Guía Pruebas de Endotoxinas

Impreso el: jue. may. 11 2023, 07:13:39 a. m.
(EST) Estado: Oficial Vigente al 11-may-2023 DocId: GUID-CC17E1DF-5576-4A86-90EF-78ED081ECB76_3_es-ES

Impreso por: Alfonso Delgado Fecha Oficial: Oficial desde 01-dic-2020 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
No Distribuir DOI Ref: gep35 DOI: https://doi.org/10.31003/USPNF_M2245_03_02
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á1085ñ GUÍAS PARA LAS PRUEBAS DE ENDOTOXINAS

INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES: PIRÓGENOS Y ENDOTOXINAS
ENDOTOXINAS
REQUISITOS PREPARATORIOS
Estándar de Referencia de Endotoxina (RSE): Calibración de la Endotoxina Estándar de Control (CSE)
Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando el Método de Coagulación
Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando Pruebas de Punto Final y
Cinéticos Cuantitativos
Determinación de la Actividad para una Endotoxina Estándar de Control Líquida
Selección y Calificación de Insumos: Requisitos Farmacopeicos
Calificación de Analistas
Calibración y Calificación de Equipos e Instrumentación
Condiciones Ambientales de Laboratorio
APTITUD DEL MÉTODO
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Farmacéuticos y Productos Biológicos
Importancia de los Límites para Preparaciones Magistrales Estériles
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Sustancias Activas y Excipientes
l
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Combinados
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Dispositivos Médicos
Máxima Dilución Válida
Prueba de Aptitud del Método
ia
Calificación de Métodos de Preparación de Prueba Diferentes a la Dilución
ANÁLISIS DE RUTINA
Muestreo
fic
Combinación
Cálculo del Contenido de Endotoxinas
Resultados Fuera de Especificación y Consideraciones para Reanálisis
Control con Curva Estándar
MÉTODOS DE PRUEBA ALTERNATIVOS
GLOSARIO
O
REFERENCIAS
INTRODUCCIÓN
La primera versión del capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas á85ñ se publicó en USP 20–NF 15 (1980). Posteriormente,
este capítulo se armonizó con las Farmacopeas Japonesa y Europea y el primer capítulo armonizado fue publicado en USP 25–
NF 20 (2002). Desde su primera publicación, se ha modificado muy poco su contenido; sin embargo, con años de experiencia,
mayor conocimiento y formulaciones parenterales más complejas, las metodologías básicas descritas en ese capítulo pueden
verse beneficiadas con información de respaldo adicional. El objetivo de este capítulo de información es proporcionar
información general y guías adicionales para la realización y aplicación adecuada de pruebas de endotoxinas bacterianas del
compendio.
ANTECEDENTES: PIRÓGENOS Y ENDOTOXINAS
Los pirógenos, o agentes causantes de fiebre, son posibles contaminantes en productos parenterales. Muchas sustancias
pueden provocar fiebre durante la inyección, la infusión, la implantación o cuando entran en contacto con el torrente
circulatorio o líquido cefalorraquídeo de mamíferos. Si bien algunos productos biológicos, vacunas y terapias celulares y génicas
pueden, por su naturaleza, desencadenar respuestas pirogénicas en pacientes, los contaminantes pirogénicos predominantes y
más potentes en la fabricación de medicamentos y dispositivos médicos parenterales son las endotoxinas bacterianas, que son
componentes de las paredes celulares de bacterias Gram-negativas.
Las endotoxinas son componentes de la membrana celular externa de bacterias Gram-negativas. Si no puede haber
crecimiento de bacterias Gram-negativas, no se producirán endotoxinas. Sin embargo, las endotoxinas pueden permanecer
activas en los fragmentos de la pared celular después de que las células mueren, de modo que un material puede ser estéril,
pero aún contener niveles cuantificables de actividad de endotoxina. Si se encuentran endotoxinas bacterianas en productos
(incluidos productos biológicos) o dispositivos médicos parenterales, esto indica que hubo crecimiento de bacterias
Gram-negativas en algún punto durante la fabricación del producto. Las endotoxinas pueden ser introducidas en el flujo de
proceso por ingredientes farmacéuticos, incluidos agua, materias primas (en particular, de origen natural), ingredientes
farmacéuticos activos (IFA), excipientes de la formulación del producto farmacéutico, componentes del envase primario (en
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-CC17E1DF-5576-4A86-90EF-78ED081ECB76_3_es-ES 1/16
Impreso el: jue. may. 11 2023, 07:13:39 a. m.(EST) Estado: Oficial Vigente al 11-may-2023 DocId: GUID-CC17E1DF-5576-4A86-90EF-78ED081ECB76_3_es-ES
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contacto con el producto), equipo de fabricación que no se ha limpiado o almacenado adecuadamente y/o prácticas ineficaces
de control de contaminación microbiana.
ENDOTOXINAS
Los términos "endotoxinas bacterianas" y "endotoxinas" hacen referencia a un componente complejo de la membrana celular
externa de bacterias Gram-negativas. Aunque aún constituye un área de investigación activa, se cree que los contaminantes
naturales en productos farmacéuticos o dispositivos médicos parenterales estériles incluyen vesículas de membrana externa,
que son miniesferas de material de la membrana externa liberadas a partir de células que proliferan activamente como parte
del ciclo de crecimiento normal de la bacteria (1–6), así como fragmentos de la membrana externa que provienen de bacterias
Gram-negativas muertas o destruidas. El lipopolisacárido (LPS) biológicamente activo se une o asocia a otros componentes de
la membrana externa de bacterias Gram-negativas, que incluyen distintas proteínas, fosfolípidos y lipoproteínas (1,3,6). La
porción hidrofóbica o lípido A de la molécula de lipopolisacárido se encuentra inmersa en la membrana y la porción hidrofílica
del polisacárido queda expuesta al ambiente externo que rodea las células. De acuerdo con algunas investigaciones actuales,
no es seguro que el lipopolisacárido puro se libere como parte del ciclo de crecimiento normal de las bacterias Gram-negativas
(3).
El Estándar de Referencia de Endotoxina USP (RSE, por sus siglas en inglés) actual y las endotoxinas estándar de control (CSE,
por sus siglas en inglés) preparadas comercialmente se extraen de la membrana celular de bacterias Gram-negativas, en general
mediante el método de Westphal de fenol caliente, y se purifican para eliminar cualquier componente circundante de la
membrana celular (7,8). De manera adicional, estas preparaciones purificadas además son con frecuencia formuladas con
agentes estabilizantes (8). Como tales, los lipopolisacáridos que se preparan utilizando el método de Westphal u otro método
de extracción no puede contaminar los productos farmacéuticos porque no existen en esta forma en la naturaleza. Los
estándares de endotoxinas pueden “reaccionar de manera diferente a las endotoxinas de origen natural”, lo cual se atribuye a
l
diferencias en el origen y forma de preparación (9). Es posible que los estándares extraídos mediante el método de Westphal u
biofarmacéuticos o dispositivos médicos (10,11).

ia
otro método de desnaturalización, y posteriormente formulados, no siempre puedan ser sustitutos representativos para modelar
el comportamiento de endotoxinas naturales en algunos experimentos de extracción de productos farmacéuticos,
Aunque los métodos de prueba generales en los capítulos del compendio por debajo de á1000ñ se consideran validados,
todos los laboratorios, incluidos laboratorios contratados para análisis, deben demostrar que la metodología elegida para la
prueba de endotoxinas bacterianas (PEB) es adecuada para un producto o material específicos analizados de conformidad con
fic
el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas á85ñ, Técnica de Coagulación, Pruebas Preparatorias, Prueba para Factores de
Interferencia o Técnicas Fotométricas Cuantitativas, Pruebas Preparatorias, Prueba para Factores de Interferencia (también conocida
como prueba de inhibición o potenciación). Esta prueba de aptitud necesitará los siguientes prerrequisitos:
• Cálculo o asignación de una especificación o límite de endotoxinas para el material en análisis, y cálculo de la máxima
dilución válida (MDV). Ver más adelante las siguientes secciones: Aptitud del Método, Cálculo de los Límites de Endotoxinas
para Productos Farmacéuticos y Productos Biológicos, Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Dispositivos Médicos, Cálculo
de los Límites de Endotoxinas para Productos Combinados y Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Sustancias Activas y
O
Excipientes.
• Demostración de que el control positivo del producto se puede recuperar a una dilución del material que no exceda la
MDV. Ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas á85ñ, Técnica de Coagulación, Pruebas Preparatorias, Prueba para Factores de
Interferencia o Técnicas Fotométricas Cuantitativas, Pruebas Preparatorias, Prueba para Factores de Interferencia.
Después de que se ha demostrado la aptitud del ensayo, el laboratorio puede realizar análisis de rutina según los cálculos y
condiciones de preparación de la muestra que se describieron en el estudio de aptitud. Cualquier cambio en esas condiciones
(p. ej., origen del lisado y/o endotoxinas, componente(s) del producto, formulación o cambios en la fabricación) está sujeto al
control de cambios y puede ser necesario que el laboratorio repita el estudio de aptitud.
REQUISITOS PREPARATORIOS
Estándar de Referencia de Endotoxina (RSE): Calibración de la Endotoxina Estándar de Control

(CSE)
Es bien sabido que cuando se administran experimentalmente lipopolisacáridos purificados de diferentes géneros/especies/
cepas de bacterias Gram-negativas con peso o masa uniformes a conejos se pueden obtener reacciones pirogénicas
significativamente diferentes (12,13). Sin embargo, al relacionar estos efectos con la actividad administrada—es decir, su
capacidad para producir fiebre en conejos (Prueba de Pirógenos á151ñ) o iniciar una reacción de LAL ( á85ñ)—en lugar del peso o
masa, la variabilidad estructural de las moléculas de lipopolisacáridos puede ser normalizada a una unidad definida de actividad
denominada unidad de endotoxina (UE). Dos observaciones aplican en este caso:
• Una Unidad USP de Endotoxina es equivalente a una Unidad Internacional (UI), según se indica en el capítulo á85ñ.
• Los lisados empleados como reactivos actualmente descritos en el capítulo á85ñ están autorizados para su comercialización
en los Estados Unidos por la FDA y tienen asociada una sensibilidad; sin embargo, la FDA no autoriza la comercialización
de preparaciones de endotoxinas estándar de control.
El Estándar de Referencia de Endotoxina es el estándar primario de lipopolisacárido purificado que se formula a partir de una
preparación a granel común de LPS de E. coli 0113:H10:K que es compartida entre la Organización Mundial de la Salud (OMS),
la Farmacopea Europea (F. Eur.), la Farmacopea Japonesa (FJ) y la Farmacopea de los EE. UU. (USP). El Estándar de Referencia de
Endotoxina fue desarrollado inicialmente por la FDA en los años setenta para calibrar los lisados empleados como reactivos
provenientes de múltiples fabricantes, y sigue siendo el estándar primario para calibración del lisado, calibración de estándares
3
secundarios (p. ej., endotoxina estándar de control) y creación de parámetros de ensayo, tales como curvas estándar y controles
de las valoraciones de controles positivos del producto.
Aunque se dispone de Estándar de Referencia de Endotoxina para uso de rutina, la mayoría de las pruebas de endotoxinas
bacterianas se realizan utilizando una endotoxina estándar de control, que es un analito de calibración secundario que puede
venir incluido en los kits de prueba de LAL adquiridos de fabricantes de reactivos. Muchas endotoxinas estándar de control se
presentan como preparaciones liofilizadas de un lipopolisacárido purificado que fue llenado y envasado por peso, no por
actividad. El objetivo del estudio de estandarización es determinar la actividad específica, o potencia, de la endotoxina estándar
de control en UE/unidad de peso del material frente al estándar primario Estándar de Referencia de Endotoxina.
Todos los reactivos utilizados en las pruebas de endotoxinas bacterianas son biológicos por naturaleza y, por ello, pueden
mostrar alguna variabilidad en la sensibilidad y potencia, lo cual hace que la calibración frente al Estándar de Referencia de
Endotoxina sea una tarea importante. La calibración frente al Estándar de Referencia de Endotoxina es necesaria para cada
combinación única de lote de lisado y lote de endotoxina estándar de control. Si se adquiere un kit de un proveedor de reactivos,
el proveedor realizará la estandarización específica para un lote y proveerá un certificado de análisis (CoA, por sus siglas en
inglés) específico para ese lote en el kit, que deberá guardarse para referencia en el laboratorio. No obstante, pueden presentarse
casos en los que el laboratorio podría elegir adquirir endotoxinas estándar de control de un tercero o calibrar una preparación
líquida de endotoxinas, lo que requiere que el laboratorio realice su propio estudio de calibración.
Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando el Método

de Coagulación
La determinación de la potencia de la endotoxina estándar de control en la prueba de coagulación se logra mediante la
comparación de la media geométrica de los puntos finales de una serie de diluciones independientes del Estándar de Referencia
de Endotoxina y endotoxina estándar de control en Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas [ver el capítulo Prueba de
l
Endotoxinas Bacterianas á85ñ, Reactivos y Soluciones de Prueba, Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)] y se analizan
por cuadriplicado. El punto final se define como el último tubo en una serie de diluciones al medio de Estándar de Referencia
manera:
ia
de Endotoxina o endotoxina estándar de control que muestra una reacción positiva (gel). Para tener un punto final, el último
tubo positivo debe estar seguido en la serie por al menos una dilución negativa. La media geométrica se calcula de la siguiente
Σlog puntos finales

fic
10
Media geométrica = antilogaritmo
número de determinaciones repetidas
El Estándar de Referencia de Endotoxina se declara en unidades de actividad (UE/vial), y las unidades para la media geométrica
del punto final para el Estándar de Referencia de Endotoxina se expresan en UE/mL. Debido a que la endotoxina estándar de
control se llena por peso, las unidades para la media geométrica del punto final para esta endotoxina estándar de control se
expresan en ng/mL. La potencia de la CSE en UE/ng se calcula de la siguiente manera:
O
Media geométrica del punto final de la serie del RSE en UE/mL

Potencia de la CSE (UE/ng) =
Media geométrica del punto final de la serie de la CSE en ng/mL
Por ejemplo, para calibrar un nuevo lote de endotoxina estándar de control para uso con un lote de lisado de coagulación
con una sensibilidad declarada de 0,125 UE/mL, diluir el RSE en UE/mL hasta un valor que incluya la cantidad declarada del
lisado empleado como reactivo. Para este ejemplo, la media geométrica del RSE confirma la cantidad declarada de 0,125 UE/
mL. Diluir la endotoxina estándar de control en ng/mL de manera que se alcance un punto final. Para este ejemplo, el punto
final de la serie de endotoxina estándar de control es 0,00625 ng/mL. La potencia de la endotoxina estándar de control para
el lote de lisado particular se calcula de la siguiente manera:
Media geométrica del RSE 0,125 UE/mL
= = 20 UE/ng de CSE
Media geométrica de la CSE 0,00625 ng/mL
Para este lote de lisado, la potencia del nuevo lote de endotoxina estándar de control es 20 UE/ng. Si el laboratorio desea
utilizar este lote de endotoxina estándar de control con un lote de lisado diferente, el estudio de calibración debe repetirse
porque la determinación de la potencia hace referencia solo a una combinación específica de lote de lisado y lote de endotoxina
estándar de control.
Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando Pruebas

de Punto Final y Cinéticos Cuantitativos
La determinación de la potencia de la endotoxina estándar de control en una prueba cuantitativa se realiza de manera muy
similar a la prueba estándar de una sustancia desconocida. Los tiempos de iniciación/reacción de diluciones de la endotoxina
estándar de control diluida en ng/mL se interpolan a partir de una curva estándar del Estándar de Referencia de Endotoxina
para obtener la actividad de la dilución de la endotoxina estándar de control en UE/mL. Debido a que las concentraciones en
ng/mL de estas diluciones son conocidas, el cálculo de UE/ng es una simple función matemática. Para cualquier concentración
dada de endotoxina estándar de control, realizar el cálculo de la siguiente manera:
UE/ng = (UE/mL) ÷ (ng/mL)
4
Por ejemplo, para calibrar un nuevo lote de endotoxina estándar de control que se utilizará con una valoración cromogénica,
el primer paso es preparar una curva estándar utilizando Estándar de Referencia de Endotoxina en Agua para Prueba de
Endotoxinas Bacterianas. El intervalo de la curva estándar se deja a juicio del analista, pero opciones adecuadas serían el mismo
intervalo que se utiliza de manera rutinaria en el laboratorio o el intervalo máximo sugerido por el fabricante de reactivos.
Posteriormente, el analista diluye la endotoxina estándar de control hasta una concentración conocida en ng/mL y analiza las
diluciones como elementos desconocidos (ver Tabla 1). Puntos que deben considerarse:
1. Debido a los requisitos de linealidad para una curva estándar, los datos usados en el cálculo de la potencia no pueden
ser extrapolados más allá del intervalo de la curva, sino que deben encontrarse dentro del intervalo de la curva estándar
de referencia
2. Las curvas estándar no deben exceder los intervalos máximos sugeridos por el fabricante de reactivos
3. Para la calibración de endotoxinas estándar de control, se recomienda que las determinaciones repetidas para cualquier
dilución dada se consideren de manera individual (no promediada) cuando se calcule el coeficiente de correlación para
evaluar la variabilidad al calibrar la endotoxina estándar de control
Tabla 1. Ejemplo de Calibración de un Analito de CSE frente a RSE en una Valoración Cuantitativa
Ejemplo de
Concentración Resultado Resultado
(ng/mL) (UE/mL) (UE/ng)
1 15 15
0,5 6 12
0,25 3 12
l
0,125 1,8 14
ia — Promedio: 13,25
En este caso, la potencia del nuevo lote de endotoxina estándar de control con reactivo cromogénico cinético es la media
de cuatro determinaciones independientes. Ese cálculo es 13,25 UE/ng, que se redondea adecuadamente a 13 UE/ng. Si el
laboratorio desea utilizar este lote de endotoxina estándar de control con un lote de lisado diferente—ya sea cinético, punto
final o técnica de coagulación—, la calibración debe repetirse porque la determinación de la potencia hace referencia a una
fic
combinación específica de lote de lisado y lote de endotoxina estándar de control.
Determinación de la Actividad para una Endotoxina Estándar de Control Líquida

Una endotoxina estándar de control líquida, tal como una preparación de endotoxina natural, no tiene potencia a menos
que se conozca el peso real del material de origen (Indicadores de Endotoxinas para Despirogenización á1228.5ñ). Normalmente,
la endotoxina estándar de control líquida se describe en términos de concentración de actividad expresada en UE/mL. La
O
actividad de una endotoxina estándar de control líquida en UE/mL se determina mediante la media geométrica del punto final
para tubos duplicados analizados con la técnica de coagulación o tratando la solución como una sustancia desconocida frente a
una curva estándar del Estándar de Referencia de Endotoxina para valoraciones cuantitativas.
Selección y Calificación de Insumos: Requisitos Farmacopeicos

El capítulo oficial armonizado sobre Prueba de Endotoxinas Bacterianas requiere que el laboratorio evalúe los plásticos de
insumos con respecto a las interferencias de la prueba. Según el capítulo á85ñ, Aparato:
Si se emplean aparatos de plástico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los
que han demostrado estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA—En este capítulo, el
término “tubo” incluye cualquier otro receptáculo, como por ejemplo, pocillos de las placas de microtitulación.]
Los plásticos usados para realizar la prueba se moldean, es decir, los pellets plásticos han sido calentados hasta una
temperatura muy alta para producir plástico fundido en preparación para el proceso de moldeado. Esta temperatura alta
destruirá las endotoxinas bacterianas de modo que los plásticos moldeados quedan exentos de endotoxinas detectables cuando
se liberan de los moldes. Sin embargo, dependiendo de la manipulación posterior, es posible que haya recontaminación. Deben
establecerse medidas de control para garantizar condiciones de almacenamiento apropiadas y evitar el contacto con sustancias
potencialmente contaminantes. Sin embargo, a menos que los plásticos despirogenados se almacenen en condiciones
húmedas o se encuentren con sustancias durante la manipulación en las que pudieran proliferar bacterias Gram-negativas, la
probabilidad de recontaminación es remota.
Si un laboratorio acepta el certificado de análisis de un proveedor para el contenido de endotoxinas de un componente
desechable, debe haber conocimiento de los métodos usados para determinar el resultado de prueba reportado. A continuación
se muestran dos ejemplos de certificados de análisis:
• Si se recibe un envío de tubos de dilución de un proveedor que está etiquetado como “no pirogénico”, ¿qué significa
realmente? ¿Se analizaron pirógenos en el lote utilizando una prueba de pirógenos en conejos o una prueba de activación
de monocitos validada? ¿Se analizó utilizando el capítulo á85ñ estándar? De ser así, ¿a qué nivel de endotoxina considera
el proveedor que el material es “no pirogénico”? Es importante preguntar al proveedor cómo se preparó y analizó el
material.
• Si se recibe un envío de tubos de 10 mL de un proveedor con la etiqueta de “<0,5 UE/ml”, ¿qué significa? ¿Con qué
volumen se extrajo el tubo (1, 5 o 10 mL)? Una extracción de 1 mL significaría <0,5 UE/tubo, mientras que una extracción
de 5 mL significaría <2,5 UE/tubo y, una de 10 mL, significaría <5 UE/tubo. El laboratorio debe consultar al proveedor el
5
método de extracción de endotoxinas del tubo, así como las condiciones de la prueba de endotoxinas bacterianas que se
utilizaron para obtener el resultado.
Un método predeterminado para confirmar el resultado del certificado de análisis es tratar el desechable de plástico como
si fuera un dispositivo médico y proceder según la metodología proporcionada en Dispositivos Médicos—Pruebas de Endotoxinas
Bacterianas y Pirógenos á161ñ. Aunque en el capítulo á161ñ se define el límite de endotoxinas para dispositivos médicos como
<20 UE/dispositivo, es posible que un laboratorio considere redefinir los límites para desechables utilizados en la prueba con la
finalidad de que el valor sea menor que el valor para la prueba más sensible usada en el laboratorio. Por ejemplo, si el laboratorio
está usando tubos de poliestireno estériles para dilución de la muestra, y la prueba más sensible es una prueba cromogénica
cinética con λ = 0,05 UE/mL, se debe considerar establecer un límite lo suficientemente bajo para evitar interferencias en todos
los métodos de prueba.
De igual forma, algunos materiales pueden contener sustancias extraíbles o lixiviables que pueden inhibir la prueba de
endotoxinas bacterianas-LAL. El control positivo del producto indicará si el uso normal o de rutina de los plásticos produce
alguna sustancia inhibidora lixiviable. Si un laboratorio considera utilizar envases de plástico desechables, como por ejemplo
poliestireno estéril, para el almacenamiento a largo plazo de materiales que finalmente serán analizados, se sugiere que se
realicen análisis para confirmar que no existen factores inhibidores o potenciadores que pudieran afectar la exactitud de la
prueba.
Calificación de Analistas
La capacitación general en laboratorio de analistas constituye un requisito de las buenas prácticas de laboratorio y de las
buenas prácticas de fabricación vigentes (BPF) (Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico á1117ñ). Típicamente, la
capacitación para realizar cualquier prueba de endotoxina bacteriana involucra la demostración de competencia adecuada tanto
en la preparación de la muestra como en los métodos de valoración. Se sugiere que la capacitación se divida en dos partes:
l
1. La capacitación presencial provista por un experto en la materia desarrolla un conocimiento de los principios y
limitaciones de los métodos de prueba, así como de los efectos de la técnica del analista sobre el resultado de la prueba.
ia
Las diferencias entre analistas en la exactitud y precisión para ejecutar tareas de laboratorio básicas tales como pipetear,
pesar materias primas y hacer diluciones pueden introducir sesgos. Debido a la variabilidad intrínseca de los reactivos
(lisado y endotoxina estándar de control) usados rutinariamente en el laboratorio, las técnicas precarias o faltas de
uniformidad pueden afectar de manera significativa la exactitud de los resultados de prueba. Los analistas deben volver a
recibir capacitación si se introduce un nuevo método de prueba en el laboratorio (p. ej., un cambio en procedimientos
fic
de laboratorio de una prueba de coagulación a una cinética).
2. Se debe confirmar la efectividad de la capacitación demostrando la capacidad del analista para realizar la prueba. La
formación para mejorar capacidades o competencias se puede dividir en dos partes:
A. Para pruebas farmacopeicas que requieran confirmación de la sensibilidad de la prueba, se recomienda que una
parte de la formación para mejorar competencias siga lo dispuesto en Prueba de Endotoxinas Bacterianas á85ñ,
Técnica de Coagulación, Pruebas Preparatorias o Técnicas Fotométricas Cuantitativas, Pruebas Preparatorias. Para la
técnica de coagulación, esta es la prueba para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y, para pruebas
O
cuantitativas, esto requiere la generación de una curva estándar lineal. Para la capacitación en pruebas
cuantitativas, se recomienda que las determinaciones repetidas para cualquier dilución dada se consideren de
manera individual (no promediada) cuando se calcule el coeficiente de correlación para evaluar la variabilidad en
el estudio de la competencia. Ambas evaluaciones de la competencia requieren que los analistas preparen y diluyan
el Estándar de Referencia de Endotoxina o la endotoxina estándar de control. Si el laboratorio utiliza un sistema
de cartucho con una curva estándar archivada incorporada, se recomienda que el laboratorio conciba otro método
para garantizar que la técnica del analista para preparar y diluir la muestra sea sólida. Esta capacitación para mejorar
la competencia debe ser descrita, justificada e incluida en los procedimientos operativos estándar de la empresa
con el fin de garantizar la uniformidad entre todos los analistas. Aunque existen muchas formas de determinar la
competencia, una posibilidad es pedir al analista que prepare una muestra con un nivel conocido y confirmado
de la actividad de endotoxina y, al final, comparar el resultado con el valor conocido. Si los valores calculados son
incorrectos, esto puede suscitar preocupaciones acerca de la técnica del analista.
B. La segunda parte de la capacitación para mejorar competencias debe ser una capacitación “en el trabajo” en la
que se pida a los analistas que demuestren su capacidad para calcular los límites de endotoxinas, preparar muestras
de conformidad con los resultados de la prueba de aptitud y ejecutar apropiadamente los controles positivos y
negativos de conformidad con las instrucciones específicas del producto y el capítulo á85ñ.
Se debe hacer énfasis en lo siguiente durante la capacitación:
• Es importante que se use una técnica aséptica de laboratorio apropiada de forma que el analista no contamine las muestras,
diluyentes o accesorios utilizados para realizar la prueba.
• Es importante utilizar un mezclador de vórtice u otro método validado (p. ej., someter a ultrasonido para preparar la
muestra) para optimizar la distribución de endotoxinas en las muestras y el estado de agregación de los estándares
purificados en la serie de estándares. Debido a que las formulaciones de endotoxinas estándar de control proporcionadas
en los kits de prueba de LAL son propiedad de un fabricante, es muy recomendable que los analistas sigan las instrucciones
de los fabricantes para el tiempo de mezclado en mezclador de vórtice, tanto para reconstitución del vial de lipopolisacárido
como entre diluciones. Sin embargo, no se recomienda mezclar el lisado en un mezclador de vórtice, pues se pueden
formar burbujas en el reactivo.
• Si se guardan reactivos, asegurarse de que las fechas de “apertura” y de “caducidad” estén claramente indicadas en los
envases primarios y que todo reactivo no utilizado que se guarde siga las instrucciones del fabricante.
• No almacenar diluciones de Estándar de Referencia de Endotoxina o endotoxina estándar de control sin un estudio de
validación que incluya el tipo de vaso y materiales de fabricación, las concentraciones de Estándar de Referencia de
6
Endotoxina o de endotoxina estándar de control que se guardarán, la temperatura de espera y el volumen de las
diluciones a guardar.
• Cuando se lean los resultados de la técnica de coagulación, levantar los tubos uno por vez y girarlos a 180°. Levantar más
de un tubo puede sacudir y disgregar los contenidos. Una vez que el gel se rompe no volverá a formarse y el resultado
puede ser un falso negativo.
• Cuando se inocule una microplaca, tubo o cartucho, debe prestarse atención para evitar la formación de burbujas, pues
estas afectarán la exactitud del resultado de la prueba.
• Cuando se use equipo para calentamiento (p. ej., baños de perlas, baños de agua, lectores de placas), asegurarse de que
el equipo esté calificado.
• Si utiliza un baño de agua para incubación en la técnica de coagulación, cambiar el agua frecuentemente. La frecuencia
recomendada es al menos una vez por semana.
• Debe asegurarse de que todos los pipeteadores mecánicos estén calibrados y usarlos solo dentro del intervalo calibrado.
• Cuando sea posible, usar volúmenes mayores (mililitros) en lugar de volúmenes menores (microlitros) para la dilución,
pues estos últimos aumentan la variabilidad.
• Las curvas estándar para pruebas fotométricas se crean basadas en el logaritmo10 de los tiempos de reacción o iniciación
medidos en función del logaritmo10 de la concentración de endotoxinas. Prestar atención a los tiempos de iniciación de
los estándares para asegurarse de que sean uniformes entre corridas, entre analistas y entre días para una combinación
dada de lote de endotoxina estándar de control y lote de lisado. Ver Análisis de Rutina, Control con Curva Estándar.
• Si se utiliza una prueba de activación de monocitos, asegurarse de que se incluya al menos un control sin endotoxina.
Un analista debe recibir capacitación adicional si un supervisor observa lo siguiente:
• No cumple con los requisitos de la capacitación inicial para mejorar el desempeño.
• Incapacidad frecuente para cumplir con los parámetros de aptitud del sistema, produciendo resultados de prueba inválidos
l
(p. ej., confirmación de la cantidad declarada para la técnica de coagulación, demostración de la linealidad para las pruebas
ia
cuantitativas, incapacidad para garantizar que los controles negativos son no reactivos). Tener en cuenta que la
incapacidad para recuperar el control positivo del producto dentro del intervalo requerido puede ser señal de un problema
con la técnica del analista o un cambio en la formulación o fabricación del producto que cambia el perfil de interferencias
del producto.
• Resultados irregulares para la pendiente y ordenada al origen y para pruebas cuantitativas. Ver Análisis de Rutina, Control
con Curva Estándar.
fic
• Tendencias adversas para resultados de prueba fuera de especificación o fuera de tendencia.
Calibración y Calificación de Equipos e Instrumentación

Toda instrumentación y equipos usados para realizar una prueba de LAL, incluidos (entre otros) pipeteadores mecánicos,
baños de agua, bloques de calentamiento y lectores de placas con incubación, deben ser calificados usando normas científicas
O
adecuadas y siguiendo los protocolos y cronogramas de mantenimiento aprobados. Cuando sea apropiado, se deben redactar
especificaciones de requisitos del usuario (URS, por sus siglas en inglés), así como protocolos e informes de calificación de la
instalación/calificación operativa/calificación del desempeño (IQ/OQ/PQ, por sus siglas en inglés), que deben ser aprobados
finalmente por la unidad de calidad. Ver Calificación de Instrumentos Analíticos á1058ñ para más información. Todo equipo
utilizado para realizar la prueba de endotoxinas bacterianas debe calibrarse y mantenerse adecuadamente en las frecuencias
que se encuentren de conformidad con las recomendaciones del fabricante del equipo. Debido a que las temperaturas de
incubación para la prueba de endotoxinas bacterianas son críticas, se debe evaluar la uniformidad de la distribución de calor
de equipos como, por ejemplo, lectores de placas con incubación, bloques de calentamiento y baños de agua.
Los lectores de tubos o placas con incubación deben indicar las especificaciones de requisitos del usuario, calificación de la
instalación (IQ), calificación operativa (OQ) y calificación del desempeño (PQ). Es muy frecuente que los proveedores de estos
instrumentos provean al laboratorio modelos de IQ/OP/PQ y asistencia práctica que resulten muy útiles para la ejecución de
estos estudios.
Si se usa un horno de calor seco para laboratorio o producción para despirogenizar material de vidrio u otros artículos
termoestables usados en la realización de cualquier prueba de endotoxinas bacterianas, este debe ser validado para garantizar
una exposición de tiempo/temperatura y patrón de carga apropiados (ver Despirogenización por Calor Seco á1228.1ñ para más
información).
El software de computadora debe cumplir con todas las reglamentaciones y normas federales (21 CFR Parte 11 de los Estados
Unidos de América). Debe permitir contraseñas de usuarios individuales y registros de auditoría. Para el control de la calidad se
debe conocer cómo los proveedores del software para PEB han programado sus cálculos. Por ejemplo, si el instrumento informa
un resultado promediado para la valoración de tres muestras individuales analizadas por duplicado, ¿el programa de software
promedió los tiempos de iniciación para obtener el resultado o promedió los resultados duplicados?
Condiciones Ambientales de Laboratorio

Las pruebas de endotoxinas bacterianas se pueden realizar en la mayoría de los laboratorios modernos bajo condiciones
controladas. Es importante usar una técnica aséptica apropiada cuando se preparen y diluyan estándares y se manipulen
muestras. El uso de vestimenta fuera de los requisitos normales para equipo de protección personal de laboratorio no constituye
una preocupación a menos que el producto en análisis requiera consideraciones de seguridad específicas para el analista
debido a toxicidad o infectividad. Los guantes deben estar exentos de talco, pues el talco puede contener niveles significativos
de endotoxinas. Los lectores de placas, baños de agua y bloques de calor seco utilizados para incubación de la muestra deben
colocarse sobre una mesa de laboratorio alejada de conductos de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC),
7
vibración significativa y tráfico de laboratorio que pudieran afectar los resultados de las pruebas. Las condiciones y tiempos de
retención de la muestra se deben determinar y documentar posteriormente, de ser necesario, para garantizar que se puedan
obtener resultados de prueba exactos en el tiempo calificado. Por ejemplo, si el laboratorio recibe Agua para Inyección (API) o
una muestra en proceso, ¿se debe refrigerar o puede permanecer a temperatura ambiente? ¿por cuánto tiempo? Antes del
análisis, se recomienda que el o los envases de muestra primarios se mezclen adecuadamente antes de retirar la(s) alícuota(s)
de prueba para análisis directo o para dilución posterior.
APTITUD DEL MÉTODO
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Farmacéuticos y Productos Biológicos

Una especificación del límite de endotoxinas para un artículo oficial es la cantidad permisible de actividad de endotoxina
que puede estar contenida de forma segura en un producto parenteral de conformidad con el conocimiento y evidencia
experimental actuales (5). El cálculo del límite de endotoxinas para cualquier producto farmacéutico depende de tres variables:
1) la vía de administración, que principalmente define K, el numerador en la fórmula del límite de endotoxinas, 2) la dosis del
producto por kilogramo de peso corporal, y 3) la duración (tiempo) de administración. Esta información puede encontrarse en
el inserto adjunto de un producto farmacéutico aprobado o se puede obtener del grupo de desarrollo del producto para un
producto que esté aún en desarrollo o en las fases iniciales de ensayos clínicos.
Una especificación del límite de endotoxinas se calcula para cada formulación de producto farmacéutico y conjunto de
condiciones de administración de la siguiente forma:
�
l
�
K = umbral de la dosis pirogénica de 5 UE/kg para la mayoría de las vías de administración o 0,2 UE/kg para
M
medicamentos administrados por vía intratecal (ver la Tabla 2)
ia
= dosis máxima recomendada del producto por kilogramo de peso corporal del paciente. Esta dosis se relaciona con
la concentración de ingrediente activo (potencia del ingrediente activo) en la formulación del producto terminado.
Si un producto se infunde o inyecta a un paciente en intervalos frecuentes durante un periodo extenso, entonces
M se basa en la dosis máxima total administrada durante un periodo de una hora. Si la dosis pediátrica por
fic
kilogramo por hora es mayor que la dosis en adultos, debe usarse la dosis pediátrica para el cálculo.
Cuando se calcule la especificación del límite de endotoxinas, el peso corporal se define según la población de pacientes
prevista, que puede ser diferente en términos de regiones geográficas o poblaciones de pacientes. Por ejemplo, se asume que
un adulto promedio en los Estados Unidos pesa 70 kg, mientras que un adulto promedio en Japón, 60 kg (14). Los pacientes
pediátricos pueden pesar 30 kg o menos. Los pesos promedio para niños se pueden encontrar en la página de tablas clínicas
de crecimiento de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) (ver www.cdc.gov/growthcharts/
O
clinical_charts.htm). El factor de peso corporal seleccionado para pacientes pediátricos y de otra categoría especial debe
considerar el peor de los casos, es decir, el peso corporal más bajo en las poblaciones de pacientes objetivo que pueden recibir
la dosis recomendada más alta. También se debe tener consideración especial con respecto a pesos corporales para productos
para uso veterinario. Los productos farmacéuticos para uso veterinario pueden ser administrados a una gama de distintas
especies o subespecies. En general, el animal más pequeño recibirá la dosis más alta por kilogramo. Es muy recomendable que
se consulte el inserto adjunto del producto cuando se establezcan especificaciones del límite de endotoxinas para uso veterinario.
Diferentes vías de administración o tipos de producto, p. ej., productos radiofarmacéuticos u oncológicos administrados por
metro cuadrado de superficie corporal, tienen valores definidos para K en el cálculo del límite de endotoxinas según se describe
en el capítulo á85ñ y posteriores. Cuando el inserto adjunto del producto describa múltiples poblaciones de pacientes,
indicaciones y vías de administración, se sugiere que el laboratorio calcule la especificación del límite para cada administración y
elija la más conservadora como la especificación del límite de endotoxinas para el producto. Se muestra un resumen en la Tabla
2.
Tabla 2. Valores Definidos para K en Términos de Vía de Administración

Vía de Administración K M
Intravenosa (IV) para productos parenterales 5 UE/kg de peso corporal Dosis máxima por kilogramo administrada en 1 hora
IV para productos radiofarmacéuticos 175 UE Volumen de la dosis máxima recomendada
Intratecal (IT) para productos parenterales 0,2 UE/kg de peso corporal Dosis máxima por kilogramo administrada en 1 hora
IT para productos radiofarmacéuticos 14 UE Volumen de la dosis máxima recomendada
Productos parenterales administrados por metro

cuadrado de superficie corporal 100 UE/m2 Dosis máxima por metro cuadrado por hora
Otros inyectables aparte de los IV (intramusculares,

subcutáneos, etc.) 5 UE/kg de peso corporal Dosis máxima por kilogramo administrada en 1 hora
Líquidos intraoculares 0,2 UE/mL (15) —
Dispositivos sólidos para el segmento anterior 0,2 UE/dispositivo (15) —
Productos para irrigación oftálmica 0,5 UE/mL ( á771ñ) —
8
Tabla 2. Valores Definidos para K en Términos de Vía de Administración (continuación)

Vía de Administración K M
Productos farmacéuticos oftálmicos inyectados o im-

—
plantados 2 UE/dosis ( á771ñ)
Algunas monografías USP para productos tienen especificaciones para endotoxinas definidas a una concentración blanco
para el producto administrado. Sin embargo, se deben calcular las especificaciones del límite de endotoxinas para todas las
indicaciones en el inserto adjunto del producto debido a que las indicaciones y administraciones para el producto pueden ser
diferentes a los datos usados para calcular el límite original de la monografía USP. Si el límite más estricto de una empresa es
menor que el límite de la USP, la empresa debe usar el límite de endotoxinas calculado que sea inferior.
Es importante que la especificación del límite de endotoxinas, como atributo de calidad crítico para un nuevo producto, sea
calculada en la fase inicial del desarrollo y monitoreada durante todo el desarrollo y etapas iniciales de ensayos clínicos. Si no
se ha establecido una dosis, el límite debe calcularse basado en la dosis para el peor de los casos (el más alto) que se prevé para
el producto con respecto a la población de pacientes objetivo y la vía de administración. Los límites de endotoxinas de las fases
iniciales pueden cambiar según los cambios en la administración y/o formulación antes de la comercialización.
Importancia de los Límites para Preparaciones Magistrales Estériles

Cuando las farmacias de preparaciones magistrales estériles preparan tratamientos para inyección o infusión, se debe prestar
mucha atención para evitar la adición de endotoxinas a las preparaciones. Las farmacias de preparaciones magistrales solamente
deben usar materiales que entren en contacto con el producto que hayan despirogenado in situ o que hayan recibido estériles y
exentos de endotoxinas detectables (ver Selección y Calificación de Insumos: Requisitos Farmacopeicos anteriormente en este
l
capítulo). Cuando se utilicen diluyentes o soluciones intravenosas (IV) para preparar un producto destinado a administración
por vía IV, IM, intraocular o intratecal (IT), los diluyentes deben adquirirse comercialmente y deben cumplir los límites
ia
farmacopeicos, que son frecuentemente 0,5 UE/mL. Si el diluyente requerido no es un artículo con una monografía USP, este
debe producirse para cumplir el límite farmacopeico de 0,5 UE/mL. Si el diluyente requerido se va a utilizar para administración
intratecal, es fundamental que el laboratorio garantice que el diluyente más el producto farmacéutico no exceden el límite de
endotoxinas más estricto para administración intratecal.
fic
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Sustancias Activas y Excipientes
El control de los niveles de endotoxinas en excipientes y sustancias activas puede minimizar el riesgo de contaminación del
producto farmacéutico terminado. Los proveedores y fabricantes de medicamentos deben realizar evaluaciones del riesgo de
estas sustancias basadas en el origen de las materias primas, métodos de producción, muestreo y análisis representativo, y
condiciones de almacenamiento. Por ejemplo, los materiales de origen natural, tales como azúcares, heparinas y enzimas,
pueden contener niveles significativos de endotoxinas y/o glucanos. Los proveedores de estos materiales deben ser auditados o
O
estrictamente evaluados para garantizar el control de la biocarga y endotoxinas en sus operaciones de fabricación. Si estos
proveedores proporcionan un certificado de análisis para el contenido de endotoxinas o glucano para lotes individuales de
material, la evaluación también debe incluir un análisis de la validez de los métodos de prueba y la exactitud de los resultados
de prueba, así como cualquier historial de análisis.
Se debe considerar usar un bloqueante de glucanos para productos o materiales que puedan contener glucanos además de
endotoxinas. Los bloqueantes de glucanos se utilizan para garantizar que todas las pruebas sean específicas para endotoxinas,
evitando que haya reacción falsa positiva de la prueba a los glucanos. Debido a que los productos no tienen especificaciones
para glucanos, los reactivos bloqueantes de glucanos son específicos para los métodos de valoración y formulaciones de lisados y
son, en general, ofrecidos por los fabricantes del lisado empleado como reactivo. Debido a que los reactivos bloqueantes de
glucanos se utilizan de diferentes formas, se recomienda que los laboratorios sigan las instrucciones del fabricante de reactivo
para el uso de estos reactivos.
Si se analizan materiales o artículos no oficiales y son liberados por la empresa de manera interna, los límites de endotoxinas
deben ser asignados después de un conocimiento exhaustivo de su potencial contribución a la formulación. Trabajando de
modo retroactivo a partir de la especificación para endotoxinas calculada para el producto farmacéutico, los límites se pueden
asignar a cada componente individual en la formulación con la garantía de que el límite para el producto farmacéutico no se
vería excedido si cada componente estuviera en su límite. Si se utiliza el mismo componente en múltiples formulaciones, se
debe usar el límite menor para evaluar y liberar ese componente.
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Combinados

Un producto combinado se define como un producto compuesto por dos o más componentes regulados (es decir, producto
farmacéutico/dispositivo, producto biológico/dispositivo, producto farmacéutico/producto biológico o producto farmacéutico/
dispositivo/producto biológico) que se combinan o mezclan físicamente, químicamente o de otra manera, y que se producen
como una sola entidad. También se define como dos o más productos individuales que se empacan juntos en un solo envase o
como una unidad y que están conformados por producto farmacéutico y dispositivo, dispositivo y producto biológico o
producto farmacéutico y producto biológico (16,17). Típicamente, estos productos pueden ser dos o más componentes
regulados que se presentan como un único producto (p. ej., jeringa prellenada), o un kit donde dos o más productos regulados
se envasan para ser usados en conjunto como un único producto (p. ej., un medicamento liofilizado envasado con un diluyente y
una jeringa). Aunque un fabricante puede proponer y justificar límites únicos para revisión en las presentaciones reglamentarias,
se deben considerar algunos puntos generales:
9
• Si el producto combinado es una combinación de producto farmacéutico/dispositivo, tal como una jeringa prellenada, la
jeringa prellenada puede ser analizada como una unidad llena y prevalece el límite de endotoxinas para el producto
farmacéutico. Se asume que cualquier endotoxina que provenga del envase (dispositivo) eluye con el producto
farmacéutico durante la preparación de la muestra y, por ello, se contabiliza en las endotoxinas valorables del producto.
• Si el producto combinado consta de dos medicamentos que serán administrados simultáneamente [IV o intramuscular
(IM)], entonces el contenido de endotoxinas de la dosis combinada no puede exceder el límite de endotoxinas para
medicamentos de 5 UE/kg/hora para administraciones IV o IM o de 0,2 UE/kg/hora para administración IT.
• Si el producto combinado es un kit que incluye múltiples componentes que serán administrados como un único producto
(p. ej., un producto liofilizado/diluyente/jeringa), entonces el contenido de endotoxinas de la dosis combinada no puede
exceder el límite de endotoxinas para medicamentos de 5 UE/kg/hora para administraciones IV o IM o de 0,2 UE/kg/hora
para administración IT.
Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Dispositivos Médicos

En el capítulo á161ñ se asigna el límite de endotoxinas para dispositivos médicos como 20 UE/dispositivo, a excepción de los
dispositivos médicos que entren en contacto con el líquido cefalorraquídeo, que tienen un límite asignado de 2,15 UE/
dispositivo. Los dispositivos que tengan contacto con el segmento anterior del ojo no deben exceder el límite de 0,2 UE/mL o
de 0,2 UE/dispositivo, según corresponda. La medición de endotoxinas no se realiza directamente dentro o sobre la matriz
sólida de dispositivos médicos, sino que el dispositivo se enjuaga, empapa o extrae en un volumen apropiado de disolvente (en
general, Agua para Inyección) y se analizan los extractos. En algunos casos se combinan los extractos de varios dispositivos para
análisis. Como resultado, el límite de endotoxinas para un extracto de un dispositivo se expresa en UE/mL, que luego puede
ser convertido matemáticamente a UE/dispositivo. El límite de endotoxinas para un extracto es inversamente proporcional al
volumen de disolvente usado para la extracción. La relación es:
l
�×�
N
ia
Límite de endotoxinas = �
= donde el límite de endotoxinas por dispositivo (20 UE a menos que se defina o justifique algo diferente; 2,15 UE/
dispositivo para dispositivos IT)
= número de dispositivos representado en el combinado
fic
V = volumen total de disolvente usado para extraer los dispositivos
Por ejemplo, si el laboratorio analiza 10 dispositivos IT, cada uno con un volumen de extracción de 50 mL, la especificación
para el límite de endotoxinas para el extracto combinado es:
K×N 2,15 UE/dispositivo × 10 dispositivos
Límite de endotoxinas = = 500 mL
= 0,04 UE/mL
V
O
[NOTA—Aunque los componentes del envase primario, tales como viales o tapones, pueden ser analizados usando las técnicas
descritas en el capítulo á161ñ, estos no se consideran dispositivos médicos. El laboratorio debe asignar límites de endotoxinas
para estos componentes, que son mucho menores que los límites para dispositivos médicos estándar, pero apropiados para la
formulación y presentación del producto farmacéutico. Igualmente, algunos dispositivos médicos son líquidos (p. ej., líquido
para diálisis) o sólidos (p. ej., una enzima). Para estos productos, el límite de endotoxinas se calcula o asigna y analiza como si
el dispositivo fuese un medicamento.]
Máxima Dilución Válida

A medida que las interferencias asociadas al producto se diluyen, también lo hará cualquier endotoxina en la muestra. Por
ello, se incluye un cálculo llamado MDV en el capítulo oficial para definir el límite superior de la dilución permisible del producto.
La MDV depende del límite de endotoxinas para el producto, la concentración inicial del producto (en general, la concentración
del ingrediente activo), y la sensibilidad del método de prueba. La MDV se define como:
Límite de endotoxinas × Concentración del producto
MDV =
λ
donde:
• El límite de endotoxinas es el límite calculado para el producto o dispositivo.
• La concentración del producto es igual a la concentración del ingrediente activo en unidades por mililitro. Para aquellos
productos administrados sobre la base de mililitro por kilogramo o para extractos de dispositivos médicos, la concentración
del producto es igual a 1.
• λ = la sensibilidad confirmada de la cantidad declarada para la técnica de coagulación o la concentración más baja en la
curva estándar de referencia para pruebas cuantitativas
Como información adicional sobre la MDV se incluye:
• El límite de endotoxinas es constante para cualquier formulación/dosis/administración dada.
• La MDV está directamente relacionada con la concentración inicial de ingrediente activo y, mientras más alta sea la
concentración inicial, mayor será la MDV.
• La MDV está inversamente relacionada con el valor numérico dado para la sensibilidad del método de prueba. Mientras
más sensible sea la prueba (λ como denominador en la fórmula de MDV disminuye), mayor será la MDV. Cambiar la
10
sensibilidad de la prueba a un número menor (prueba más sensible) permitirá que se puedan agregar diluciones adicionales
para productos interferentes.
• Las unidades en la fórmula se anulan. El valor calculado resultante es un factor de dilución sin unidades. Por ejemplo, una
MDV de 100 significa que, para tener una prueba válida, la dilución máxima para la concentración del producto no puede
ser más de 1:100.
• La MDV no limita la dilución necesaria del producto cuando se determina la cantidad verdadera de contaminación del
producto en una muestra que no cumple con el límite de endotoxinas. Cuando un producto no cumple en la MDV, no
cumple con el requisito del límite de endotoxinas. En este caso, se recomienda que el laboratorio determine el contenido
total de endotoxinas bacterianas en ese producto por dilución hasta extinción (una prueba negativa para la técnica de
coagulación y una lectura válida en la curva estándar cuantitativa). El nivel real de contaminación con endotoxinas en el
producto puede ser de mucha utilidad para fines de investigación de tendencias y para determinar la causa fundamental
de la contaminación durante la investigación de resultados fuera de especificación.
Prueba de Aptitud del Método

DETECCIÓN DE INTERFERENCIAS PARA PRODUCTOS FARMACÉUTICOS, INCLUIDOS PRODUCTOS BIOLÓGICOS
Los principios y prácticas para realizar pruebas de inhibición/potenciación se proporcionan en el capítulo á85ñ, Técnica de
Coagulación, Pruebas Preparatorias, Prueba para Factores de Interferencia u á85ñ, Técnicas Fotométricas Cuantitativas, Pruebas
Preparatorias, Prueba para Factores de Interferencia. Aunque históricamente las pruebas de aptitud que utilizan tres lotes
consecutivos de producto farmacéutico se consideraron suficientes para evaluar la aptitud, se recomienda que se determine
prospectivamente un número apropiado de lotes de producto para el análisis de aptitud con el fin de permitir una evaluación
válida del potencial de variabilidad en el contenido de endotoxinas entre lotes. Esto es especialmente importante para productos
l
biológicos o productos cuyo desarrollo y validación del proceso han indicado significativa variabilidad entre lotes. Los productos
con mayor variabilidad en su material de partida, IFA y proceso de fabricación típicamente necesitarán más de tres lotes para
ia
pruebas de aptitud, mientras que para productos sin ninguna o con poca variabilidad en el producto o proceso, tres lotes
pueden ser suficientes. El número de lotes analizados para determinar la aptitud debe ser respaldado por una evaluación del
riesgo que incluya información sobre la etapa del ciclo de vida del producto (clínica/comercial), fuentes conocidas de
variabilidad e historial de análisis del material que pueda respaldar un número mayor o menor de lotes que se elijan para la
prueba de aptitud. Todos los materiales que se están analizando mediante los métodos descritos en el capítulo á85ñ , incluidos
fic
excipientes y materias primas, deben tener un estudio de aptitud para garantizar que cualquier interferencia y variabilidad sea
identificada, mitigada (de ser necesario) y tomada en cuenta en los procedimientos de prueba.
INTERFERENCIAS COMUNES DE LA PRUEBA

Se ha encontrado que la mayoría de productos farmacéuticos interfiere en cierto grado con el desempeño de las pruebas de
endotoxinas bacterianas (18). Debido a la alta sensibilidad del ensayo, estas interferencias específicas para el producto pueden
O
usualmente resolverse por dilución en Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas [ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas
á85ñ, Reactivos y Soluciones de Prueba, Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)], sin exceder la MDV específica para el
producto. Las interferencias pueden afectar ya sea la cascada enzimática de la propia reacción de LAL o el analito usado como
control positivo del producto (p. ej., lipopolisacárido purificado), estándar, o ambos. En la Tabla 3 se muestra un listado de
interferencias comunes y mitigaciones que pueden considerarse e implementarse más allá de la sola dilución (19). Cuando se
utilizan soluciones amortiguadoras o disolventes para dilución diferentes a Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas, estos
deben estar exentos de endotoxinas detectables.
Tabla 3. Interferencias Comunes y Mitigaciones

Interferencia Interfiere con Mitigación
Dilución en Agua para PEB
Ajustar el pH del producto con ácido clorhídrico,
hidróxido de sodio o dilución en solución amorti-
guadora de Tris de forma que el lisado más la mues-
tra se encuentren dentro del intervalo óptimo es-
pH Cascada de LAL pecificado por el fabricante del lisado.
La dilución en Agua para PEB es usualmente sufi-

Osmolaridad Cascada de LAL ciente.
Dilución en Agua para PEB

Cascada de LAL Agregar una solución amortiguadora que contenga
Agentes quelantes Agregación de LPS iones de magnesio.
Usar un bloqueante de glucanos suministrado por el

Glucano Cascada de LAL fabricante del reactivo.
Interferencia con proteína inespecífica (p. ej., pro- Dilución en Agua para PEB
teasas de serina) Cascada de LAL Dilución en Agua para PEB combinada con calor.
Dilución en Agua para PEB o diluyentes que conten-

Cascada de LAL gan agente quelante ácido etilendiaminotetraacé-
Metales pesados Agregación de LPS tico (EDTA) 1 mM.
Cascada de LAL Dilución en Agua para PEB o solución fisiológica

Proteínas Agregación de LPS Dilución en Agua para PEB combinada con calor.
11
Tabla 3. Interferencias Comunes y Mitigaciones (continuación)

Interferencia Interfiere con Mitigación
Cascada de LAL La dilución en Agua para PEB es usualmente sufi-
Contenido elevado de detergente Agregación de LPS ciente.
Dilución en Agua para PEB o diluyentes que conten-

Catión de calcio Cascada de LAL gan agente quelante EDTA 1 mM.
La mayoría de las interferencias de la prueba pueden resolverse por dilución simple. La dilución puede hacerse en Agua para
Prueba de Endotoxinas Bacterianas, soluciones amortiguadoras (p. ej., Tris o HEPES), soluciones amortiguadoras que contengan
agentes bloqueantes de glucanos y soluciones amortiguadoras que contengan cationes divalentes o agentes quelantes, según
sea necesario. Se pueden agregar agentes dispersantes a diluyentes para mitigar adicionalmente las interferencias, y típicamente
se considera su valor como aditivos durante el desarrollo del método. Cabe destacar que la interferencia por glucanos es una
interferencia común en algunos productos biológicos. Cuando sea probable que exista interferencia por glucanos, se debe
considerar el uso de un bloqueante de glucanos durante el desarrollo del método de prueba de aptitud del ensayo. Se deben
verificar los diluyentes diferentes al Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas y soluciones amortiguadoras comunes
descritas anteriormente para garantizar que no interfieran con la prueba de endotoxinas bacterianas. Por ejemplo, algunos
agentes neutralizantes (p. ej., proteinasa K) pueden no ser fabricados con controles apropiados contra su contaminación con
bacterias Gram-negativas. Si se utilizan estos reactivos, deben verificarse para garantizar que no contengan endotoxinas en
niveles que puedan contribuir a los niveles finalmente informados para el producto. Todas las pruebas de endotoxinas
bacterianas deben realizarse a pH neutro. Un pH neutro en pruebas de endotoxinas bacterianas se define en general como 6,0-
8,0, pero debido a que todos los lisados tienen diferentes formulaciones, el laboratorio debe confirmar el intervalo adecuado
tal como se describe en el inserto adjunto del fabricante del lisado. Sin embargo, el propio reactivo puede proporcionar
l
capacidad de amortiguación, de modo que se debe evaluar el pH de la mezcla de lisado y la dilución del producto durante el
estudio de aptitud. Se puede ajustar el pH hasta neutro mediante el uso de soluciones amortiguadoras como diluyentes, ácido
ia
clorhídrico (HCl) o hidróxido de sodio (NaOH) exentos de endotoxinas. Si se debe ajustar el pH usando ácidos o bases, se
sugiere que se mida el pH durante el estudio de aptitud para evaluar la variación entre lotes en el producto.
Los lisados de diferentes fabricantes tienen diferentes formulaciones patentadas y todas ellas se calibran para la sensibilidad
frente a un Estándar de Referencia de Endotoxina para garantizar que todas detectan igualmente bien la actividad del
lipopolisacárido en agua. Sin embargo, la actividad del lipopolisacárido puede no recuperarse igualmente en productos
diferentes o usando diferentes métodos de prueba oficiales. Si existe interferencia significativa específica para el producto que
fic
no pueda resolverse por dilución hasta la MDV o mediante metodologías de mitigación estándares (Tabla 3), el laboratorio
debe considerar una formulación de lisado o método de prueba diferentes antes de concluir que la prueba de endotoxinas
bacterianas-LAL es inválida o inadecuada (20).
Calificación de Métodos de Preparación de Prueba Diferentes a la Dilución

Para una preparación de la muestra que requiera manipulación además de dilución simple, p. ej., calentamiento o
O
ultrafiltración, el capítulo á85ñ indica al analista que proceda de la siguiente manera:

La interferencia puede resolverse mediante tratamiento adecuado, tal como filtración, neutralización, diálisis o
calentamiento. Para establecer que el tratamiento elegido elimina efectivamente la interferencia sin pérdida de
endotoxinas, realizar la prueba descrita anteriormente usando la preparación a ser examinada a la cual se ha agregado
Estándar de Endotoxinas y que ha sido luego sometida al tratamiento elegido.
ANÁLISIS DE RUTINA
Muestreo
Todos los materiales usados para muestrear materiales para contenido de endotoxinas (cucharas, pipetas, botellas) deben
ser inertes con respecto al o los materiales que se están muestreando, y deben ser estériles y exentos de endotoxinas detectables.
Aunque con frecuencia las muestras se toman in situ sin la ayuda de una campana de flujo laminar, quienes tomen las muestras
deben tener precaución a) para no contaminar la propia muestra y b) para que al tomar la muestra, no contaminen el resto del
material en su envase original.
Históricamente, el esquema de obtención de muestras para productos farmacéuticos terminados consiste en tomar al menos
3 unidades que representen el inicio, el medio y el final de la partida. Sin embargo, para un análisis estándar de un producto
parenteral de pequeño volumen, tratamiento biológico o producto parenteral de gran volumen, 3 unidades pueden no ser una
muestra representativa y pueden identificar solo aquellos lotes que están uniforme y altamente contaminados. Se deben justificar
los esquemas de obtención de muestras y se deben basar en la variabilidad conocida del proceso, las operaciones unitarias del
proceso, el conocimiento histórico del proceso y los materiales usados en la fabricación.
Las bacterias y endotoxinas en general no se distribuyen homogéneamente en ningún producto o material, líquido o polvo.
Se debe prestar atención al purgar puertos en un circuito de agua circulante antes del muestreo y se debe usar para el muestreo
el mismo equipo que se usa para la fabricación con el fin de garantizar una muestra representativa. Por ejemplo, si se adjunta
una manguera a un puerto con el fin de transferir agua desde un circuito circulante hasta otro vaso de formulación, la muestra
de agua debe tomarse de la misma manguera con los mismos tiempos de purga que los utilizados en la fabricación. De este
modo, mientras que el agua dentro de un circuito apropiadamente controlado y construido puede, en teoría, ser homogénea,
las diferencias en los puertos a lo largo del circuito de distribución pueden adicionar endotoxinas a las muestras.
12
Para materiales altamente viscosos, se puede utilizar una varilla inerte adecuada exenta de endotoxinas detectables para
mezclar el material antes del muestreo. Se utilizan espátulas y cucharas estériles exentas de pirógenos para sólidos en polvo o
granulados. Debido a la falta de garantía de la homogeneidad, se debe determinar el número de muestras de materiales
viscosos y polvos en relación con el número de unidades inicialmente recibido usando procedimientos estadísticos apropiados.
En especial para muestras de materiales viscosos y en polvo, los encargados del muestreo deben recibir capacitación sobre
cómo detectar signos de no uniformidad. Tales indicadores pueden incluir diferencias de forma, tamaño o color o indicios de
humedad en materiales en polvo. Para materiales viscosos, los encargados del muestreo deben recibir capacitación sobre cómo
identificar estratificación del material, diferencias de viscosidad o colores y contaminación con partículas. Las muestras de
materias primas que pudieran mostrar variabilidad en el contenido de endotoxinas no deben combinarse (ver Combinación).
En el caso de un nuevo proveedor de una materia prima, se debe revisar la metodología y cálculos usados para determinar
el contenido de endotoxinas del material. Si el material está designado como crítico para la fabricación, se puede solicitar hacer
una auditoría del sitio del proveedor. Asimismo, se sugiere ampliamente que se realice una confirmación interna de la exactitud
del nivel de endotoxinas declarado en el certificado de análisis. Para materiales críticos, el contrato de calidad debe exigir a los
fabricantes de estos materiales que informen al fabricante de productos farmacéuticos de cambios en procesos, controles o
materias primas de modo que se puedan analizar los cambios en el control de cambios y se pueda determinar la necesidad de
reconfirmación de materiales. Una vez que los certificados de análisis han sido confirmados satisfactoriamente para un número
predeterminado de envíos justificado en el plan de muestreo basado en el historial, y dependiendo de la variabilidad del proceso
de fabricación, el laboratorio puede considerar aceptar el certificado de análisis con pruebas periódicas de los materiales
entrantes, siempre que la fabricación de los materiales no haya cambiado.
Combinación
El término “combinación” (pooling) hace referencia a la creación de una preparación de muestra compuesta que incluye los
l
contenidos totales de varias unidades individuales o alícuotas iguales de unidades tomadas a partir del mismo lote o partida.
Con frecuencia, la combinación se hace para pruebas de liberación de partidas. La combinación es una opción adecuada para
ia
laboratorios que realizan cualquier prueba de endotoxinas bacterianas en productos farmacéuticos (9). Sin embargo, la
combinación presenta varias desventajas, la más obvia es que diluirá endotoxinas que pueden estar en cualquiera de las
unidades, potencialmente ocultando la variabilidad en el contenido y distribución de endotoxinas entre las unidades que fueron
combinadas. Los planes de muestreo, incluidas las instrucciones para combinar muestras, deben estar científicamente
justificados.
fic
Si las unidades se combinan, la MDV debe ser ajustada para considerar la posibilidad de que las endotoxinas se encuentren
en solo una de las muestras (9). La MDV ajustada se calcula dividiendo la MDV originalmente calculada entre el número de
unidades usadas para la combinación. Por ejemplo, si la MDV para un producto parenteral de pequeño volumen es 240 y un
fabricante elige combinar tres viales para la prueba, la MDV ajustada es 240/3, que es 80. Esta reducción de la MDV reduce
efectivamente el límite de endotoxinas para el producto en un factor de tres para compensar por la combinación. Si bien la
combinación puede dar lugar a ahorros incrementales en el uso de reactivos y, de esta forma, a ahorro de algo de dinero,
existen muchos puntos que deben considerarse cuando se hagan combinaciones:
O
• La combinación puede ocultar cualquier no uniformidad en el contenido de endotoxinas entre las unidades de muestra
individuales. La información sobre la variabilidad puede ser valiosa para la resolución de problemas o investigaciones. Por
ejemplo, la contaminación aleatoria en una de múltiples agujas de llenado puede hacer que algunos viales contengan
endotoxinas y otros no.
• La toma de alícuotas de muestras para combinación siempre debe hacerse utilizando técnicas asépticas y con unidades
individuales vigorosamente mezcladas antes de retirar las alícuotas. Los envases originales con producto remanente deben
guardarse para investigación en caso de que haya un resultado de prueba fuera de especificación. Se aconseja retirar la
alícuota a través de un tapón de goma desinfectado usando una jeringa exenta de pirógenos para mantener la integridad
del envase unitario durante el almacenamiento posterior para pruebas de investigación.
• El concepto de MDV ajustada no es aplicable a dispositivos médicos, pues estos, por convención, con frecuencia se
combinan para análisis.
• Cualquier esquema de obtención de muestras para productos farmacéuticos debe representar el inicio, el medio y el final
de la partida. Se pueden tomar muestras adicionales si intervenciones en la fabricación plantean problemas sobre posible
contaminación con endotoxinas.
• Si el análisis en la MDV ajustada ocasiona un incremento inaceptable de la interferencia específica para el producto, las
muestras deben analizarse de manera individual.
• Los productos con MDV calculadas bajas o las suspensiones en las que no se garantice la homogeneidad de las alícuotas
retiradas pueden no ser buenos candidatos para la combinación.
• No es adecuado hacer combinaciones de muestras en proceso, en particular de aquellas que representen diferentes etapas
de la fabricación.
Cálculo del Contenido de Endotoxinas

Todos los resultados de pruebas de endotoxinas bacterianas se proporcionan en UE/mL. Si el producto que está siendo
analizado tiene un límite expresado en UE por unidad de peso o actividad (p. ej., UE/mg), se debe hacer un cálculo para convertir
UE/mL a UE/mg. Por ejemplo, se determina mediante la técnica de coagulación que el contenido de endotoxinas para un
producto con una concentración inicial de 10 mg/mL, tras ajuste por un factor de dilución, es 5 UE/mL. El contenido de
endotoxinas expresado en UE/mg es:
(5 UE/mL) ÷ (10 mg/mL) = 0,5 UE/mg
13
Resultados Fuera de Especificación y Consideraciones de Reanálisis

Los resultados de la prueba de endotoxinas que no cumplan con las especificaciones del producto deben ser investigados
(21). El resultado dudoso se considera válido a menos que una investigación exhaustiva demuestre claramente lo contrario.
Sin embargo, las pruebas inválidas no constituyen resultados fuera de especificación. Las pruebas inválidas son aquellas cuyos
parámetros de aptitud del sistema tales como controles negativos, controles positivos del producto, confirmación de la cantidad
declarada en la técnica de coagulación o generación de una curva estándar lineal, no funcionan como se prevé y, por ello,
pueden afectar la exactitud de los resultados de la prueba. Aunque se debe registrar y establecer la tendencia de pruebas
inválidas en busca de patrones y tendencias que podrían requerir una acción correctiva, solo existe un verdadero incumplimiento
de la prueba por resultados fuera de especificación cuando se haya realizado un ensayo válido y se obtengan resultados que
excedan la especificación.
El hallazgo de un resultado de prueba no conforme requiere una evaluación de laboratorio para garantizar la exactitud de
los datos. La guía para la industria de la FDA para resultados fuera de especificación la define como una investigación de fase I
(21). A pesar de que es infrecuente que no se cumpla una prueba de endotoxinas bacterianas, se debe hacer la investigación
de manera oportuna para averiguar si existe algo atípico sobre esta muestra, su preparación, cálculos o desempeño de la prueba,
que pueda afectar la exactitud del resultado de la prueba. La fase I debe incluir una revisión crítica y exhaustiva de los métodos y
técnicas de muestreo, condiciones de retención de la muestra, preparación de la muestra, parámetros del método de prueba y
cualquier documentación, incluidas anotaciones en tiempo real de errores de análisis por analistas y una revisión para identificar
cualquier error en los cálculos. Una herramienta organizativa, tal como un análisis por árbol de fallas (FTA, por sus siglas en
inglés) o diagrama de Ishikawa (espina de pescado), puede ayudar a que los miembros del equipo organicen sus ideas y
completen la investigación de manera oportuna y de conformidad.
El uso de un enfoque con lista de verificación promoverá la completitud y consistencia entre todas las evaluaciones.
El objetivo de la investigación de laboratorio en fase I es confirmar la exactitud del resultado de la prueba original. Una lista
l
de verificación de la fase I debe incluir lo siguiente, como mínimo:
• Historial de análisis del material en ensayo: ¿Se ha observado previamente un problema específico para el ensayo o
incumplimiento repetido para el mismo producto?
ia
• Procedimientos de toma de muestra, integridad del recipiente de muestra y preparación de la muestra: ¿Se tomaron,
transportaron y almacenaron correctamente las muestras siguiendo los métodos aprobados?
• Preparación, almacenamiento y uso de reactivos.
• Estado de calibración y mantenimiento de instrumentación para dispensación, incubación y lectura.
fic
• Adecuación del equipo y desechables que entran en contacto con la muestra.
• Procedimiento de prueba: ¿Es consistente con los datos de aptitud y se siguió de manera precisa?
• ¿Se encontraron todos los controles y otros indicadores de aptitud del sistema dentro de los límites normales? De no ser
así, entonces la prueba no tiene resultados fuera de especificación y es inválida.
• ¿Se realizaron correctamente todos los cálculos (límites de endotoxinas del producto, MDV y niveles de contaminación
con endotoxinas)? ¿Se realizaron todas las transcripciones de manera exacta?
O
• ¿Se capacitó adecuadamente al analista? ¿Cuáles son los antecedentes del analista con respecto a resultados fuera de
especificación?
Un procedimiento operativo estándar (POE) aprobado para una prueba de endotoxinas bacterianas debe incluir dos
instrucciones importantes para los analistas:
1. Si un analista se da cuenta y documenta que se ha cometido un error durante el análisis que pudiera afectar la exactitud
de los resultados de prueba, incluido un error en el cálculo, preparación de la muestra, dilución o desempeño del ensayo,
la prueba debe detenerse y se debe documentar el motivo de su terminación en el momento en que se identificó el error.
2. Los analistas no deben descartar la muestra original, ninguno de los tubos de dilución para preparación de la muestra,
ni los reactivos usados hasta que se conozcan los resultados de la prueba y se evalúen frente a las especificaciones del
producto. Los tubos y reactivos de una prueba con resultados fuera de especificación pueden ser parte importante de la
investigación de laboratorio.
Si no se encuentra falla analítica o error de documentación, el resultado se considera válido y el producto se encuentra fuera
de especificación. Por otro lado, si se realizó el análisis incorrectamente y el o los errores documentados son la causa fundamental
de la falla, el ensayo inicial es inválido y el producto puede ser analizado nuevamente con controles apropiados.
La investigación de prácticas de producción, conocidas de otra forma como investigaciones en fase II, requiere evaluación
de todas las actividades de fabricación que pudieran haber afectado el contenido de endotoxinas de la muestra de producto
que no cumplió. Puede resultar más fácil que la fase II sea realizada por un equipo multidisciplinario que incluya operaciones,
instalaciones e ingeniería, con ayuda de un microbiólogo para identificar fuentes potenciales de contaminación relativas a
requisitos de control de la contaminación durante la fabricación.
La investigación en fase II es en realidad una reevaluación del control de proceso validado, en particular si la falla no fue la
primera falla para el producto. Un producto fabricado bajo control no debería incumplir la prueba de endotoxinas, de modo
que la investigación en fase II debe centrarse en cualquier aspecto que pueda haber sido diferente para el lote en cuestión.
En cualquier punto de la investigación se puede realizar pruebas para verificar las hipótesis con respecto al motivo por el cual
el material no cumplió con su límite. Sin embargo, es importante observar que estas pruebas de investigación no se consideran
reanálisis y no deben usarse para liberar el material. Por el contrario, se usan para identificar condiciones que podrían haber
contribuido a una inexactitud en las pruebas del producto. También debe redactarse un POE o política de laboratorio que
describa con precisión el o los procedimientos que deben seguirse para fines de pruebas de investigación. Tal plan elimina
decisiones situacionales con respecto a la adecuación de la prueba de investigación, reanálisis o nueva toma de muestra. El plan
debe ser aprobado por la unidad de calidad.
La prueba de investigación debe estar bien definida y justificada, preaprobada y bien documentada. Si en una segunda
prueba de investigación de la preparación de la muestra original se encuentra que el producto cumple las especificaciones de
14
la prueba, es posible que se haya cometido un error en algún aspecto de la ejecución del ensayo original o, igualmente posible,
en la ejecución de la segunda prueba. Si este es el caso, se debe proponer cualquier posible hipótesis y se debe ejecutar pruebas
para confirmar que se cometió un error. El objetivo previsto de las pruebas de investigación en la muestra no es revertir el
resultado original de fuera de especificación, sino obtener información sobre un incumplimiento potencial de modo que pueda
hacerse un esfuerzo más eficaz para identificar el problema e implementar cualquier acción correctiva y preventiva necesaria.
La declaración en el capítulo á85ñ que indica “En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose en la
prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del producto en análisis” ha sido
ampliamente malinterpretada y es pertinente solo en el caso específico de un resultado conflictivo entre una agencia reguladora
que usa la técnica de coagulación para pruebas de liberación de lote y un laboratorio de análisis que usa una plataforma diferente
para análisis de endotoxinas bacterianas-LAL. No es la intención permitir que un laboratorio utilice la técnica de coagulación
para proporcionar resultados que indiquen cumplimiento cuando el método de prueba habitual del laboratorio para el producto
muestra un resultado de prueba fuera de especificación.
Si el producto no cumple con la especificación, se debe determinar el nivel total de actividad de endotoxinas en la o las
muestras que no cumplieron. Para pruebas de coagulación, esto puede suponer análisis de diluciones más allá de la MDV hasta
que se alcance un punto final para la técnica de coagulación o se obtenga un resultado de prueba válido para pruebas
cuantitativas. Estos valores pueden proporcionar pistas sobre la fuente, potencial o real, de contaminación del producto, un
caso de mala manipulación de un control positivo o confusión y mezcla de los tubos.
Control con Curva Estándar

Las curvas estándar se crean para ensayos cromogénicos de punto final evaluando la relación directa entre la intensidad del
color y la concentración del estándar. La curva resultante tiene una pendiente positiva, y el capítulo á85ñ indica que el coeficiente
de correlación de la curva debe ser ≥0,980.
l
La curva estándar se crea graficando el logaritmo10 del tiempo de iniciación o reacción requerido para cada estándar para
alcanzar una densidad óptica predeterminada para valoraciones turbidimétricas cinéticas o una intensidad de color
ia
predeterminada para pruebas cromogénicas cinéticas, en función del logaritmo10 de la concentración estándar. Esta
transformación de los datos origina una curva estándar con una pendiente negativa, y el coeficiente de correlación debe ser ≤
−0,980. Por ello, se puede establecer que el requisito de linealidad para todas las PEB cuantitativas oficiales es |r| ≥0,980. El
requisito se expresa hasta tres cifras significativas porque el último “0” es importante. Es inadecuado tener una curva estándar
con |r| = 0,979 y hacer el redondeo. Sin embargo, en un laboratorio adecuadamente controlado, los coeficientes de correlación
fic
deben ser normalmente mayores a 0,980.
Todas las curvas estándar tienen una ecuación lineal correspondiente y = mx + b donde m es la pendiente de la línea de
regresión de la curva estándar y b es la ordenada al origen y. Debido a que la ordenada al origen y es el punto donde x = 0, y
debido a que en una prueba cinética el logaritmo10 de 1 es 0, la ordenada al origen y se encuentra realmente en el estándar de
1 UE. Debido a la transformación de datos a logaritmo10, las curvas estándar para pruebas cuantitativas pueden ser muy
sensibles a pequeños cambios en los tiempos de iniciación.
La exactitud de los resultados de la prueba depende de la exactitud de la curva estándar. Por ello, se deben monitorear los
O
tiempos de iniciación para los estándares que representen combinaciones únicas de lote de lisado y lote de endotoxina estándar
de control entre distintos análisis, entre instrumentos y entre analistas. Por ejemplo, un analista puede cometer un error de
dilución al medio o al 10% en la dilución de estándares y aun así elaborar una curva estándar lineal que cumpla con el requisito
|r| ≥0,980. El error de dilución no se identificaría observando solo el coeficiente de correlación, sino que sería evidente en los
tiempos de iniciación de los estándares. Un conjunto de estándares demasiado diluido sería más lento (tiempos de iniciación/
reacción más largos) que una serie de estándares adecuadamente diluidos, y un conjunto de estándares muy poco diluidos sería
más rápido (tiempos de iniciación/reacción más cortos) que una serie de estándares adecuadamente diluidos. El error de dilución
también se vería reflejado en los valores generados para la ordenada al origen y. Los cambios en la pendiente también pueden
afectar la exactitud de los datos de prueba. Se sugiera que parte de la capacitación de un analista en el desempeño de ensayos
cuantitativos es comprender el impacto de la variabilidad en la exactitud del resultado de prueba (22,23).
MÉTODOS DE PRUEBA ALTERNATIVOS
Los métodos listados en el capítulo á85ñ para detectar endotoxinas bacterianas (prueba de límite por coagulación, prueba
de coagulación, cromogénica cinética, cromogénica de punto final, turbidimétrica cinética) se consideran validadas. Sin
embargo, un laboratorio puede elegir usar una metodología de prueba que no esté listada en el capítulo á85ñ. Si se toma esta
decisión, la prueba alternativa para detectar endotoxinas bacterianas debe estar completamente validada para garantizar que
las decisiones tomadas usando la metodología alternativa sean equivalentes o mejores que las decisiones tomadas usando los
métodos validados de la USP y aprobados en última instancia por la autoridad reguladora apropiada. Aunque no se cita
específicamente la prueba de endotoxinas, se puede encontrar orientación sobre cómo proceder con respecto a la validación
de métodos alternativos en Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos á1223ñ y Validación del Procedimientos
Farmacopeicos á1225ñ.
GLOSARIO
Endotoxinas Bacterianas: Complejo macromolecular de la membrana externa de bacterias Gram-negativas compuesto
por polisacáridos, lípidos y proteínas. La endotoxina altamente concentrada, extraída y purificada (sin proteína) en general se
denomina lipopolisacárido o LPS para distinguirla de la forma más compleja y natural asociada a la membrana celular (24).
Prueba de endotoxinas bacterianas (PEB): Prueba de endotoxinas bacterianas oficial.
Endotoxina estándar de control (CSE): Preparación con una concentración estable de endotoxinas calibrada frente a
un Estándar de Referencia de Endotoxina (RSE). Las endotoxinas estándar de control en general son preparadas por
15
proveedores o laboratorios y, aunque se denominen "estándares", no están certificadas para pureza o actividad por un tercero.
La mejor descripción de las endotoxinas estándar de control es que son analitos de calibración. Las endotoxinas estándar de
control pueden ser purificadas o pueden ser una preparación de endotoxinas naturales. Si una endotoxina estándar de control
es una preparación que no ha sido ya caracterizada adecuadamente, su evaluación debe incluir parámetros de caracterización
tales como actividad, uniformidad y estabilidad, que demostrarían la aptitud del material para ser usado en la calibración de
una prueba de endotoxinas bacterianas. También deben incluirse procedimientos detallados para su preparación y uso con el
fin de garantizar la uniformidad del desempeño.
Intratecal: Inyección parenteral que provoca que el producto entre en contacto con el líquido cefalorraquídeo.
Lisado o lisado de amebocitos de Limulus (LAL): Reactivo utilizado en la realización de pruebas de endotoxinas
bacterianas.
Parenteral: Productos farmacéuticos o dispositivos médicos que se administran por inyección, infusión, implantación o
que pueden entrar en contacto de otra forma con el torrente circulatorio o líquido cefalorraquídeo.
Estándar de Referencia de Endotoxina (RSE): Estándar primario de endotoxina. El Estándar de Referencia de
Endotoxina es una preparación extraída, purificada y formulada de LPS de E. coli 0113:H10:K.
Aptitud: Demostración de que la prueba elegida es apropiada para su objetivo definido al analizar el material.
REFERENCIAS
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l
ia
fic
O

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Impreso el: jue. may. 11 2023, 07:13:39 a. m.

(EST) Estado: Oficial Vigente al 11-may-2023 DocId: GUID-CC17E1DF-5576-4A86-90EF-78ED081ECB76_3_es-ES

á1085ñ GUÍAS PARA LAS PRUEBAS DE ENDOTOXINAS

ANTECEDENTES: PIRÓGENOS Y ENDOTOXINAS

biofarmacéuticos o dispositivos médicos (10,11).

Estándar de Referencia de Endotoxina (RSE): Calibración de la Endotoxina Estándar de Control

Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando el Método

Σlog puntos finales

Media geométrica del punto final de la serie del RSE en UE/mL

Calibración/Determinación de la Potencia de la Endotoxina Estándar de Control Usando Pruebas

UE/ng = (UE/mL) ÷ (ng/mL)

Determinación de la Actividad para una Endotoxina Estándar de Control Líquida

Selección y Calificación de Insumos: Requisitos Farmacopeicos

Calibración y Calificación de Equipos e Instrumentación

Condiciones Ambientales de Laboratorio

APTITUD DEL MÉTODO

Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Farmacéuticos y Productos Biológicos

Tabla 2. Valores Definidos para K en Términos de Vía de Administración

IV para productos radiofarmacéuticos 175 UE Volumen de la dosis máxima recomendada

IT para productos radiofarmacéuticos 14 UE Volumen de la dosis máxima recomendada

Productos parenterales administrados por metro

Otros inyectables aparte de los IV (intramusculares,

Líquidos intraoculares 0,2 UE/mL (15) —

Dispositivos sólidos para el segmento anterior 0,2 UE/dispositivo (15) —

Productos para irrigación oftálmica 0,5 UE/mL ( á771ñ) —

Tabla 2. Valores Definidos para K en Términos de Vía de Administración (continuación)

Productos farmacéuticos oftálmicos inyectados o im-

Importancia de los Límites para Preparaciones Magistrales Estériles

Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Productos Combinados

Cálculo de los Límites de Endotoxinas para Dispositivos Médicos

Máxima Dilución Válida

Prueba de Aptitud del Método

INTERFERENCIAS COMUNES DE LA PRUEBA

Tabla 3. Interferencias Comunes y Mitigaciones

La dilución en Agua para PEB es usualmente sufi-

Dilución en Agua para PEB

Usar un bloqueante de glucanos suministrado por el

Dilución en Agua para PEB o diluyentes que conten-

Cascada de LAL Dilución en Agua para PEB o solución fisiológica

Tabla 3. Interferencias Comunes y Mitigaciones (continuación)

Dilución en Agua para PEB o diluyentes que conten-

Calificación de Métodos de Preparación de Prueba Diferentes a la Dilución

ultrafiltración, el capítulo á85ñ indica al analista que proceda de la siguiente manera:

Cálculo del Contenido de Endotoxinas

(5 UE/mL) ÷ (10 mg/mL) = 0,5 UE/mg

Resultados Fuera de Especificación y Consideraciones de Reanálisis

Control con Curva Estándar

MÉTODOS DE PRUEBA ALTERNATIVOS

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