TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Tiểu Luận

Tìm Hiểu Về Glutathione

Phan Hoài Nam

nam.ph180351@sis.hust.edu.vn
Ngành Kỹ thuật sinh học
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Quản Lê Hà

Chữ ký của GVHD

Bộ môn: Công nghệ sinh học

Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực

phẩm
HÀ NỘI, 06/2022

1
 Nội dung

1.1. Tổng quan về Glutathione ...................................................................3

1.1.1. Khái niệm .....................................................................................3
1.1.2. Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý: ............................................3
1.2. Chức Năng Trong Cơ Thể Sống ..........................................................5
1.3. Sinh tổng hợp và quá trình sản xuất ....................................................8
1.3.1. Sinh tổng hợp ................................................................................8
1.3.2. Sản xuất Glytathione: .................................................................. 10
1.4. Ứng dụng .......................................................................................... 17
Tài Liệu Tham Khảo ................................................................................ 19

2
 CHƯƠNG 1. Tiểu Luận
Tìm Hiểu Về Glutathione
1.1. Tổng quan về Glutathione
1.1.1. Khái niệm
Glutathione (GSH) hay γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine là một tripeptit
không tham gia vào vai trò cấu trúc nhưng có vai trò chức năng quan trọng
(chống oxi hóa, giải độc tế bào…) với tất cả các sinh vật nhân chuẩn và một
số sinh vật nhân sơ nhờ nhóm sulfhydryl (–SH) của cysteine tham gia vào các
phản ứng khử và liên hợp. Vì thế nó được xếp vào nhóm thiol (R-SH) và là
thiol có khối lượng phân tử thấp. [1]
1.1.2. Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý
1.1.2.1. Cấu trúc hóa học

Hình 1. Cấu trúc hóa học của Glutathione. Nguồn:[4]

Glytathione là một tripeptit cấu tạo từ 3 amino axit là: glutamate, cysteine
và glycine. Giữa glutamate và cysteine là liên kết γ -peptide đặc biệt khiến
GSH không bị phân hủy bởi hầu hết các peptidases. GSH khó bị oxi hóa hơn
các tiền chất của nó là cysteine và γ -glutamylcysteine. [4]

3
1.1.2.2. Tính chất hóa lý

Hình 2. Glutathione tinh thể. Nguồn:[7]

Bảng 1. Tính chất hóa lý của Glutathione. Nguồn: [3]

Công thức chung C10H17N3O6S

Khối lượng mol 307.33 g/mol

Tính chất vật lý Bột rắn màu rắn

Nhiệt độ nóng chảy 195°C

Độ hòa tan trong nước 292.5 mg/mL

Độ hòa tan trong dung môi hữu cơ không tan

4
1.2. Chức năng trong cơ thể sống
Trong tế bào GSH tồn tại dưới 2 dạng là dạng bị khử thiol (thiol-reduced)
(GSH) và dạng bị oxi hóa disulfide (disulfide-oxidized) hay glutathione
disulfide (GSSG). Trong đó dạng GSH là chủ yếu (hơn 98%). [5]

Hình 3. Cấu trúc hóa học của Glutathione (GSH) và Glutathione disulfide
(GSSH). Nguồn: Internet
Trong tế bào sinh vật nhân thực, hầu hết (80–85%) GSH của tế bào nằm
trong tế bào chất; 10–15% nằm trong ty thể và một tỷ lệ nhỏ nằm trong màng
lưới nội chất. [5]

5
 Hình 4. Một số chắc năng chính của GSH trong tế bào. Nguồn: [1]

GSH phục vụ một số chức năng quan trọng bao gồm [5]:
- Chống oxy hóa;
- Giải độc xenobiotics và / hoặc các chất chuyển hóa của chúng;
- Điều chỉnh sự tiến triển của chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis;
- Lưu trữ và giải phóng cysteine;
- Duy trì tiềm năng oxy hóa khử;
- Coenzyme;
- Điều chỉnh chức năng miễn dịch.
Trong số các chức năng trên, chức năng chống oxi hoá sẽ được nói rõ hơn
trong bài tiểu luận này.

6
 Hình 5. Chức năng chống oxi hóa của GSH trong tế bào. Nguồn: [5]

Trao đổi chất hiếu khí tạo ra hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 bị khử bởi
GSH với sự xúc tác chuyển hóa bởi enzyme GSH peroxidase (GPx) trong bào
tương và ty thể để tạo thành H2O và GSSG, và bởi catalase trong peroxisome.
GSSG có thể được khử trở lại GSH bởi GSSG reductase (GR) với proton
H+ của NADPH, do đó hình thành một chu trình oxy hóa khử.
Các peroxit hữu cơ (ROOH) có thể bị khử bằng GPx hoặc GSH S-
transferase (GST).
GSH cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu oxy hóa
khử protein.
Trong quá trình oxy hóa, dư lượng cysteine của protein có thể bị oxy hóa
thành axit sulfenic (Prot-SOH), có thể phản ứng với GSH để tạo thành protein
hỗn hợp disulfua Prot-SSG (glutathionyl hóa), do đó có thể bị khử trở lại Prot-
SH thông qua glutaredoxin (Grx) hoặc sulfiredoxin (Srx). Đây là một cơ chế

7
để bảo vệ các thiols protein nhạy cảm khỏi quá trình oxy hóa không thể đảo
ngược và cũng có thể dùng để ngăn ngừa mất GSH trong các điều kiện oxy
hóa. Khả năng chuyển GSSG thành GSH của tế bào có thể bị gián đoạn do
quá trình tổn thương oxy hóa, dẫn đến tích tụ GSSG. Để ngăn chặn sự thay
đổi cân bằng oxy hóa khử, GSSG có thể được vận chuyển tích cực ra khỏi tế
bào hoặc phản ứng với protein sulfhydryl (Prot-SH) để tạo thành disulfide hỗn
hợp (Prot-SSG).
Các gốc tự do trong tế bào cũng được loại bỏ bởi phương trình:
GSH + R- → 0,5 GSSG + RH
Thiếu hụt trong cơ thể người có thể dẫn đến một số bệnh lý như [1]:
- Suy giảm miễn dịch gây ra một số bệnh như: HIV, viêm gan C, viên
loét đại tràng, xơ phổi…
- Tiểu đường type II;
- Ung thư.

1.3. Sinh tổng hợp và quá trình sản xuất

1.3.1. Sinh tổng hợp
Quá trình sinh tổng hợp Glutathiol gồm hai bước cần năng lượng từ ATP
và sự xúc tác của enzyme [4].
Bước 1 (phản ứng 1): Kết hợp giữa glytamate và cysteine để tạo ra γ -

glutamylcysteine. Quá trình này được xúc tác bởi enzyme glutamate cysteine
ligase (GCL) hay còn được gọi là γ -glutamylcysteine synthetase. Enzyme sẽ
sử dụng năng lượng ATP để hình thành liên kết amide giữa nhóm γ-carboxyl
của glutamate và nhóm amin của cysteine.

8
 Bước 2 (phản ứng 2): enzyme glutathione synthetase xúc tác cho phản ứng
thêm glycine vào γ -glutamylcysteine để tạo ra GSH và cũng cần sử dụng năng
lượng ATP.

Hình 6. Sơ đồ quá trình tổng hợp GSH trong tế bào. Nguồn:[4]

Quá trình này xảy ra bên trong tế bào. Khi cần chuyển GSH từ tế bào này
sang tế bào khác GSH phải bị phân cắt bởi enzyme γ -glutamyl transpeptidase
thường có mặt và cố định trên màng tế bào tạo ra glutamate và
cysteinylglycine. Sau đó dipeptit cysteinylglycine sẽ bị phân cắt bởi bất kỳ
peptidase nào để tạo ra cysteine và glycine. Sau đó, glutamate, cysteine và
glycine được di chuyển đến tế bào nhận bởi các chất vận chuyển axit amin cụ
thể và được sử dụng để sinh tổng hợp GSH [4].

9
 1.3.2. Sản xuất Glytathione
1.3.2.1. Quá trình sản xuất truyền thống [8]
Harington và Mead đã mô tả quá trình tổng hợp hóa học của GSH vào năm
1935, quá trình này đã được thương mại hóa vào những năm 1950. Tuy nhiên,
vì chỉ có dạng L phù hợp về mặt sinh lý nên các phương pháp thay thế để sản
xuất GSH là nhu cầu tất yếu.
Sự phát hiện quá trình sinh tổng hợp tự nhiên GSH của Bloch (1949), con
đường được mở ra cho việc sản xuất GSH bằng enzym và vi sinh vật.

10
1.3.2.2. Quá trình sản xuất bằng enzyme
Sơ đồ quá trình sản xuất GSH bằng enzyme [7]:

Quá trình tổng hợp bằng enzyme là quá trình rất giống quá trình tổng hợp
tự nhiên, hứa hẹn năng suất cao vì chỉ cần các nguyên liệu tối thiểu như amino
axit, enzyme và ATP, điều này giúp đơn giản hóa quá trình tinh chế [8].
Tuy nhiên cho đến nay việc chuyển sang quy mô sản xuất công nghiệp vẫn
chưa thực hiện được do sản xuất ATP rất tốn kém và thiếu các hệ thống tái
tạo ATP hiệu quả. Tuy nhiên, sự tổng hợp enzym của GSH trở lại như một
chủ đề nghiên cứu (ví dụ: Chen và cộng sự 2013; Li và cộng sự 2010). Một
công bố gần đây của Zhang et al. (2017) cho thấy kết quả đầy hứa hẹn là 8,76

11
g / L GSH trong 5 giờ bằng cách sử dụng glutathione synthetase đa chức năng
của Streptococcus sanguinis và hệ thống tái tạo polyphosphat ATP ở quy mô
1 mL [8].
1.3.2.3. Quá trình sản xuất bằng VSV

Hình 8. Qúa trình sinh tổng hợp GSH trong nấm men.
Nguồn: [8]
Hiện nay các loại VSV để sản xuất GSH ở quy mô công nghiệp là các loài
nấm men, đặc biệt là hai giống là Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae
[8].
Ở các chủng hoang dã của hai giống này, nồng độ GSH đã khá cao, dao
động trong khoảng 0.1-1% trọng lượng khô. Ưu điểm của phương pháp lên
men nhờ nấm men là khả năng phát triển và tăng mật độ tế bào nhanh với môi
trường lên men thông thường rẻ tiền. Do nhu cầu sản xuất công nghiệp này
càng cao do ứng dụng rộng rãi của GSH, người ta đã lai tạo và đang cải biến
các chủng nấm men bằng kỹ thuật di truyền như [9]:
- Lai tạo các chủng nấm men;

12
 Hình 9. Lai các bào tử nấm men đơn bôi (n) bằng các vi thao tác. Nguồn: [9]

Hình 10. Lai các dòng đơn tính nảy mầm từ bào tử. Nguồn: [9]
- Gây đột biến ngẫu nhiên bằng tác nhân: vật lý (tia UV, tia tử ngoại…);
hóa học (EMS, NMU, NEU…) và sinh học như: virut…
- Sử dụng kỹ thuật gen:

13
 Hình 11. Sử dụng kỹ thuật gen tạo chủng tái tổ hợp. Nguồn: [9]
- Sử dụng kỹ thuật tiến hóa:

Hình 12. Sử dụng điều kiện chọn lọc khắc nghiệt với tế bào sinh dưỡng hoặc bào tử để chọn
lọc. Nguồn: [9]
Việc cải biến nấm men bằng kỹ thuật tiến hóa, còn được gọi là “sự tiến hóa
có định hướng trong phòng thí nghiệm” là một cách tiếp cận được sử dụng
rộng rãi dựa trên cơ chế chọn lọc tự nhiên. Kỹ thuật được thực hiện thông qua
việc áp dụng có kiểm soát áp lực chọn lọc lên quần thể VSV, để chon ra các
chủng tiến hóa với các kiểu hình cụ thể. Điểm mạnh của chiến lược này là
không cần thực hiền kỹ thuật di truyền phức tạp và tránh được mác sản phẩm
từ sinh vật biến đổi gen (GMO)

14
 Khi đã có chủng VSV người ta lên men và thu hồi, tinh sạch sản phẩm theo
sơ đồ sau [7]:

Chủng, phương pháp cấp dưỡng, nguồn cơ chất như hình sau [8]:

15
Hình 13. Các chủng VSV sản xuất Glutathione và chiến lược cấp dưỡng

16
 Sau khi có sinh khối nấm men ta tiến hành thu hồi và tinh sach sản phẩm,
dựa theo tài liệu [10]:
Bước 1: Dịch sau lên men được ly tâm ở tốc độ 3000-5000rpm trong thời
gian 5-10 phút để tách sinh khối nấm men.
Bước 2: Phá tế bào bằng nước nóng: 1 phần sinh khối nấm men được trộn
cùng 6-10 phần nước sôi, khuấy trộn ở tốc độ 300-350rpm, khi nhiệt độ chiết
xuất đạt 85-90°C ủ trong 10-15 phút. Sau đó làm mát chiết xuất đến nhiệt độ
phòng.
Bước 3: Ly tâm dịch chiết xuất 3000-5000rpm trong thời gian 5-10 phút
loại bỏ xác nấm men, thu dịch có chứa GSH;
Bước 4: Điều chỉnh độ pH bằng cách thêm axit vào dịch sau ly tâm đến pH
từ 2.5-3.5 để kết tủa một số tạp chất, ổn định GSH và chống oxi hóa.
Bước 5: Vi lọc với kích thước lỗ màng 0.1-1 µm thu dịch lọc;
Bước 6: Sắc ký trao đổi Ion, sử dụng nhựa cationit Zeo-karb, giải hấp phụ
thị được dịch lỏng giàu GSH;
Bước 7: Hấp thụ một lần nữa trên chất hấp phụ cao phân tử (polymeric
adsorbent separates), rửa bằng nước tinh khiết thu được dịch GSH độ tinh
khiết cao;
Bước 8: cô đặc chân không với áp suất chân không 0,098Mpa và nhiệt độ
55 - 65°C, hàm lượng GSH thu được có thể lên tới 400 mg/ml;
Bước 9: kết tinh bằng các thêm Virahol or ethanol cho đến khi nồng độ
dung môi đạt 60-80%, nhiệt độ kết tinh từ 0-4°C, pH: 2.90 - 3;
Bước 10: rửa tinh thể với acetone 70-90%
Bước 11: sấy chân không với áp suất 0,098Mpa và nhiệt độ 55 - 65°C.

1.4. Ứng dụng

Mỗi năm có hơn 200 tấn GSH tinh thể nguyên chất được sản xuất trên thế
giới. Doanh thu hằng năm trên toàn thế giới của các sản phẩm nấm men có
chứa GSH và GSH được sản xuất và tinh chế từ nấm men vượt mốc 9 tỷ USD
vào năm 2019 [8].

17
 Dưới đây là bảng một số ứng dụng của GSH trong một số ngành công
nghiệp [8]:

Hình 14. Ứng dụng của Glutathione trong một số sản phẩm

18
 1.5. Tài Liệu Tham Khảo
[1] Mary E. Anderson (1998). Glutathione: an overview of biosynthesis and
modulation. Chemico-Biological Interactions 111–112 (1998) 1–14.
[2] HELMUT SIES (1999). GLUTATHIONE AND ITS ROLE IN
CELLULAR FUNCTIONS. Free Radical Biology & Medicine, Vol. 27,
Nos. 9/10, pp. 916–921, 1999.
[3] PubChem. Glutathione. Wedsite: Glutathione | C10H17N3O6S -
PubChem (nih.gov)
[4] Henry Jay Forman *, Hongqiao Zhang, Alessandra Rinna (2009).
Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and
biosynthesis. Molecular Aspects of Medicine 30 (2009) 1–12
[5] Shelly C. Lu (2013). Glutathione synthesis. Biochimica et Biophysica
Acta 1830 (2013) 3143-3153
[6] Alfonso Pompella*, Athanase Visvikisa, Aldo Paolicchib, Vincenzo De
Tatab, Alessandro F. Casinib (2003). The changing faces of glutathione, a
cellular protagonist. Biochemical Pharmacology 66 (2003) 1499–1503.
[7] SAHIR HERB Co.,Ltd. Knowledge: What’s Glutathione? Glutathione
Production Process. Wedsite: What’s Glutathione? Glutathione Production
Process - News - Xi’an Sahir Herb Co., Ltd
[8] Maximilian Schmacht, Eric Lorenz, Martin Senz (2017). Microbial
production of glutathione. World J Microbiol Biotechnol (2017) 33:106
[9] Luciana De Vero *, Tommaso Bonciani, Alexandra Verspohl, Francesco
Mezzetti and Paolo Giudici (2017). High - glutathione producing yeasts
obtained by genetic improvement strategies: a focus on adaptive evolution
approaches for novel wine strains. AIMS Microbiology, 3(2): 155-170.
[10] Gansu positive yeast Technology Co., Ltd and Tibet Jiekang yeast
Technology Co. Ltd. Patents: Method for producing high-purity glutathione.
China Patent CN101429229A

19