecular, però insuficients per a la separació de
ribosomes, virus o macromolècules en general.
 2.1.TIPUS DE CEINTRIFUGADORES
ULTRACENTRIFUGADORES
• Aconsegueixen velocitats a partir de
50000rpm.
• Totes porten sistema de refrigeració i
de buit.
• S’utilitzen a laboratoris molt
especialitzats, donat que permeten
separar estructures subcel·lulars
(lisozomes, ribososmes,
mitocòndries,...)
 Ultracentrifugadora
Centrifugadora
de alta velocitat

Centrifugadora
de baixa velocitat
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
D’ANGLE FIX
• El rotor és un bloc on es col·loquen els tubs i
té una certa inclinació respecte a l’eix de gir.
• El rotor angular s'utilitza quan es requereix
un nombre elevat de revolucions (de fins
60.000rpm)
• La separació es produeix amb un doble
component, cap al fons i cap al lateral del
tub.
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
D’ANGLE FIX. USOS:
• S’utilitzen per a grans volums (sobre tot en separacions seqüencials a velocitats
de rotació creixents).
• Separacions més simples (cèl·lules, membranes, proteïnes més o menys
agregades).
• Per a solucions de partícules d'alta densitat (gràcies al seu angle d'inclinació es
redueix el trajecte total han de recórrer les partícules, el que desencadena una
sedimentació més ràpida i efectiva).
• En separacions seqüencials a velocitats de rotació creixents.
D’ANGLE FIX
2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
D’ANGLE FIX
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
FLOTANT O BASCULANT
• L’adaptador del tub està unit al braç del rotor per la seva part
superior, però no està fix a ell.
• Quan el rotor comença a girar, col·loca els tubs a 90º respecte a l’eix.
• S’utilitzen a forces centrífugues xicotetes (aprox 6000rpm).
• Ofereixen un major rendiment ja que és possible omplir el tub
d'assaig de la centrífuga completament.
• Els components més pesats es queden al fons del tub.
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
FLOTANT O BASCULANT. USOS
• La sedimentació es duu a terme en el centre de la
part inferior del tub d'assaig, la qual cosa permet
una fàcil separació de les fases.
• Podem usar aquest tipus de rotors quan l'anàlisi
o estudi es centra bàsicament en la separació de
partícules per gradient de densitat.
• Existeixen diversos dissenys de rotors flotants i
portatubs.
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
VERTICAL
• El rotor és un cilindre on es col·loquen els tubs
en vertical.
• S’utilitzen per a volums grans i centrifugacions
ràpides.
• La separació, es produeix de forma lateral, el
component més pesat queda al lateral més
allunyat del eix del rotor.
 2.1.2.SEGONS EL TIPUS DE ROTOR
VERTICAL
• Separacions isopícniques: específicament per
al bandeig d'ADN en clorur de cesi
• Separacions en capes segons un gradient de
densitat, com per a partícules virals.
Encara que s’utilitzen menys per al dificultat de
recollir les capes, donat que la sedimentació
queda lateral al tub
 2.1.3.SEGONS LA SEUA FUNCIÓ
MICROCENTRIFUGADORES
• Centrifugadores menudes, per a volums petits, tubs tipus Eppendorf.
S’utilitzen a Biologia Molecular.
CENTRÍFUGADORES DE MICROHEMATÒCRIT
• Per a centrifugar capil·lars sanguinis a alta velocitat.
CITOCENTRIFUGADORES
• S’utilitzen als laboratoris d’anatomia patològica per a accelerar la
sedimentació de cèl·lules sobre un portaobjectes. Gràcies a la
centrifugació i posterior filtració, s’obtenen mostres molt concentrades
del líquid en estudi (LCR, líquid pleural, peritoneal,...).
https://youtu.be/CrerzgX_K2U
https://youtu.be/hcUrekkhNYo
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
Segons l’objectiu final de la centrifugació, podem diferenciar en:
centrifugació analítica o centrifugació preparativa.
➢CENTRÍFUGACIÓ ANALÍTICA
• Per a mesurar propietats físiques de les partícules que sedimenten, com el
coeficient de sedimentació o la seva massa molecular (especialment la
variant ultracentrifugació analítica).
• Les molècules s’observen mitjançant un sistema òptic durant la
centrifugació. Els tubs de centrifuga han de ser de quars per deixar passar
la llum visible i ultraviolada.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
➢CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA
• La que s’utilitza al laboratori clínic.
• Permet separar els components d’una mostra
per a un anàlisi posterior.
• Existeixen 3 tipus de centrifugació preparativa:
A. Preparativa estàndard.
B. Preparativa diferencial.
C. Preparativa per gradient de densitat.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
A. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA ESTÀNDARD
• La tècnica més comuna, sobretot per a la sedimentació de cèl·lules
en orina i sang:
• Obtenció de sèrum o plasma: centrifugació a 3500rpm durant 5
min i recollir el sobrenadant.
• Obtenció de sediment urinari: centrifugar a 1500rpm durant 10
min, rebutjar el sobrenadant i homogeneïtzar el precipitat per
estudiar el sediment.
• La separació es produeix en funció de la grandària de la partícula i
el seu coeficient de sedimentació.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
B. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA DIFERENCIAL
• Per a separar orgànuls cel·lulars:
1. Centrifugar la mostra a V baixa i recollir el sobrenadant.
2. Centrifugar el sobrenadant obtingut a V mitjana i recollir de
nou el sobrenadant.
3. Centriifugar aquest nou sobrenadant a V alta.
• Obtenim un sobrenadant i tres precipitats amb diferents
densitats i per tant substàncies diferents.
B. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA DIFERENCIAL
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
• Permet la separació de diversos components de la mostra o de tots ells i la
realització de mesures analítiques.
• Es necessita un suport fluid amb gradient de densitat. Al suport, la
concentració augmenta des de la zona superior cap a la inferior ( a més
concentració, major densitat)
• La mostra es diposita en la zona superior i es procedeix a centrifugar.
• La separació dels components es presenta com a diferents bandes o zones que
es poden separar amb una pipeta Pasteur. També es poden recollir les
fraccions per puncions en el fons.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
• Per a preparat el suport fluid, s’utilitzen sacarosa, polisacàrids sintètics
com Ficoll o Percoll i sals de metalls alcalins pesats com el clorur de
cesi.
• El gradient pot ser de dos tipus:
• Preformat: es prepara abans de centrifugar.
• Autoformat: el gradient es crea mitjaçant centrifugació
• Existeixen dues variants de centrifugació en gradient de densitat:
• Centrifugació zonal
• Centrifugació isopícnica
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
GRADIENT PREFORMAT

• Discontinu o escalonat: es dipositen capes successives a

concentracions decreixents, per exemple sacarosa al 25%, 20%, 15%,
10% i 5%.
• Continu: es preparen dues solucions, una al 5% i una altra al 30% i es
col·loquen a un dispositius formador de gradients, s’obté un fluid
amb un gradient continu de més a menys.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA
EN GRADIENT DE DENSITATS
GRADIENT AUTOFORMAT

• Es prepara la dissolució i al
mateix temps que es separen
els components de la mostra
es va formant el gradient
continu.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ZONAL
• S’utilitza un gradient preformat que pot ser continu o discontinu, la
densitat màxima del qual és menor que la del component de major
densitat de la mostra.
• S’utilitzen rotors basculants.
• La mostra es deposita a la part superior i es centrifuga.
• S’obtenen bandes de sedimentació de les partícules en funció del seu
coeficient de sedimentació (massa).
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ZONAL
• Es important tindre en compte que la centrifugació s’ha de parar
abans d’assolir l’equilibri, o les partícules mñes denses podrien
arribar al fons del tub i barrejar-se en diverses bandes.
• Els components es recullen amb perforant el fons del tub i recollint
les fraccions.
• S’utilitza per a la separació de macromolècules i orgànuls.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ZONAL
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ISOPÍCNICA
• Isopícnica significa d’igual densitat.
• S’utilitza un gradient continu la densitat màxima del qual és
major que la del component de major densitat de la mostra.
• En aquest cas, les partícules mai sedimenten al fons, sinó que
es queden en una posició estable en el gradient i es
concentren en bandes molt estretes on la densitat és igual
que la seua.
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ISOPÍCNICA
• S’utilitzen rotors basculants.
• Esta tècnica s’utilitza, per exemple, per separar partícules
semblants en grandària però de diferent densitat. En aquest
sentit, la centrifugació isopícnica és un mètode adequat per
separar àcids nucleics o diferents orgànuls cel·lulars
• El temps d’aquesta centrifugació és molt llarg(fins 1 o 2 dies).
 3.TIPUS DE CENTRIFUGACIÓ
C. CENTRÍFUGACIÓ PREPARATIVA EN GRADIENT DE DENSITATS
CENTRIFUGACIÓ ISOPÍCNICA
 3.APLICACIONS DE CENTRIFUGACIÓ
• OBTENCIÓ DE LEUCÒCITS:
s’aplica centrifugació per
gradient de densitat zonal on
s’utilitzen suports comercials
de Ficoll.
 3.APLICACIONS DE CENTRIFUGACIÓ
• FRACCIONAMENT
SUBCEL·LULAR: a partir
d’un homogeneïtzat
tissular s’obtenen per
centrifugació diferencial
els diferents components
cel·lulars (cèl·lules,
orgànuls, macromolècules
i altres soluts)
 3.APLICACIONS DE CENTRIFUGACIÓ
• OBTENCIÓ DE SÈRUM O PLASMA: aplicant FCR
de 3500g 10 min. S’utilitzen tubs amb gel de
silicona en el fons, que te una densitat
intermèdia entre el sèrum i el coàgul, el gel
facilita la conservació de les biomolècules
presents en el sobrenedant.
• CONCENTRACIÓ DE CÈL·LULES: en líquids
corporals, com l’orina o LCR.
• EXTRACCIÓ DE BIOMOLÈCULES: separació en
fases per a la posterior extracció mitjançant
dissolvents orgànics.
 4.PROCEDIMENT
1. Col·locar el tub de mostra (suspensió o dissolució) en un dels
receptacles del rotor.
2. Compensar el tub de mostra col·locant en el receptacle diametralment
oposat altre tub amb un volum de líquid de pes idèntic al de la mostra.
3. Tancar hermèticament el compartiment del rotor i posar en
funcionament la centrífuga. Un cop acabada la centrifugació
(normalment les centrífugues tenen un temporitzador que desconnecta
automàticament el motor un cop ha passat el temps programat), esperar
a que s’aturi el rotor per obrir la tapa del compartiment on està allotjat i
treure el tub de mostra i el de compensació.
 5. ASPECTES PRÀCTICS
• La centrífuga ha d’estar sobre una base sòlida i fixa.
• El rotor ha de ser compatible amb la centrífuga que es va a utilitzar i ha d’estar
perfectament fixat al motor.
• La distribució dels tubs en el rotor ha de ser tal que aquest estigui
perfectament equilibrat(compensat) per evitar vibracions durant el gir i per
tant, el seu trencament. Si es necessari, s’utilitzaran tubs addicionals amb
volums de líquid de pesos idèntics als de les mostres.
• Els tubs han de ser compatibles amb la centrífuga per evitar trencament
durant el funcionament de la mateixa.
• La tapa que aïlla el rotor de l’exterior ha d’estar ben tancada i assegurada.
• Mai s’ha de deixar la centrífuga sense atenció fins que arribi a la velocitat
màxima de gir.
FI