BalanzaListado de equipos, materiales y recursos:

Materiales

Balanza analítica con precisión de 0,0001 g

Plancha de calentamiento con agitación
Botellas de vidrio con tapa de 100 mL, estériles
Micropipeta de 100 a 1000 μL
Tubos bacteriológicos con tapa
Baño maría
Centrífugas para tubos de 15 mL y para microtubos
Tubos de centrífuga de 15 mL
Microtubos de 2,0 mL
Cronómetro
Medidor de pH
Espectrofotómetro VIS y celda de metacrilato
Probeta de 10 mL

Reactivos

Solución de bicarbonato de sodio 0,1 M

Soluciones tampón de pH 4, 7 y 10
Saccharomyces cerevisiae (levadura de cerveza en polvo ej. Levapan)
Solución de ácido 3,5 dinitrosalicílico, DNS (DNS, NaOH 2 M y tartrato de sodio y
potasio)
Solución acetato de sodio 0,04 M de pH 4,8 (Tampón de actividad)
Sacarosa: solución de 20 mg/mL en tampón de actividad
Agua destilada
Solución de EDTA 40 mM en tampón de actividad
Solución de D-glucosa 40 mM en tampón de actividad
Solución de CuSO4 (4 mM) en tampón de actividad
Solución de MgSO4 (4 mM) en tampón de actividad
Solución de FeCl3 o FeSO4 (8 mM) en tampón de actividad
Solución de CaCl2 (4 mM) en tampón de actividad
Solución de NaCl (4 mM) en tampón de actividad
Solución de ZnSO4 (4 mM) en tampón de actividad

Preparación de soluciones

Bicarbonato de sodio: 0,1 M (100 mL): Calcule la cantidad de reactivo a pesar

para preparar el volumen requerido y disuelva en agua destilada.

Tampón acetato de sodio: 0.04 M (tampón de actividad, 250 mL): Determine la

cantidad de acetato de sodio a pesar para preparar 50 mL de solución, así́ como el
volumen de acido acético glacial necesario para obtener 50 mL de solución 0,04 M y
mezcle de forma que el pH final de la solución sea de 4,8. SUGERENCIA:
inicialmente mezcle volúmenes iguales de las dos soluciones, por ejemplo 30 mL de
cada una.
Solución de sacarosa: de 10 mg/mL (25 mL): Establezca la cantidad de sacarosa a
pesar para preparar la solución y disuélvala en 25 mL de “tampón de actividad”.

Solución de acido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) (50 mL): En un vaso de vidrio de

250 mL limpio pesar 0,5 g de DNS. Disolver el reactivo con agitación en 20 mL de
agua destilada. Añadir 10 mL de NaOH 2 M; una vez que se haya disuelto el DNS
(la solución cambiará de color amarillo a naranja). Pesar 15 g de tartrato de sodio y
potasio y agregar lentamente a la solución anterior. Si pierde solubilidad calentar
ligeramente (40-50 °C) y añadir un poco de agua cuidando de no sobrepasar el
volumen final de la solución (50 mL). Aforar a 50 mL con agua destilada.

NOTA: Mantenga el reactivo protegido del dióxido de carbono en un frasco

opaco bien cerrado.

Preparación de la membrana de diálisis: Cortar un cuadrado de celofán de 30 cm

de lado. Sumergirlo en agua hirviente por 5 min. Retirar la membrana del baño de
agua. Cambiar el agua y repetir el proceso dos veces más. Realizar este tratamiento
justo antes de utilizar la membrana para la diálisis de la invertasa precipitada con
sulfato de amonio.
Actividades por desarrollar:

Extracción de la invertasa (Ayudante de laboratorio)

Disuelva con agitación moderada, 14 g (2 sobres) de levadura en polvo en 100 mL

de solución de bicarbonato de sodio en un frasco de 100 mL con tapa. Mantenga la
agitación por 1 hora e incube en un baño termostatizado a 35 °C por 15 h.

A continuación, destape el frasco con cuidado, elimine los gases formados, refrigere
la suspensión de levadura en un baño con hielo y viértala en cuatro tubos de
centrifuga de 15 mL. Centrifugue por 30 min a 5000 rpm.

Recupere el sobrenadante, divídalo en microtubos de 2 mL colocando 1,8 mL en

cada tubo y vuelva a centrifugar a máxima velocidad (aprox. 14000 rpm) por 30 min.

Recupere el sobrenadante, mezcle el contenido de todos los tubos en tubos de 50

mL, determine el volumen obtenido (V) y almacene la solución a 4 °C.

Tome una muestra para determinar el contenido de proteínas por

espectrofotometría. Esta actividad la realizará el grupo 2.

Ensayo de actividad enzimática:

Añada 50 μL de muestra (enzima) + 50 μL de sol. de sacarosa, incubar por 1 min a

30 °C. Agregue 100 μL de reactivo DNS, incube a 100 °C por 5 min y enfríe la
reacción en hielo por 10 min. Agregue 800 μL de agua destilada y mida la
absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.
Grupo 1

Precipitación de invertasa con sulfato de amonio

Coloque 10 mL de extracto de invertasa (obtenido durante la actividad anterior) en

un tubo de centrífuga de 15 mL. Calcule la cantidad de sulfatos de amonio sólido
que debe añadir al extracto para alcanzar una saturación del 60% (Una solución
saturada de sulfato de amonio tiene una concentración de 4.1 M a 25 °C). Agregue
poco a poco el sulfato de amonio y agite gentilmente la muestra hasta la total
disolución de la sal. Luego, agregue el sulfato de amonio restante y continúe
agitando suavemente. Para agitar puede emplear una varilla de vidrio o una
espátula pequeña. Una vez disuelto el sulfato de amonio, coloque la muestra sobre
hielo por 5 min y centrifugue a 10000 g por 20 min. Separe el sobrenadante en un
nuevo tubo y redisuelva el precipitado con 2 mL de solución tampón de actividad
(0.04 M acetato de sodio). Para resuspender el precipitado, emplee una varilla de
vidrio y realice gentilmente movimientos circulares hasta conseguir la total disolución
de la proteína.

Mida la actividad enzimática (producción de azúcares reductores) de las siguientes

muestras de la misma forma como lo realizó en el paso anterior (50 μL de muestra +
50 μL de sol. de sacarosa, incubar por 1 min a 30 °C).

M1 – Precipitado obtenido con 60% de saturación con sulfato de amonio

(resuspendido en 2 mL de tampón 0.04 M acetato de sodio).
M2 – Sobrenadante obtenido con 60% de saturación con sulfato de amonio.

Agregue 100 μL de reactivo DNS, incube a 100 °C por 5 min y enfríe la reacción en
hielo por 10 min. Agregue 800 μL de agua destilada y mida la absorbancia en
espectrofotómetro a 540 nm.

Tome una muestra de M1 y M2 para determinación de la concentración de proteína.

Entregue las muestras al ayudante de laboratorio o al docente.

Desalinizado de la enzima (desalting).

En el paso anterior se consiguió realizar una purificación parcial de la invertasa

mediante la aplicación de sulfato de amonio. Las sales, como el sulfato de amonio
se adhieren no covalentemente a las enzimas y las precipitan. Si bien este proceso
no afecta la integridad de la enzima, por lo general es necesario remover el exceso
de sales ya que estas podrían interferir con diferentes ensayos a los que se desee
someter la enzima. Para ello se debe realizar un procedimiento de desalinizado
(desalting) el cual se puede conseguir mediante cromatografía de exclusión por
tamaño (filtración en gel) o mediante diálisis a través del uso de membranas
permeables a moléculas pequeñas (piel de serpiente).

Tome la muestra que dio la mayor actividad enzimática para la invertasa y dialícela
frente a tampón de actividad (100 mL) con la ayuda de la membrana de diálisis
previamente preparada. Realice 1 cambio de solución tampón luego de varias horas
(el ayudante de laboratorio le ayudará con esta actividad). La enzima dializada se
empleará en todos los experimentos siguientes (a menos que se requiera lo
contrato) y se denominará únicamente como enzima.

Tome una muestra de la enzima dializada y disuélvala 20 veces en tampón de

actividad. Determine la actividad enzimática después de 1, 2, 3, 4 y 5 min de
incubación. Para este ensayo, marque 5 tubos del 1 al 5 y coloque 50 μL disuelta en
cada uno. Luego, agregue 50 μL de sustrato empezando por el tubo 5. Añada el
sustrato en los siguientes tubos con intervalos de 30 s. No olvide cronometrar el
tiempo de reacción. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de reactivo
DNS, incube a 100 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue
800 μL de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Tome una muestra para la determinación de proteína presente en la enzima

dializada y entréguela al ayudante de laboratorio o al docente.

Con los datos obtenidos durante la práctica construya la siguiente tabla:

Muestra Actividad Actividad A280**

enzimática (Vo) enzimática
relativa*
Extracto de invertasa
Precipitado - 60%
saturación (NH4)SO3
Sobrenadante 60%
saturación (NH4)SO3
Enzima dializada

* La actividad enzimática relativa se determina mediante la razón entre la actividad

de una muestra y la actividad determinada en el extracto de invertasa (ej. V o
precipitado 60% saturación (NH4)SO3/ Vo extracto de invertasa)

** La absorbancia a 280 nm de cada muestra la realizará el grupo 2.

Grupo 2

Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato.

Construya una curva de saturación de la enzima invertasa al emplear sacarosa

como sustrato. Para ello, prepare las reacciones de acuerdo con la tabla que se
muestra a continuación:

[Sacarosa] Volumen de enzima Volumen de Volumen de

(mg/mL) (μL) sacarosa 20 mg/mL tampón de
(μL) actividad (μL)
0 0
0.6 3
1.2 6
2.5 12.5
5 25
10 50

De ser necesario, el ayudante de laboratorio o el docente le indicarán la cantidad de

enzima a añadir en cada ensayo. Determine el volumen de tampón de actividad
necesario para alcanzar un volumen total de reacción de 100 μL.

Añada las soluciones al microtubo de ensayo en el siguiente orden:

1. Tampón de actividad
2. Sustrato
3. Enzima dializada (dilución 1:20)

Inmediatamente después de colocar la enzima, mezcle el contenido del tubo con la

ayuda de una micropipeta (pipetee gentilmente la solución hacia arriba y hacia
debajo de 4 a 5 veces sin formar burbujas). Incube la reacción por un periodo de 2
min a 30 °C. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de solución DNS.
Incube a 100 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue 800 μL
de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Con los datos obtenidos determine: [E] en el ensayo, Km, Vmax, kcat, constante de
especificidad, U y SA.

La unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la

hidrolisis de 1 μmol de sustrato a pH 4,8 y 30 °C.

Determinación del contenido de proteínas

Para la determinación del contenido de proteínas se asumirá que la invertasa es la

principal proteína en cada muestra. Con esta asunción, la concentración de proteína
será determinada por espectrofotometría a 280 nm. Para ello se empleará Nanodrop
y la secuencia de aminoácidos de la enzima invertasa de Saccharomyces
cerevisiae. Determine el coeficiente de extinción de la invertasa y su concentración
en cada una de las muestras mediante la ley de Beer-Lambert.
>Invertasa_ Saccharomyces cerevisiae
MTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYFQYNPNDTVWGTPLF
WGHATSDDLTNWEDQPIAIAPKRNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDTIDPRQRCV
AIWTYNTPESEEQYISYSLDGGYTFTEYQKNPVLAANSTQFRDPKVFWYEPSQKWI
MTAAKSQDYKIEIYSSDDLKSWKLESAFANEGFLGYQYECPGLIEVPTEQDPSKSY
WVMFISINPGAPAGGSFNQYFVGSFNGTHFEAFDNQSRVVDFGKDYYALQTFFNT
DPTYGSALGIAWASNWEYSAFVPTNPWRSSMSLVRKFSLNTEYQANPETELINLKA
EPILNISNAGPWSRFATNTTLTKANSYNVDLSNSTGTLEFELVYAVNTTQTISKSVFA
DLSLWFKGLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFTNRMSVNNQP
FKSENDLSYYKVYGLLDQNILELYFNDGDVVSTNTYFMTTGNALGSVNMTTGVDNL
FYIDKFQVREVK
Grupo 3

Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato y EDTA

como inhibidor.

Construya una curva de saturación de la enzima invertasa al emplear sacarosa

como sustrato en presencia de 40 mM EDTA. Para ello, prepare las reacciones de
acuerdo con la tabla que se muestra a continuación:

[Sacarosa] Volumen Volumen de Volumen Volumen Abs

(mg/mL) de enzima sacarosa 20 EDTA 40 tampón
(μL) (1:10) mg/mL (μL) mM (μL) de
actividad
(μL)
0
0.625
1.25
50 25
2.5 10
5
10
20

De ser necesario, el ayudante de laboratorio o el docente le indicarán la cantidad de

enzima a añadir en cada ensayo. Determine el volumen de tampón de actividad
necesario para alcanzar un volumen total de reacción de 100 μL.

Añada las soluciones al microtubo de ensayo en el siguiente orden:

1. Tampón de actividad
2. Sustrato
3. EDTA
4. Enzima dializada (dilución 1:10)

Inmediatamente después de colocar la enzima, mezcle el contenido del tubo con la

ayuda de una micropipeta (pipetee gentilmente la solución hacia arriba y hacia
debajo de 4 a 5 veces sin formar burbujas). Incube la reacción por un periodo de 2
min a temperatura ambiente. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de
solución DNS. Incube a 85 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min.
Agregue 800 μL de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a
540 nm.

Con los datos obtenidos determine: [E] en el ensayo, Km, Vmax, kcat, constante de
especificidad, U y SA. Además, determine si el EDTA es un activador o inhibidor de
la enzima. En caso de ser inhibidor, determine el tipo de inhibición y el Ki del
inhibidor.

La unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la

hidrolisis de 1 μmol de sustrato a pH 4,8 y 30 °C.
Grupo 4

Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato y D-

glucosa como inhibidor.

Construya una curva de saturación de la enzima invertasa al emplear sacarosa

como sustrato en presencia de 2 mM D-glucosa como inhibidor. Para ello, prepare
las reacciones de acuerdo con la tabla que se muestra a continuación:

[Sacarosa] Volumen de Volumen de Volumen Volumen de Abs

(mg/mL) enzima sacarosa 20 D-glucosa tampón de
(μL) (1:10) mg/mL (μL) 2 mM (μL) actividad
(μL)
0
0.625
1.25 10 50 25
2.5
5
10
20

De ser necesario, el ayudante de laboratorio o el docente le indicarán la cantidad de

enzima a añadir en cada ensayo. Determine el volumen de tampón de actividad
necesario para alcanzar un volumen total de reacción de 100 μL.

Añada las soluciones al microtubo de ensayo en el siguiente orden:

1. Tampón de actividad
2. Sustrato
3. D-glucosa
4. Enzima dializada (dilución 1:10)

Inmediatamente después de colocar la enzima, mezcle el contenido del tubo con la

ayuda de una micropipeta (pipetee gentilmente la solución hacia arriba y hacia
debajo de 4 a 5 veces sin formar burbujas). Incube la reacción por un periodo de 2
min a temperatura ambiente. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de
solución DNS. Incube a 85 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min.
Agregue 800 μL de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a
540 nm.

Con los datos obtenidos determine: [E] en el ensayo, Km, Vmax, kcat, constante de
especificidad, U y SA. Además, determine el tipo de inhibición y el Ki del inhibidor.

La unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la

hidrolisis de 1 μmol de sustrato a pH 4,8 y 30 °C
Tabla reporte:
[Sacarosa] Absorbanci Absorbancia Absorbancia
(mg/mL) a de de reacción de reacción
reacción con D-Glucosa sin inhibidor
con EDTA
0
0.625
1.25
2.5
5
10
20
Grupo 5

Determinación de la actividad de invertasa a diferentes temperaturas.

Realizar la medición de la actividad de la enzima invertasa empleando sacarosa

como sustrato (en condiciones saturantes) de la misma manera como se realizó en
practicas anteriores.

Añada las soluciones al microtubo de ensayo en el siguiente orden:

1. 50 μL de sustrato (sacarosa 20 mg/mL)
2. 50 μL de enzima dializada (dilución 1:20)

Determinar la actividad enzimática en empleando diferentes temperaturas de

incubación para la reacción (10, 20, 30, 40 y 50 °C). Para la correcta medición de la
actividad enzimática, colocar el sustrato y el tampón de reacción en un tubo
adecuado para el ensayo e incubar la solución a la temperatura requerida por 5 min
(de esta manera la temperatura de la solución de reacción se equilibrará a la
temperatura deseada). Pasado este tiempo agregar la enzima a la reacción, mezclar
gentilmente con la ayuda de una micropipeta e incubar por 2 min a la temperatura
indicada.

Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de solución DNS. Incube a 100

°C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue 800 μL de agua
destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Para conseguir las temperaturas indicadas, hacer uso del refrigerador (10 °C),
incubación a temperatura ambiente (20 °C), y de baños termostatizados (30, 40, 50
°C).

Construir una grafica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C) incluyendo los datos de cada
experimento. Determinar la temperatura optima para la reacción catalizada por la
invertasa empleando sacarosa como sustrato y la velocidad relativa para cada
experimento con respecto a la velocidad máxima observada.

Vrelativa (%) = (Vo/Vmax)*100

Temperatura de Vo (mg glucosa/min) Vrelativa (%)

incubación (°C)
10
20
30
40
50
Grupo 6

Determinación de la estabilidad térmica de invertasa.

El presente experimento tiene como objetivo evaluar la tolerancia de la enzima

invertasa a diferentes temperaturas. Para ello, incubar 50 μL de enzima dializada
(dilución 1:20) a 10, 20, 30, 40 y 50 °C por 20 min. A continuación, añada 50 μL de
sustrato (sacarosa 20 mg/mL) e incube la reacción a 30 °C por 2 minutos. Detenga
la reacción mediante la adición de 100 μL de solución DNS. Incube a 100 °C por 5
min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue 800 μL de agua destilada y
mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Para conseguir las temperaturas indicadas, hacer uso del refrigerador (10 °C),
incubación a temperatura ambiente (20 °C), y de baños termostatizados (30, 40, 50
°C).

Construir una grafica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C) incluyendo los datos de cada
experimento. Determinar la temperatura máxima que tolera la enzima con respecto
a la velocidad máxima observada.
Grupo 7

Determinación de la actividad de invertasa a diferente pH

El presente experimento tiene como objetivo evaluar la actividad de la enzima

invertasa a diferente pH. Construya la reacción de la siguiente manera:

1. 47.5 μL de solución tampón (85 mM)

2. 50 μL de solución de sacarosa 20 mg/mL (en agua destilada)
3. 2.5 μL de enzima dializada

Para este ensayo se empleará el tampón acetato de sodio a pH 3.8, 4.8, 5.8, 6.8 y
7.8.

Una vez agregados todos los componentes en el tubo de ensayo, mezcle el

contenido del tubo con la ayuda de una micropipeta (pipetee gentilmente la solución
hacia arriba y hacia debajo de 4 a 5 veces sin formar burbujas). Incube la reacción a
30 °C por 2 minutos. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de solución
DNS. Incube a 100 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue
800 μL de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Construir una grafica Vo (mg glucosa/min) vs pH incluyendo los datos de cada

experimento. Determinar el pH óptimo de la enzima con respecto a la velocidad
máxima observada. Determine además la velocidad relativa para cada experimento
con respecto a la velocidad máxima observada.

Vrelativa (%) = (Vo/Vmax)*100

pH Vo (mg glucosa/min) Vrelativa (%)

3.8
4.8
5.8
6.8
7.8
Grupo 8

Determinación del efecto de diferentes iones metálicos sobre la actividad de

invertasa

Determinar el efecto de diferentes iones metálicos sobre la actividad de la enzima

invertasa empleando sacarosa como sustrato (en condiciones saturantes). Cada
medición se realizará de forma similar como se realizó en sesiones anteriores.

Los iones metálicos por ensayar son:

Ion metálico Concentración final Concentración stock

(en forma de sal) (mM) (mM)
CuSO4 1 4
MgSO4 1 4
FeCl3 o FeSO4 2 8
CaCl2 1 4
NaCl 1 4
ZnSO4 1 4

Cada reacción será elaborada en un microtubo mediante la adición de cada solución

en el siguiente orden:
1. 22.5 μL de tampón de actividad
2. 50 μL de sustrato (sacarosa 20 mg/mL)
3. 25 μL stock de ión metálico
4. 2.5 μL de enzima dializada

Elabore un control en el que reemplazará el stock de ión metálico por tampón de

actividad. Esta reacción le permitirá determinar la velocidad máxima en condiciones
normales (en ausencia de iones metálicos). Incube cada reacción a 30 °C por 2
minutos. Detenga la reacción mediante la adición de 100 μL de solución DNS.
Incube a 100 °C por 5 min y enfríe la reacción en hielo por 10 min. Agregue 800 μL
de agua destilada y mida la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.

Construir una grafica Vo (mg glucosa/min) vs ion metálico incluyendo los datos de
cada experimento. Determinar el efecto de cada ion sobre la actividad de la enzima
con respecto a la velocidad máxima observada.

Ion metálico Vo (mg glucosa/min) Vrelativa (%)

(en forma de sal)
Sin ion
CuSO4
MgSO4
FeCl3 o FeSO4
CaCl2
NaCl
ZnSO4